© 2026 Ministério da Agricultura e Pecuária. Todos os direitos reservados. É permitida a reprodução parcial ou total desta obra, desde que citada a fonte e que não seja para venda ou qualquer fim comercial. A responsabilidade pelos direitos autorais de textos e imagens desta obra é do autor.
Ano 2026
Elaboração, distribuição, informações:
Ministério da Agricultura e Pecuária
Secretaria de Defesa Agropecuária - SDA
Departamento de Serviços Técnicos - DTEC
Esplanada dos Ministérios, Bloco D, Anexo, Ala B, 4º andar, sala 433
CEP: 70043-900, Brasília - DF
www.agricultura.gov.br
e- mail: cgal@agro.gov.br
Central de Relacionamento: 0800 704 1995
Equipe Técnica:
Anselmo Vasconcelos Rivetti Júnior
Antônio Augusto Fonseca Júnior
Cairo Henrique Sousa de Oliveira
Carla do Amaral Pinto
Cid Aristóteles de Siqueira Alencar
Fabíola Nascimento Correa
Jonh Aldson Bezerra Tenório
Marcelo Fernandes Camargos
Maria da Glória Trindade
CGAL
|
Macroprocesso: Laboratórios |
Objetivo: Realizar a padronização, harmonização, atualização e a unificação dos procedimentos para execução de ensaios laboratoriais da área de Diagnóstico Animal, destinadas aos laboratórios oficiais e credenciados da Rede Nacional de Laboratórios Agropecuários |
|||
|
Processo: Análises Laboratoriais |
||||
|
Entrega: Segurança e saúde dos animais |
Público alvo e demais interessados: Laboratórios oficiais e credenciados do Ministério da Agricultura e Pecuária (Mapa) |
Versão do documento: 1 |
||
|
Setor responsável e responsabilidades A Coordenação Geral de Laboratórios Agropecuários do Departamento de Serviços Técnicos é responsável pela elaboração, atualização e envio para aprovação deste manual, tendo responsabilidade quanto aos procedimentos descritos no documento. |
||||
Não aplicável.
Não aplicável.
O presente manual possui vigência e prazo indeterminado e será revisado sempre que necessário pela Coordenação Geral de Laboratórios Agropecuários do Departamento de Serviços Técnicos (CGAL/DTEC).
A gestão desse manual está sob a responsabilidade da CGAL/DTEC que prestará auxílio ao público alvo leitor dúvidas e/ou sugestões quanto à aplicação deste manual devem ser submetidas ao Departamento responsável.
A publicação e atualização das versões na plataforma oficial da SDA para acesso pelo público alvo será de responsabilidade da Secretaria representada pelo DTEC.
O objetivo do Manual é reunir os métodos analíticos a serem empregados na execução de ensaios laboratoriais da área de Diagnóstico Animal da Rede Nacional de Laboratórios Agropecuários (Rede LFDA e Laboratórios credenciados junto ao Ministério da Agricultura e Pecuária).
Este capítulo tem por objetivo descrever a metodologia para detecção do material genético do Tilapia parvovivrus (TiPV). O TiPV é um vírus DNA de fita simples pertencente à família Parvoviridae.
O TiPV tem sido associado a mortalidades em espécies de tilápias.
Os tecidos de escolha para o diagnóstico são:
a) Fígado
b) Rim
c) Baço
c) Cérebro
d) Coração
e) Pâncreas
f) Guelras
Nota 1 : Os tecidos devem ser removidos e colocados em microtubos e enviados ao laboratório conforme recomendado em https://www.gov.br/agricultura/pt-br/assuntos/sanidade-animal-e-vegetal/saude-animal/programas-de-saude-animal/sanidade-dos-animais-aquaticos
I – Para atendimento aos Programas e Controles Oficiais do MAPA os laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
II – Deverão ser obedecidos os critérios de verificação de conformidade das amostras estabelecidos no Volume I - REGRAS GERAIS.
III – As amostras deverão ser encaminhadas ao laboratório, individualmente e obedecendo a critérios de biossegurança.
I – O desempenho dos métodos de ensaio deverá ser verificado conforme definições estabelecidas pelo Manual da CGAL para validação de métodos moleculares.
II – Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados.
III – O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos.
Nota 1: Com relação às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos:
I – Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente.
II – Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 e 25ºC.
IV – Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados.
V – O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios.
VI – Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada.
VII – Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório.
Nota 2: A utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitida quando:
I – A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos.
II – As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes.
III – O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
QUADRO 1: Sugestão de oligonucleotídeos para qPCR para detecção molecular do TiPV
|
Oligonucleotídeo |
Tipo de PCR |
Sequência |
Referência |
|
TiPV.121.F |
qPCR |
AGATAAAGACTCAAGCGGGAAG |
LFDA/MG |
|
TiPV.121.R |
ACTATCGGTGGCAGAAAAGG |
||
|
TiPV.121.S |
FAM- CAAGCACAGCAACAGGTGATCGC- BHQ |
||
|
TiPV.NS.124.F |
qPCR
|
AAAGTACCTAAGGCGGAGCG |
Yamkasem et al., 2021 |
|
TiPV.NS.124.R |
TTTCAATCACCTTCCCGCCA |
||
|
TiPV.NS.124.S |
FAM-CCGAAGAGCATAGTGGAGGA-Iowa Black |
Nota 1: Recomenda-se que as soluções estoques de oligonucleotídeos sejam mantidas a uma concentração de 500 µM, a não ser que já venham previamente diluídas. Recomenda-se também, que as soluções de trabalho sejam diluídas a 10 µM.
I – Para a validação do ensaio, o controle positivo deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório; e
II – O controle negativo deve ter Cq indeterminado ou não detectado. O gráfico do controle negativo deve apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
I – Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
II – Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
I – Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
II – O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
I – Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
II – Amostras positivas de qualquer origem devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo elas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
I – Imediatamente após a emissão do resultado poderão ser descartados, registrando-se em formulários próprios e conferidas antes do descarte.
QUADRO 1: Sugestão de oligonucleotídeos para PCR para detecção molecular do TiPV
|
Oligonucleotídeo |
Tipo de PCR |
Sequência |
Referência |
|
TiPV.534.F |
PCR |
GAGATGGTGTGAAAATGAACGGG |
Liu et al., 2020 |
|
TiPV.534.R |
CTATCTCCTCGTTGCTCGGTGTATC |
Nota 1: Recomenda-se que as soluções estoques de oligonucleotídeos sejam mantidas a uma concentração de 500 µM, a não ser que já venham previamente diluídas. Recomenda-se também, que as soluções de trabalho sejam diluídas a 10 µM.
I – Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
II – Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
I – Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
II – O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
I – Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
II – Amostras positivas de qualquer origem devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo elas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
I – Imediatamente após a emissão do resultado poderão ser descartados, registrando-se em formulários próprios e conferidas antes do descarte.
Este capítulo tem por objetivo descrever a metodologia para detecção do material genético do Cyprid Herpesvirus 3 (CyHV-3) ou Koi Herpesvirus (KHV). O CyHV-3 é um vírus DNA de fita dupla pertencente à família Alloherpesviridae, ordem Herpesvirales.
O CyHV-3 infecta todas as variedades e subespécies da carpa comum (Cyprinus carpio) e os híbridos da carpa comum (Exemplo: Cyprinus carpio x Carassius auratus, Cyprinus carpio x Carassius carassius).
Este capítulo tem por objetivo descrever a metodologia para detecção do material genético do Cyprid Herpesvirus 3 (CyHV-3) ou Koi Herpesvirus (KHV). O CyHV-3 é um vírus DNA de fita dupla pertencente à família Alloherpesviridae, ordem Herpesvirales.
Os tecidos de escolha para o diagnóstico são:
a) Guelras
b) Rim
c) Baço
Nota 1 : Os tecidos devem ser removidos e colocados em microtubos e enviados ao laboratório conforme recomendado em https://www.gov.br/agricultura/pt-br/assuntos/sanidade-animal-e-vegetal/saude-animal/programas-de-saude-animal/sanidade-dos-animais-aquaticos
I – Para atendimento aos Programas e Controles Oficiais do MAPA os laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
II – Deverão ser obedecidos os critérios de verificação de conformidade das amostras estabelecidos no Volume I - REGRAS GERAIS.
III – As amostras deverão ser encaminhadas ao laboratório, individualmente e obedecendo a critérios de biossegurança.
I – O desempenho dos métodos de ensaio deverá ser verificado conforme definições estabelecidas pelo Manual da CGAL para validação de métodos moleculares.
II – Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados.
III – O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos.
Nota 1: Com relação às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos:
I – Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente.
II – Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 e 25ºC.
IV – Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados.
V – O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios.
VI – Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada.
VII – Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório.
Nota 2: A utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitida quando:
I – A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos.
II – As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes.
III – O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
QUADRO 1: Sugestão de oligonucleotídeos para qPCR para detecção molecular do CyHV-3
|
Oligonucleotídeo |
Tipo de PCR |
Sequência |
Referência |
|
CyHV-3.78.F (KHV) |
qPCR |
GACGCCGGAGACCTTGTG |
Gilad et al., 2004 |
|
CyHV-3.78.R (KHV) |
CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT |
||
|
CyHV-3.78.S (KHV) |
FAM-CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG-IowaBlack |
Nota 1: Recomenda-se que as soluções estoques de oligonucleotídeos sejam mantidas a uma concentração de 500 µM, a não ser que já venham previamente diluídas. Recomenda-se também, que as soluções de trabalho sejam diluídas a 10 µM.
I – Para a validação do ensaio, o controle positivo deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório; e
II – O controle negativo deve ter Cq indeterminado ou não detectado. O gráfico do controle negativo deve apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
I – Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
II – Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
I – Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
II – O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
I – Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
II – Amostras positivas de qualquer origem devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo elas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
I – Imediatamente após a emissão do resultado poderão ser descartados, registrando-se em formulários próprios e conferidas antes do descarte.
QUADRO 1: Sugestão de oligonucleotídeos para PCR para detecção molecular do CyHV-3
|
Oligonucleotídeo |
Tipo de PCR |
Sequência |
Referência |
|
KHVDV.292.F |
PCR |
GACACCACATCTGCAAGGAG |
Yuasa et al., 2005 |
|
KHVDV.292.R |
GACACATGTTACAATGGTCGC |
Nota 1: Recomenda-se que as soluções estoques de oligonucleotídeos sejam mantidas a uma concentração de 500 µM, a não ser que já venham previamente diluídas. Recomenda-se também, que as soluções de trabalho sejam diluídas a 10 µM.
I – Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
II – Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
I – Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
II – O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
I – Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
II – Amostras positivas de qualquer origem devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo elas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
I – Imediatamente após a emissão do resultado poderão ser descartados, registrando-se em formulários próprios e conferidas antes do descarte.
Este capítulo tem por objetivo descrever a metodologia para detecção do material genético da Francisella noatunensis subespécie orientalis, agente causador do granuloma visceral sistêmica ou franciselose em peixes.
A bactéria pode infectar a tilápia e outros peixes marinhos e de água doce não cultivados no Brasil.
Deve-se enviar fragmentos do:
a) Baço
b) Rim
c) Fígado
Nota 1 : Os tecidos devem ser removidos e colocados em microtubos e enviados ao laboratório conforme recomendado em https://www.gov.br/agricultura/pt-br/assuntos/sanidade-animal-e-vegetal/saude-animal/programas-de-saude-animal/sanidade-dos-animais-aquaticos
I – Para atendimento aos Programas e Controles Oficiais do MAPA os laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
II – Deverão ser obedecidos os critérios de verificação de conformidade das amostras estabelecidos no Volume I - REGRAS GERAIS.
III – As amostras deverão ser encaminhadas ao laboratório, individualmente e obedecendo a critérios de biossegurança.
I – O desempenho dos métodos de ensaio deverá ser verificado conforme definições estabelecidas pelo Manual da CGAL para validação de métodos moleculares.
II – Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados.
III – O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos.
Nota 1: Com relação às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos:
I – Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente.
II – Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 e 25ºC.
IV – Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados.
V – O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios.
VI – Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada.
VII – Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório.
Nota 2: A utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitida quando:
I – A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos.
II – As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes.
III – O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
QUADRO 1: Sugestão de oligonucleotídeos para qPCR para detecção molecular da F. noatunensis ssp. orientalis
|
Oligonucleotídeo |
Tipo de PCR |
Sequência |
Referência |
|
Fno.iglC.88.F |
qPCR |
GGGCGTATCTAAGGATGGTATGAG |
Soto et al., 2010 |
|
Fno.iglC.88.R |
AGCACAGCATACAGGCAAGCTA |
||
|
Fno.iglC.88.S |
FAM-ATCTATTGATGGGCTCACAACTTCACAA-IowBlack |
Nota 1: Recomenda-se que as soluções estoques de oligonucleotídeos sejam mantidas a uma concentração de 500 µM, a não ser que já venham previamente diluídas. Recomenda-se também, que as soluções de trabalho sejam diluídas a 10 µM.
I – Para a validação do ensaio, o controle positivo deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório; e
II – O controle negativo deve ter Cq indeterminado ou não detectado. O gráfico do controle negativo deve apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
I – Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
II – Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
I – Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
II – O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
I – Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
II – Amostras positivas de qualquer origem devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo elas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
I – Imediatamente após a emissão do resultado poderão ser descartados, registrando-se em formulários próprios e conferidas antes do descarte.
QUADRO 1: Sugestão de oligonucleotídeos para PCR para detecção molecular da F. noatunensis ssp. orientalis
|
Oligonucleotídeo |
Tipo de PCR |
Sequência |
Referência |
|
Fno.hypprot.203.F |
PCR |
GGCGTAACTCCTTTTAGCTTCC |
Dong et al., 2016 |
|
Fno.hypprot.203.R |
TTAGAGGAGCTTGGAAAAGCA |
Nota 1: Recomenda-se que as soluções estoques de oligonucleotídeos sejam mantidas a uma concentração de 500 µM, a não ser que já venham previamente diluídas. Recomenda-se também, que as soluções de trabalho sejam diluídas a 10 µM.
I – Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
II – Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
I – Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
II – O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
I – Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
II – Amostras positivas de qualquer origem devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo elas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
I – Imediatamente após a emissão do resultado poderão ser descartados, registrando-se em formulários próprios e conferidas antes do descarte.
Este capítulo tem por objetivo descrever a metodologia para detecção do material genético do Renibacterium salmoninarum (RSAL), agente causador da corinebacteriose (bacterial kidney disease).
O R. salmoninarum é um patógeno de águas frias, e é mais ativo em temperaturas inferiores a 15 ºC. A bactéria pode infectar todo os membros da família Salmonidae.
Devem ser enviados fragmentos do:
a) Rim
b) Fígado
c) Baço
d) Fluido ovariano
Nota 1: Os tecidos devem ser removidos e colocados em microtubos e enviados ao laboratório conforme recomendado em https://www.gov.br/agricultura/pt-br/assuntos/sanidade-animal-e-vegetal/saude-animal/programas-de-saude-animal/sanidade-dos-animais-aquaticos.
I – Para atendimento aos Programas e Controles Oficiais do MAPA os laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
II – Deverão ser obedecidos os critérios de verificação de conformidade das amostras estabelecidos no Volume I - REGRAS GERAIS.
III – As amostras deverão ser encaminhadas ao laboratório, individualmente e obedecendo a critérios de biossegurança.
I – O desempenho dos métodos de ensaio deverá ser verificado conforme definições estabelecidas pelo Manual da CGAL para validação de métodos moleculares.
II – Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados.
III – O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos.
Nota 1: Com relação às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos:
I – Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente.
II – Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 e 25ºC.
IV – Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados.
V – O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios.
VI – Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada.
VII – Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório.
Nota 2: A utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitida quando:
I – A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos.
II – As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes.
III – O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
QUADRO 1: Sugestão de oligonucleotídeos para qPCR para detecção molecular de RSAL
|
Oligonucleotídeo |
Tipo de PCR |
Sequência |
Referência |
|
BKD.msa.77.F |
qPCR |
GTGACCAACACCCAGATATCCA |
CHASE et al., 2006 |
|
BKD.msa.77.R |
TCGCCAGACCACCATTTACC |
||
|
BKD.msa.77.S |
FAM-CACCAGATGGAGCAAC-MGB/NFQ |
Nota 1: Recomenda-se que as soluções estoques de oligonucleotídeos sejam mantidas a uma concentração de 500 µM, a não ser que já venham previamente diluídas. Recomenda-se também, que as soluções de trabalho sejam diluídas a 10 µM.
I – Para a validação do ensaio, o controle positivo deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório; e
II – O controle negativo deve ter Cq indeterminado ou não detectado. O gráfico do controle negativo deve apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
I – Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
II – Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
I – Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
II – O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
I – Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
II – Amostras positivas de qualquer origem devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo elas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
I – Imediatamente após a emissão do resultado poderão ser descartados, registrando-se em formulários próprios e conferidas antes do descarte.
QUADRO 1: Sugestão de oligonucleotídeos para PCR para detecção molecular de RSAL
|
Oligonucleotídeo |
Tipo de PCR |
Sequência |
Referência |
|
BKD.501.F |
PCR |
CAAGGTGAAGGGAATTCTTCCACT |
SANDELL et al., 2011 |
|
BKD.501.R |
GACGGCAATGTCCGTTCCCGGTTT |
Nota 1: Recomenda-se que as soluções estoques de oligonucleotídeos sejam mantidas a uma concentração de 500 µM, a não ser que já venham previamente diluídas. Recomenda-se também, que as soluções de trabalho sejam diluídas a 10 µM.
I – Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
II – Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
I – Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
II – O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
I – Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
II – Amostras positivas de qualquer origem devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo elas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
I – Imediatamente após a emissão do resultado poderão ser descartados, registrando-se em formulários próprios e conferidas antes do descarte.
Este capítulo tem por objetivo descrever a metodologia para detecção do material genético da Edwardsiella ictaluri.
A bactéria pode infectar diversas espécies de peixes, como bagres e peixes ornamentais. Existem relatos da infecção em pangas (Pangasianodon hypophthalmus), pintados e experimentalmente em tilápias.
Devem ser coletadas amostras do:
a) Baço
b) Rim
c) Fígado
Nota 1 : Os tecidos devem ser removidos e colocados em microtubos e enviados ao laboratório conforme recomendado em https://www.gov.br/agricultura/pt-br/assuntos/sanidade-animal-e-vegetal/saude-animal/programas-de-saude-animal/sanidade-dos-animais-aquaticos
I – Para atendimento aos Programas e Controles Oficiais do MAPA os laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
II – Deverão ser obedecidos os critérios de verificação de conformidade das amostras estabelecidos no Volume I - REGRAS GERAIS.
III – As amostras deverão ser encaminhadas ao laboratório, individualmente e obedecendo a critérios de biossegurança.
I – O desempenho dos métodos de ensaio deverá ser verificado conforme definições estabelecidas pelo Manual da CGAL para validação de métodos moleculares.
II – Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados.
III – O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos.
Nota 1: Com relação às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos:
I – Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente.
II – Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 e 25ºC.
IV – Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados.
V – O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios.
VI – Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada.
VII – Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório.
Nota 2: A utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitida quando:
I – A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos.
II – As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes.
III – O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
QUADRO 1: Sugestão de oligonucleotídeos para qPCR para detecção molecular de E. ictaluri
|
Oligonucleotídeo |
Tipo de PCR |
Sequência |
Referência |
|
E.ictaluri.179.F |
qPCR |
ACTTATCGCCCTCGCAAC |
Griffin et al., 2011 |
|
E.ictaluri.179.R |
GCCTCTGATAAGTGGTTCTCG |
||
|
E.ictaluri.179.F |
FAM-CCTCACATATTGCTTCAGCGTCGAC-MGB |
Nota 1: Recomenda-se que as soluções estoques de oligonucleotídeos sejam mantidas a uma concentração de 500 µM, a não ser que já venham previamente diluídas. Recomenda-se também, que as soluções de trabalho sejam diluídas a 10 µM.
I – Para a validação do ensaio, o controle positivo deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório; e
II – O controle negativo deve ter Cq indeterminado ou não detectado. O gráfico do controle negativo deve apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
I – Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
II – Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
I – Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
II – O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
I – Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
II – Amostras positivas de qualquer origem devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo elas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
Este capítulo tem por objetivo descrever a metodologia para detecção do material genético do Streptococcus dysgalactiae.
A bactéria pode infectar diversas espécies de peixes de água doce e marinha, tais como salmão, tainha, dourado, truta marinha e tilápias.
Devem ser coletadas amostras:
a) Rim
b) Fígado
c) Pele
Nota 1 : Os tecidos devem ser removidos e colocados em microtubos e enviados ao laboratório conforme recomendado em https://www.gov.br/agricultura/pt-br/assuntos/sanidade-animal-e-vegetal/saude-animal/programas-de-saude-animal/sanidade-dos-animais-aquaticos
I – Para atendimento aos Programas e Controles Oficiais do MAPA os laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
II – Deverão ser obedecidos os critérios de verificação de conformidade das amostras estabelecidos no Volume I - REGRAS GERAIS.
III – As amostras deverão ser encaminhadas ao laboratório, individualmente e obedecendo a critérios de biossegurança.
I – O desempenho dos métodos de ensaio deverá ser verificado conforme definições estabelecidas pelo Manual da CGAL para validação de métodos moleculares.
II – Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados.
III – O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos.
Nota 1: Com relação às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos:
I – Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente.
II – Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 e 25ºC.
IV – Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados.
V – O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios.
VI – Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada.
VII – Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório.
Nota 2: A utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitida quando:
I – A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos.
II – As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes.
III – O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
QUADRO 1: Sugestão de oligonucleotídeos para qPCR para detecção molecular do S. dysgalactiae
|
Oligonucleotídeo |
Tipo de PCR |
Sequência |
Referência |
|
Strep.dysgal.81.F |
qPCR |
TCCTAATACATCAAGCCATCCAG |
LFDA/MG |
|
Strep.dysgal.81.R |
GTTAGAGCAGCGGTTAGGTC |
||
|
Strep.dysgal.81.S |
Cy5-AAACTGAAGAAAAAGGTTGAAGCCGAGG-IB |
Nota 1: Recomenda-se que as soluções estoques de oligonucleotídeos sejam mantidas a uma concentração de 500 µM, a não ser que já venham previamente diluídas. Recomenda-se também, que as soluções de trabalho sejam diluídas a 10 µM.
I – Para a validação do ensaio, o controle positivo deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório; e
II – O controle negativo deve ter Cq indeterminado ou não detectado. O gráfico do controle negativo deve apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
I – Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
II – Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
I – Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
II – O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
I – Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
II – Amostras positivas de qualquer origem devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo elas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
QUADRO 1: Sugestão de oligonucleotídeos para PCR para detecção molecular do S. dysgalactiae
|
Oligonucleotídeo |
Tipo de PCR |
Sequência |
Referência |
|
Strep.dysgal.459.F |
PCR |
AGAAAGCAGTGAAGTACCTC |
Nishiki et al., 2011 |
|
Strep.dysgal.459.R |
TCTTGACCATCTGACATGGC |
Nota 1: Recomenda-se que as soluções estoques de oligonucleotídeos sejam mantidas a uma concentração de 500 µM, a não ser que já venham previamente diluídas. Recomenda-se também, que as soluções de trabalho sejam diluídas a 10 µM.
I – Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
II – Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
I – Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
II – O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
I – Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
II – Amostras positivas de qualquer origem devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo elas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
Este capítulo tem por objetivo descrever a metodologia para detecção do material genético do Streptococcus agalactiae. S. agalactiae é um patógeno emergente o qual tem sido associado a considerável morbidade e mortalidade em fazendas produtoras de peixes em todo o mundo.
A bactéria pode infectar diversas espécies de peixes como a tilápia, truta arco-íris, tainha e muitas outras. Os Streptococcus do grupo B (GBS), sorotipo III ST283 podem infectar o homem após ingestão de peixe cru e causar doença grave, incluindo sepse e meningite.
Devem ser coletadas amostras do:
a) Cérebro
b) Rim
Nota 1 : Os tecidos devem ser removidos e colocados em microtubos e enviados ao laboratório conforme recomendado em https://www.gov.br/agricultura/pt-br/assuntos/sanidade-animal-e-vegetal/saude-animal/programas-de-saude-animal/sanidade-dos-animais-aquaticos
I – Para atendimento aos Programas e Controles Oficiais do MAPA os laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
II – Deverão ser obedecidos os critérios de verificação de conformidade das amostras estabelecidos no Volume I - REGRAS GERAIS.
III – As amostras deverão ser encaminhadas ao laboratório, individualmente e obedecendo a critérios de biossegurança.
I – O desempenho dos métodos de ensaio deverá ser verificado conforme definições estabelecidas pelo Manual da CGAL para validação de métodos moleculares.
II – Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados.
III – O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos.
Nota 1: Com relação às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos:
I – Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente.
II – Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 e 25ºC.
IV – Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados.
V – O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios.
VI – Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada.
VII – Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório.
Nota 2: A utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitida quando:
I – A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos.
II – As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes.
III – O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
QUADRO 1: Sugestão de oligonucleotídeos para qPCR para detecção molecular do S. agalactiae
|
Oligonucleotídeo |
Tipo de PCR |
Sequência |
Referência |
|
Strep.agal.CAMP.154.F |
qPCR |
AGCTTAGTTATCCCAAATCCCAT |
Sebastião et al., 2015 |
|
Strep.agal.CAMP.154.R |
GTGCCAACCCTGAGACAGTT |
||
|
Strep.agal.CAMP.154.S |
FAM-AAGCCTTAACAGATGTGATTGAAGCA-MGB |
Nota 1: Recomenda-se que as soluções estoques de oligonucleotídeos sejam mantidas a uma concentração de 500 µM, a não ser que já venham previamente diluídas. Recomenda-se também, que as soluções de trabalho sejam diluídas a 10 µM.
I – Para a validação do ensaio, o controle positivo deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório; e
II – O controle negativo deve ter Cq indeterminado ou não detectado. O gráfico do controle negativo deve apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
I – Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
II – Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
I – Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
II – O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
I – Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
II – Amostras positivas de qualquer origem devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo elas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
O objetivo desse documento é descrever metodologia para detecção do material genético do Streptococcus iniae, bactéria que infecta peixes causando meningoencefalite, lesões de pele e septicemia.
A bactéria infecta diversas espécies de peixes, tanto de água doce, quanto salgada, como a tilápia, salmão, truta arco-íris, dourado, tainha, enguia, robalo e esturjão.
As amostras de eleição para o diagnóstico são:
a) Encéfalo
b) Rim
c) Fígado
Nota 1 : Os tecidos devem ser removidos e colocados em microtubos e enviados ao laboratório conforme recomendado em https://www.gov.br/agricultura/pt-br/assuntos/sanidade-animal-e-vegetal/saude-animal/programas-de-saude-animal/sanidade-dos-animais-aquaticos
I – Para atendimento aos Programas e Controles Oficiais do MAPA os laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
II – Deverão ser obedecidos os critérios de verificação de conformidade das amostras estabelecidos no Volume I - REGRAS GERAIS.
III – As amostras deverão ser encaminhadas ao laboratório, individualmente e obedecendo a critérios de biossegurança.
I – O desempenho dos métodos de ensaio deverá ser verificado conforme definições estabelecidas pelo Manual da CGAL para validação de métodos moleculares.
II – Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados.
III – O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos.
Nota 1: Com relação às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos:
I – Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente.
II – Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 e 25ºC.
IV – Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados.
V – O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios.
VI – Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada.
VII – Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório.
Nota 2: A utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitida quando:
I – A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos.
II – As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes.
III – O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
QUADRO 1: Sugestão de oligonucleotídeos para qPCR para detecção molecular do S. iniae
|
Oligonucleotídeo |
Tipo de PCR |
Sequência |
Referência |
|
Strep.iniae.16s.74.F |
qPCR |
GAGGTCAGCGGTTCGATC |
LFDA/MG
|
|
Strep.iniae.16s.74.R |
AATTTTCAATGGACTTCACGTATTTTAG |
||
|
Strep.iniae.16s.74.S |
HEX-ACTTCCTTGTCTATGGAGCCTAGCGG-IB |
Nota 1: Recomenda-se que as soluções estoques de oligonucleotídeos sejam mantidas a uma concentração de 500 µM, a não ser que já venham previamente diluídas. Recomenda-se também, que as soluções de trabalho sejam diluídas a 10 µM.
I – Para a validação do ensaio, o controle positivo deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório; e
II – O controle negativo deve ter Cq indeterminado ou não detectado. O gráfico do controle negativo deve apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
I – Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
II – Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
I – Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
II – O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
I – Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
II – Amostras positivas de qualquer origem devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo elas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
QUADRO 1: Sugestão de oligonucleotídeos para PCR para detecção molecular do S. iniae
|
Oligonucleotídeo |
Tipo de PCR |
Sequência |
Referência |
|
Strep.iniae.16s.297.F |
PCR |
CTAGAGTACACATGTAGCTAAG |
Park et al., 2014 |
|
Strep.iniae.16s.297.R |
GGATTTTCCACTCCCATTAC |
Nota 1: Recomenda-se que as soluções estoques de oligonucleotídeos sejam mantidas a uma concentração de 500 µM, a não ser que já venham previamente diluídas. Recomenda-se também, que as soluções de trabalho sejam diluídas a 10 µM.
I – Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
II – Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
I – Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
II – O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
I – Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
II – Amostras positivas de qualquer origem devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo elas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
O objetivo desse documento é descrever metodologia para detecção do material genético do Lactococcus garviae, bactéria causadora de septicemia em peixes. O microrganismo causa lesões no endotélio vascular, levando a hemorragias e petéquias na superfície dos órgãos internos.
A bactéria pode infectar diversas espécies de peixes, incluindo tilápia, pargo de cauda amarela, enguia-japonesa, truta arco-íris, linguado-oliva, a tainha cinzenta, o bagre, a perca-preta-do-norte e outros. Tem potencial de infectar o homem.
Devem ser coletadas amostras de:
a) Baço
b) Fígado
c) Rim
d) Cérebro
Nota 1 : Os tecidos devem ser removidos e colocados em microtubos e enviados ao laboratório conforme recomendado em https://www.gov.br/agricultura/pt-br/assuntos/sanidade-animal-e-vegetal/saude-animal/programas-de-saude-animal/sanidade-dos-animais-aquaticos
I – Para atendimento aos Programas e Controles Oficiais do MAPA os laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
II – Deverão ser obedecidos os critérios de verificação de conformidade das amostras estabelecidos no Volume I - REGRAS GERAIS.
III – As amostras deverão ser encaminhadas ao laboratório, individualmente e obedecendo a critérios de biossegurança.
I – O desempenho dos métodos de ensaio deverá ser verificado conforme definições estabelecidas pelo Manual da CGAL para validação de métodos moleculares.
II – Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados.
III – O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos.
Nota 1: Com relação às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos:
I – Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente.
II – Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 e 25ºC.
IV – Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados.
V – O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios.
VI – Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada.
VII – Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório.
Nota 2: A utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitida quando:
I – A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos.
II – As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes.
III – O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
QUADRO 1: Sugestão de oligonucleotídeos para qPCR para detecção molecular do L. garviae
|
Oligonucleotídeo |
Tipo de PCR |
Sequência |
Referência |
|
Lgarvieae.16s23sRNA.118.F |
qPCR |
AGATTGCGTTGAGAGAAGGG |
Thanh et al., 2013 |
|
Lgarvieae.16s23sRNA.118.R |
TTCGTTGACCAGATACTTCCG |
||
|
Lgarvieae.16s23sRNA.118.S |
HEX-TCGATCCCGCTAGGCTCCATAAGA-IowaBlack |
Nota 1: Recomenda-se que as soluções estoques de oligonucleotídeos sejam mantidas a uma concentração de 500 µM, a não ser que já venham previamente diluídas. Recomenda-se também, que as soluções de trabalho sejam diluídas a 10 µM.
I – Para a validação do ensaio, o controle positivo deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório; e
II – O controle negativo deve ter Cq indeterminado ou não detectado. O gráfico do controle negativo deve apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
I – Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
II – Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
I – Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
II – O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
I – Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
II – Amostras positivas de qualquer origem devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo elas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
QUADRO 1: Sugestão de oligonucleotídeos para PCR para detecção molecular do L. garviae
|
Oligonucleotídeo |
Tipo de PCR |
Sequência |
Referência |
|
Lgarvieae.16s23sRNA.290.F |
PCR |
ACTTTATTCAGTTTTGAGGGGTCT |
Thanh et al., 2013 |
|
Lgarvieae.16s23sRNA.290.R |
TTTAAAAGAATTCGCAGCTTTACA |
Nota 1: Recomenda-se que as soluções estoques de oligonucleotídeos sejam mantidas a uma concentração de 500 µM, a não ser que já venham previamente diluídas. Recomenda-se também, que as soluções de trabalho sejam diluídas a 10 µM.
I – Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
II – Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
I – Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
II – O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
I – Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
II – Amostras positivas de qualquer origem devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo elas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
O objetivo desse documento é descrever metodologia para detecção do material genético do Flavobacterium psychrophilum, agente da Doença Bacteriana da Água Fria e da Síndrome da Alevinos de Truta Arco-Íris, duas doenças que levam a alta mortalidade.
O patógeno afeta principalmente salmonídeos, como trutas e salmões (truta arco-íris, salmão-prateado e salmão do Atlântico).
As amostras para diagnóstico são:
a) Brânquias
b) Pele
c) Rim
d) Baço
e) Fígado
Nota 1: Os tecidos devem ser removidos e colocados em microtubos e enviados ao laboratório conforme recomendado em https://www.gov.br/agricultura/pt-br/assuntos/sanidade-animal-e-vegetal/saude-animal/programas-de-saude-animal/sanidade-dos-animais-aquaticos
I – Para atendimento aos Programas e Controles Oficiais do MAPA os laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
II – Deverão ser obedecidos os critérios de verificação de conformidade das amostras estabelecidos no Volume I - REGRAS GERAIS.
III – As amostras deverão ser encaminhadas ao laboratório, individualmente e obedecendo a critérios de biossegurança.
I – O desempenho dos métodos de ensaio deverá ser verificado conforme definições estabelecidas pelo Manual da CGAL para validação de métodos moleculares.
II – Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados.
III – O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos.
Nota 1: Com relação às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos:
I – Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente.
II – Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 e 25ºC.
IV – Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados.
V – O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios.
VI – Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada.
VII – Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório.
Nota 2: A utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitida quando:
I – A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos.
II – As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes.
III – O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
QUADRO 1: Sugestão de oligonucleotídeos para qPCR para detecção molecular do F. psychrophilum
|
Oligonucleotídeo |
Tipo de PCR |
Sequência |
Referência |
|
F.psychrophilum.164.F |
qPCR |
GAAGATGGAGAAGGTAATTTAGTTGATATT |
Strepparava et al., 2014 |
|
F.psychrophilum.164.R |
CAAATAACATCTCCTTTTTCTACAACTTGA |
||
|
F.psychrophilum.164.S |
FAM-AAACGGGTATTCTTCTTGCTACA-MGB |
Nota 1: Recomenda-se que as soluções estoques de oligonucleotídeos sejam mantidas a uma concentração de 500 µM, a não ser que já venham previamente diluídas. Recomenda-se também, que as soluções de trabalho sejam diluídas a 10 µM.
I – Para a validação do ensaio, o controle positivo deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório; e
II – O controle negativo deve ter Cq indeterminado ou não detectado. O gráfico do controle negativo deve apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
I – Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
II – Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
I – Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
II – O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
I – Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
II – Amostras positivas de qualquer origem devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo elas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
QUADRO 1: Sugestão de oligonucleotídeos para PCR para detecção molecular do F. psychrophilum
|
Oligonucleotídeo |
Tipo de PCR |
Sequência |
Referência |
|
F.psychrophilum.686.F |
PCR |
CGATCCTACTTGCGTAG |
Strepparava et al., 2014 |
|
F.psychrophilum.686.R |
CGGCCAGATAAGTCAGTGGT |
Nota 1: Recomenda-se que as soluções estoques de oligonucleotídeos sejam mantidas a uma concentração de 500 µM, a não ser que já venham previamente diluídas. Recomenda-se também, que as soluções de trabalho sejam diluídas a 10 µM.
I – Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
II – Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
I – Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
II – O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
I – Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
II – Amostras positivas de qualquer origem devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo elas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
BRASIL. Ministério da Agricultura e Pecuária. Portaria SDA/MAPA nº 1110, de 13 de maio de 2024. Institui diretrizes para publicação e manutenção de manuais técnicos no âmbito da SDA.
TiPV
Liu W, Zhang Y, Ma J, Jiang N, Fan Y, Zhou Y, Cain K, Yi M, Jia K, Wen H, Liu W, Guan W, Zeng L. Determination of a novel parvovirus pathogen associated with massive mortality in adult tilapia. PLoS Pathog. 2020 Sep 24;16(9):e1008765. doi: 10.1371/journal.ppat.1008765. PMID: 32970777; PMCID: PMC7588064.
Yamkasem J, Tattiyapong P, Surachetpong W. Development and application of TaqMan probe-based quantitative PCR assays for the detection of tilapia parvovirus. J Fish Dis. 2022 Mar;45(3):379-386. doi: 10.1111/jfd.13565. Epub 2021 Dec 6. PMID: 34871459.
Cyprid Herpesvirus 3 (CyHV-3) ou Koi Herpesvirus (KHV)
Gilad O, Yun S, Zagmutt-Vergara FJ, Leutenegger CM, Bercovier H, Hedrick RP.Concentrations of a Koi herpesvirus (KHV) in tissues of experimentally infected Cyprinus carpio koi as assessed by real-time TaqMan PCR. Dis Aquat Organ. 2004 Sep 8;60(3):179-87.
Yuasa K, Sano M, Kurita J, Ito T, Iida T (2005). Improvement of a PCR method with the Sph 1–5 primer set for the detection of koi herpesvirus (KHV). Fish Pathol., 40, 37–39.
Francisella noatunensis subespécie orientalis
Dong HT, Gangnonngiw W, Phiwsaiya K, Charoensapsri W, Nguyen VV, Nilsen P, Pradeep PJ, Withyachumnarnkul B, Senapin S, Rodkhum C. Duplex PCR assay and in situ hybridization for detection of Francisella spp. and Francisella noatunensis subsp. orientalis in red tilapia. Dis Aquat Organ. 2016 Jun 15;120(1):39-47.
Soto E, Bowles K, Fernandez D, Hawke JP. Development of a real-time PCR assay for identification and quantification of the fish pathogen Francisella noatunensis subsp. orientalis. Dis Aquat Organ. 2010 Apr 9;89(3):199-207.
RSAL
Chase DM, Elliott DG, Pascho RJ. Detection and quantification of renibacterium salmoninarum dna in salmonid tissues by real-time quantitative polymerase chain reaction analysis. J Vet Diagn Invest. 2006 jul;18(4):375-80. doi: 10.1177/104063870601800409. pmid: 16921877.
Sandell TA, Jacobson KC. Comparison and evaluation of renibacterium salmoninarum quantitative pcr diagnostic assays using field samples of chinook and coho salmon. Dis aquat Organ. 2011;93(2):129-139. doi:10.3354/dao02289.
Edwardsiella ictaluri
Griffin MJ, Mauel MJ, Greenway TE, Khoo LH, Wise DJ. A real-time polymerase chain reaction assay for quantification of Edwardsiella ictaluri in catfish pond water and genetic homogeneity of diagnostic case isolates from Mississippi. J Aquat Anim Health. 2011;23(4):178-188. doi:10.1080/08997659.2011.637006.
Streptococcus dysgalactiae
Nishiki I, Horikiri Y, Itami T, Yoshida T. Cloning and expression of serum opacity factor in fish pathogenic Streptococcus dysgalactiae and its application to discriminate between fish and mammalian isolates. FEMS Microbiol Lett. 2011.
Streptococcus agalactiae
Sebastião Fde A, Lemos EG, Pilarski F. Validation of absolute quantitative real-time PCR for the diagnosis of Streptococcus agalactiae in fish. J Microbiol Methods. 2015 Dec;119:168-75.
Streptococcus iniae
Park SB, Kwon K, Cha IS, Jang HB, Nho SW, Fagutao FF, Kim YK, Yu JE, Jung TS. Development of a multiplex PCR assay to detect Edwardsiella tarda, Streptococcus parauberis and Streptococcus iniae in olive flounder (Paralichthys olivaceus). J Vet Sci. 2014;15(1):163-6.
Lactococcus garviae
Thanh HD, Park HK, Kim W, Shin HS. Development of a 16S-23S rRNA intergenic spacer-based quantitative PCR assay for improved detection and enumeration of Lactococcus garvieae. FEMS Microbiol Lett. 2013 Feb;339(1):10-6 (anexado).
F. psychrophilum
Strepparava N, Wahli T, Segner H, Petrini O. Detection and quantification of Flavobacterium psychrophilum in water and fish tissue samples by quantitative real time PCR. BMC Microbiol. 2014;14:105. Published 2014 Apr 26. doi:10.1186/1471-2180-14-105
As sugestões para aprimoramento ou possíveis correções deste documento devem ser direcionadas ao Departamento responsável, para alinhamento das melhores práticas de mercado, legislação vigente e/ou regulamentações, que não tenham sido contempladas na versão vigente.
| Versão | Conteúdo alterado | Data | Motivo |
|---|---|---|---|
| 1 | - | 24.03.2026 | Elaboração do documento |