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Equipe Técnica:
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| Érica Cardoso Vilela Barbara - (LASO/LFDA-GO) | Maria Paula Domene - (LASO/CATI) |
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| Hiromi S. Y. Sassagawa Sant’Anna - (LASO/LFDA-RS) | Sylvia T. B. de Oliveira Sabino - (LASO/LFDA-PE) |
| Luiz Artur Costa do Valle - (LASO/LFDA-MG) | Vitor Breda Bezerra Rego - (LASO/LFDA-RS) |
| Magda Birck Garcia - (LASO/LFDA-RS) |
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Macroprocesso: Laboratórios |
Objetivo: Definir os métodos oficiais a serem utilizados nas análises para identificação e verificação da qualidade de lotes de sementes a serem comercializados no mercado interno. |
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Processo: Análises de sementes |
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Entrega: Garantia da identidade e qualidade de lotes de sementes |
Público alvo e demais interessados: Laboratórios de análise de sementes credenciados no Renasem |
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Setor responsável e responsabilidades A Coordenação-Geral de Laboratórios Agropecuários – CGAL, vinculada ao Departamento de Serviços Técnicos - DTEC da Secretaria de Defesa Agropecuária – SDA, do Ministério da Agricultura e Pecuária – MAPA é o órgão responsável pela Rede Nacional de Laboratórios Agropecuários do Sistema Unificado de Atenção à Sanidade Agropecuária e possui dentre suas atribuições estabelecer, uniformizar e oficializar métodos para a realização de análises. |
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Este capítulo trata da metodologia do Teste de Tetrazólio para sementes de todas as espécies (inclusive de espécies florestais).
Para Testes de Tetrazólio de sementes revestidas e de misturas de sementes deve-se consultar primeiramente os capítulos específicos destas Regras para Análise de Sementes - RAS (Capítulo 8 e Capítulo 10, respectivamente) e, posteriormente, utilizar esse capítulo no que for aplicável.
O Teste de Tetrazólio é um teste bioquímico que pode ser utilizado quando as sementes precisam ser semeadas logo após a colheita; quando apresentam dormência ou para resolver problemas encontrados no Teste de Germinação, como por exemplo, ocorrência de muitas de plântulas anormais.
Também pode ser usado para avaliar o vigor, a viabilidade das sementes após tratamentos pré-germinativos, danos por secagem, insetos, umidade e mecânicos de colheita ou beneficiamento.
No Teste de Tetrazólio, as sementes são embebidas em uma solução incolor de cloreto ou brometo de 2, 3, 5 trifenil tetrazólio, que é usada como um indicador do processo de redução que ocorre dentro de células vivas.
Neste processo, os íons H+ liberados durante a respiração dos tecidos vivos são transferidos por um grupo de enzimas, mais especificamente, a desidrogenase do ácido málico, que interagem com o tetrazólio, o qual é reduzido a um composto vermelho, estável e não difusível chamado de “trifenil formazan”. Quando esta reação se processa no interior das células vivas, o trifenil formazan não se difunde indicando uma nítida separação dos tecidos vivos e coloridos (que respiram) dos mortos que não se colorem.
O sal de tetrazólio (cloreto ou brometo de 2, 3, 5 trifenil tetrazólio) é usado nas concentrações indicadas no Quadro 5.1. Na execução dos teste, é permitido o seu uso em concentrações mais baixas, desde que isso não prejudique a coloração. Neste caso, se necessário, o tempo de coloração pode ser prolongado.
O sal de tetrazólio deve ser armazenado em ambiente fresco, seco e protegido de luz.
Usar uma solução aquosa de 0,05% a 1,0% de concentração do cloreto ou brometo 2, 3, 5 trifenil de tetrazólio. A concentração da solução pode variar para sementes entre diferentes espécies, conforme indicado no Quadro 5.1.
É recomendável que o pH da solução de tetrazólio esteja entre 6,5 e 7,5. Caso não seja possível obter uma solução com pH dentro da faixa de 6,5 a 7,5 utilizando-se apenas água, o sal de tetrazólio poderá ser dissolvido em uma solução-tampão.
Para produção uma solução de tetrazólio a 1%, diluem-se 10 g do sal de tetrazólio em 1.000 mL de água ou de uma solução-tampão. Para concentrações menores, a solução a 1% pode ser diluída, em água ou em solução-tampão, ou preparada diretamente com o sal de tetrazólio na concentração desejada.
No preparo da solução, o sal de tetrazólio deve ser cuidadosamente pesado e misturado, usando-se um agitador magnético de laboratório, se disponível.
A solução de tetrazólio recém-preparada pode ser armazenada, no escuro, entre 5 e 10 °C por até um ano. Se armazenada por mais tempo, um teste de eficácia deve ser conduzido para provar que a solução ainda é viável.
É recomendado preparar a solução de tetrazólio em solução-tampão de fosfato para atingir a faixa de pH correta. Duas soluções são preparadas com água destilada/deionizada:
Solução 1: dissolver 9,078 g de fosfato de potássio (KH2PO4) em 1.000 mL de água;
Solução 2: dissolver 11,876 g de fosfato monoácido de sódio bihidratado (Na2HPO4.2H2O) em 1.000 mL de água, ou dissolver 9,472 g de Na2HPO4 em 1.000 mL de água.
Misturar duas partes da Solução 1 em três partes da Solução 2 e medir o pH, que deve estar entre 6,5 e 7,5. Para preparar um litro da solução-tampão, misturam-se 400 mL da Solução 1 com 600 mL da Solução 2.
As sementes, geralmente, precisam ser cortadas, furadas ou descascadas. Bisturis afiados, agulhas e pinças podem ser usados para essas atividades. Todos os equipamentos de corte devem estar afiados, caso contrário, danos provocados nas sementes podem dificultar a avaliação do teste.
A preparação de sementes muito duras, como nozes e outros tipos de frutos de espécies arbóreas ou palmeiras, pode exigir alicates de corte, martelos ou até de uma serra para abrir as nozes e um torno para segurá-las com segurança. Óculos de segurança são recomendados ao abrir nozes de árvore e outras sementes ou frutos muito duros.
Os recipientes utilizados devem ser resistentes ao calor e a produtos químicos, além de fáceis de limpar, de preferência com tampa. Podem ser usados pequenos béqueres de vidro com tampas de papel alumínio.
Quando se deseja manter e avaliar simultaneamente as duas metades cortadas de cada semente ou quando as sementes forem poliembriônicas, é possível utilizar placas com poços com a profundidade e as dimensões apropriadas para sementes em análise (Figura 5.11 do Guia e fotos de Testes de Tetrazólio) ou formas de gelo, pois estas possibilitam manter cada semente individualizada. Sementes pequenas e poliembriônicas, a exemplo das de Citrus spp., também podem ser coloridas em microtubos do tipo Eppendorf®.
Para realização do pré-umedecimento, podem ser utilizados diversos equipamentos, como germinadores tipo Mangelsdorf, BODs, estufas e banhos-maria, desde que as condições para o umedecimento sejam adequadas e a temperatura seja mantida na faixa recomendada (temperatura prescrita ±2 °C).
Para a coloração com a solução de tetrazólio, o recipiente de sementes/solução deve ser colocado em um ambiente escuro, com temperatura mantida na faixa recomendada (temperatura prescrita ±2 °C). Pode ser uma incubadora tipo BOD, estufa, banho-maria ou germinador nos quais as sementes possam ser mantidas no escuro. Se houver risco de evaporação ou de redução do nível da solução de tetrazólio, os recipientes devem ser cobertos.
Durante essas duas fases, a temperatura dos equipamentos deve ser monitorada por registradores, termômetros ou termopares digitais que registrem as temperaturas máxima, mínima e atual.
Dependendo do tamanho das sementes e das estruturas que precisam ser observadas, uma lupa de mesa (com iluminação) e, frequentemente, um estereomicroscópio deve ser usado para permitir a preparação precisa (corte, perfuração, descascamento) e/ou avaliação das sementes coloridas pelo tetrazólio. O laboratório deve dispor dos dois equipamentos.
Sementes de gramíneas forrageiras dos gêneros Lolium, Urochloa e similares exigem a utilização de estereomicroscópio para avaliação da coloração.
a) Amostra de Trabalho
Normalmente, o teste é realizado em 200 sementes retiradas ao acaso da porção “Semente Pura” ou de uma amostra representativa da amostra média, com 2 repetições de 100 ou 4 de 50 ou 8 de 25 sementes.
Opcionalmente, o teste pode ser realizado em 400 sementes.
No caso de sementes de espécies florestais com Peso de Mil Sementes igual ou maior do que 1.000 g (número de sementes/kg ≤ 1000), como as sementes de Araucaria angustifolia (Pinheiro-do-Paraná), o teste de tetrazólio pode ser realizado em apenas 100 sementes, com 2 repetições de 50 ou 4 repetições de 25 sementes.
Também pode ser aplicado em sementes individuais que permaneceram dormentes ao final de um Teste de Germinação.
b) Preparo das Sementes antes da Coloração
Para o preparo de sementes revestidas consultar o Capítulo 8 “Análise de sementes revestidas” destas RAS.
b1) Pré-umedecimento
Para facilitar a absorção da solução de tetrazólio, é necessário realizar o pré-umedecimento das sementes para algumas espécies e altamente recomendado para outras. Sementes pré-umedecidas são geralmente menos susceptíveis a danos durante o seu preparo para o teste do que sementes secas e podem ser cortadas ou perfuradas mais facilmente para expor o embrião à ação do tetrazólio. A coloração fica mais uniforme, permitindo uma avaliação mais fácil e segura das sementes. O processo, o período mínimo e as temperaturas de pré-umedecimento estão indicados no Quadro 5.1.
Se o envoltório da semente impedir a embebição, ele deverá ser perfurado ou escarificado manualmente (Fabaceae). Para alguns gêneros como Lotus, Medicago e Mucuna, em que algumas sementes podem ser sementes duras, a realização dos procedimentos que constam na coluna "Observação" do Quadro 5.1 é opcional, dependendo do interesse do requerente ou a critério do laboratório. Esse tratamento para superação de dureza pode ser realizado em todas as sementes ou apenas nas sementes que não absorveram água ao final do período de pré-umedecimento. Após esse tratamento, deve-se executar a coloração conforme previsto no Quadro 5.1. Quando as sementes duras não forem tratadas, a porcentagem de sementes duras deve ser relatada no Boletim de Análise de Sementes.
No preparo do teste, é recomendável utilizar algumas sementes a mais como margem de segurança para compensar eventuais erros de corte das sementes.
Poderão ser usados dois processos de pré-umedecimento das sementes:
Durante o pré-umedecimento, sementes de algumas espécies podem produzir uma espessa mucilagem que dificulta o seu preparo. Esta mucilagem pode ser reduzida pela secagem da superfície da semente, esfregando-as num pano ou entre folhas de papel, bem como, pela sua embebição numa solução de sulfato de alumínio e potássio AlK(SO4)2.12H2O, a 1% ou 2%, por cinco minutos.
b2) Exposição dos tecidos para coloração
Para muitas espécies (Quadro 5.1), será necessário expor os tecidos a fim de permitir uma melhor absorção da solução de tetrazólio e facilitar a avaliação da coloração das sementes. Os tecidos que devem ser detalhadamente examinados para estabelecer a viabilidade da semente são os meristemas e outros também considerados como essenciais para o desenvolvimento de uma plântula normal. Os procedimentos para a exposição dos tecidos internos foram padronizados de forma que os danos inevitáveis, causados pelas técnicas de preparação, possam ser facilmente reconhecidos como tal durante a avaliação.
Os envoltórios das sementes podem ser abertos ou removidos usando-se diferentes técnicas como as descritas a seguir.
Durante o preparo de cada repetição de 100, as sementes deverão ser mantidas sempre úmidas (entre papel ou sobre papel ou em água) até serem imersas na solução de tetrazólio. Se o processo for demorado (mais de 20 minutos), deve-se concluir o preparo de cada repetição antes de imergir as sementes na solução de tetrazólio.
- Sementes de Poaceae: fazer um corte transversal imediatamente acima do embrião antes da imersão da semente na solução de tetrazólio.
- Sementes de dicotiledôneas com embrião reto e sem endosperma: fazer um corte de aproximadamente um terço a dois quintos da extremidade distal dos cotilédones e descartar o fragmento.
- Sementes de Coníferas: cortar uma pequena fração de uma ou duas extremidades da semente, de tamanho suficiente para assegurar que o núcleo seminífero (cavidade embrionária) seja aberto sem causar dano ao embrião.
b3) Método a baixa pressão
O método a baixa pressão atmosférica utiliza vácuo parcial para infiltrar rapidamente a solução de tetrazólio nos tecidos das sementes, acelerando o resultado do teste. É um método alternativo e permitido, mas não tem sido muito utilizado no Brasil, pois exige equipamentos para controlar a pressão atmosférica.
As sementes secas, previamente preparadas e colocadas na solução de tetrazólio conforme o descrito para a espécie no Quadro 5.1, são submetidas a um vácuo parcial de cerca de 18.662 Pa (140 Torr) por 10 minutos. Após esse período, a pressão é aumentada lentamente por cerca de um minuto, até alcançar o seu nível normal. Esse processo é repetido três vezes.
Durante o processo de coloração é importante que as sementes estejam completamente cobertas com a solução de tetrazólio e que não sejam expostas à luz, uma vez que a ação da luz ocasiona a redução do sal.
Deve se utilizar, preferencialmente, as concentrações das soluções de tetrazólio (%) prescritas no Quadro 5.1. É possível utilizar concentrações maiores ou menores do que estas, desde que os resultados sejam confiáveis
A temperatura e o tempo de coloração sugerido por espécie são apresentados no Quadro 5.1. Estes são considerados ótimos para a coloração, mas não devem ser considerados como absolutos porque podem variar com a condição da semente e com a pureza do sal. Entretanto, este tempo pode ser prolongado quando as sementes não estiverem completamente coloridas para verificar se a falta de coloração se deveu à lenta absorção do tetrazólio ou se é um indicativo de dano dentro da semente. No entanto, a coloração excessiva deve ser evitada, uma vez que isto pode mascarar os diferentes padrões de coloração, que são indicativos de danos por congelamento, danos mecânicos latentes recém ocorridos, dentre outros.
Para algumas espécies, baixas dosagens de fungicidas ou antibióticos podem ser adicionadas à solução de tetrazólio para evitar a formação de uma solução espumante com precipitado escuro.
Sementes pequenas, que forem difíceis de manusear, podem ser pré-umedecidas e preparadas sobre uma fita de papel, a qual é dobrada ou enrolada e imersa na solução de tetrazólio. Outra alternativa é o uso do pré-umedecimento sobre papel filtro previamente embebido na solução.
Ao final do período de coloração, quando a avaliação das sementes não for realizada de imediato, a solução de tetrazólio deve ser descartada e as sementes lavadas em água corrente e mantidas úmidas até o final da avaliação para evitar o seu ressecamento. Desta forma, as sementes podem ser mantidas em refrigerador (5-10 ºC) por um período máximo de até 24 horas.
O objetivo principal do teste de tetrazólio é distinguir as sementes viáveis das não viáveis. Uma avaliação baseada nos padrões de coloração e de sanidade dos tecidos, torna possível a separação entre esses dois grupos.
Sementes viáveis: são aquelas capazes de produzir plântulas normais em um teste de germinação sob condições favoráveis, depois de superada a dormência, ou após a sua desinfecção, quando necessária. Tais embriões colorem-se completamente e, quando parcialmente coloridos, seus padrões de coloração apresentados ainda indicam se a semente é viável. Porções variáveis de tecido necrosado podem ser encontradas em diferentes regiões desses embriões parcialmente coloridos. A posição e o tamanho das áreas necrosadas, e não necessariamente a intensidade da coloração, determinam se tais sementes podem ser classificadas como viáveis. Estas diferenças de coloração também devem estar associadas à firmeza dos tecidos para serem consideradas como decisivas no reconhecimento e classificação das sementes viáveis.
Sementes não viáveis: são aquelas que não se enquadram nos requisitos anteriores e apresentam colorações não bem caracterizadas ou definidas e, ainda, com estruturas essenciais flácidas ou não coloridas. Sementes com desenvolvimento anormal do embrião ou de outra estrutura essencial devem ser consideradas como não viáveis, independentemente se coloridas ou não. Sementes vazias também devem ser consideradas não viáveis. Embriões rudimentares de sementes de Coníferas são considerados não viáveis.
Sementes duras: são aquelas com tegumento impermeável à água (ver subitem do Capítulo 4 "Teste de Germinação"), mesmo após o pré-umedecimento.
Para uma avaliação adequada das sementes, é necessário observar o embrião e todas as estruturas essenciais, sendo indispensáveis o uso de iluminação e microscópio estereoscópico ou lupa.
A maioria das sementes contem tecidos essenciais e não essenciais. São considerados como tecidos essenciais os meristemas e todas as estruturas reconhecidas como necessárias ao desenvolvimento normal da plântula. Embriões bem desenvolvidos e diferenciados podem ter a habilidade de superar pequenas necroses. Neste caso, as necroses superficiais de pequena extensão podem ser toleradas, mesmo quando localizadas dentro dos tecidos essenciais.
A viabilidade determinada pelo teste de tetrazólio é uma característica de qualidade distinta e única da semente em repouso. Viabilidade é claramente independente da realização do teste de germinação. Contudo, não haverá diferença significativa entre viabilidade e porcentagem de germinação nos casos em que a semente:
O resultado do Teste de Tetrazólio é obtido pela porcentagem média das sementes viáveis, encontradas nas repetições testadas, respeitando as tolerâncias máximas constantes na Tabela de Tolerância 5.1. O resultado é apresentado pela média de duas ou quatro repetições de 100 sementes. No caso da utilização de repetições de 50 ou 25 sementes, as mesmas devem ser combinadas em grupos de 100.
Quando se tratar de semente de espécie florestal com Peso de Mil Sementes igual ou maior que 1.000 g, cujo teste de tetrazólio tiver sido realizado com 100 sementes, o teste será considerado válido se a diferença entre as repetições de 50 sementes não ultrapassar as tolerâncias máximas estabelecidas na Tabela de Tolerância 5.1. Se forem realizadas repetições de 25 sementes, as mesmas devem ser combinadas para formar as repetições de 50 sementes.
Deve ser informado no campo “Outras Determinações” do Boletim de Análise de Sementes em números inteiros e em porcentagem (%) de sementes viáveis, bem como a metodologia utilizada.
Quando o teste for realizado com sementes de Fabaceae ou, eventualmente, de outros gêneros, e forem encontradas sementes duras, relatar em “Observações” somente uma das opções:
“% de sementes duras encontradas no teste” ou
“% de sementes duras incluídas na porcentagem das sementes viáveis”
Detalhes adicionais podem ser fornecidos no campo “Observações”, a critério do Laboratório de Análise de Sementes, tais como:
“% de sementes vazias”
“% de sementes quebradas ou apodrecidas”
“% de sementes com larvas”.
Quando sementes individuais forem testadas no final do Teste de Germinação, o resultado deve ser informado como sementes dormentes (quando viáveis pelo Teste de Tetrazólio) ou mortas (quando não viáveis), as quais são somadas às sementes evidentemente mortas que já haviam sido contadas no teste. Se após o Teste de Tetrazólio existirem sementes com classificação duvidosa (não está claro se estão viáveis ou não viáveis), estas devem ser classificadas como mortas.
O resultado do Teste de Tetrazólio pode ser considerado válido somente se a diferença entre a repetição mais alta e a mais baixa estiver dentro da tolerância aceitável. Para verificar a confiabilidade do resultado do teste, a porcentagem média das repetições é calculada e comparada com a Tabela de Tolerância 5.1.
Para decidir se dois testes realizados na mesma ou em diferentes amostras médias do mesmo lote, em um mesmo laboratório estão dentro da tolerância, usar a Tabela de Tolerância 5.2 deste Capítulo.
Quando dois testes de diferentes amostras médias do mesmo lote forem executados em diferentes laboratórios, a Tabela de Tolerância 5.3 deste Capítulo deverá ser consultada. Para ambas as situações a porcentagem média de viabilidade dos dois testes é calculada. Os testes serão compatíveis se a diferença entre os dois resultados não exceder a tolerância indicada na Tabela.
BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Amostragem. In: Regras para Análise de Sementes. Brasília, DF: Secretaria de Defesa Agropecuária, 2009, Cap. 6, p.226-305.
ISTA - INTERNATIONAL SEED TESTING ASSOCIATION. International rules for seed testing. ed. 2025. Wallisellen, Switzerland, 2025. Chapter 6: The tetrazolium test, p.6.1-6.25.
| Versão | Conteúdo alterado | Data | Motivo |
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| 1 | - | 28/03/2025 | Criação do documento |
Quadro 5.1 “Instruções para o Teste de Tetrazólio em Sementes" (rev. 1)
Guias e fotos de Testes de Tetrazólio
Tabela de Tolerância 5.1 (rev. 1): Tolerâncias máximas admitidas entre os resultados das repetições do mesmo teste, a 2,5% de probabilidade.
Tabela de Tolerância 5.2 (rev.1): Tolerâncias máximas admitidas para comparação de resultados do Teste de Tetrazólio de amostras de trabalho obtidas da mesma ou de diferentes amostras médias do mesmo lote, analisadas no mesmo laboratório.
Tabela de Tolerância 5.3 (rev. 1): Tolerâncias máximas admitidas para comparação de resultados de dois Testes de Tetrazólio realizados com amostras de trabalho obtidas da mesma ou de diferentes amostras médias do mesmo lote, analisadas em diferentes laboratórios, a 5% de probabilidade.