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Elaboração, distribuição, informações:
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
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Responsável técnico: Ronaldo L. Sanches - Méd.-Vet., M.Sc., Laboratório Nacional Agropecuário - MG, Caixa Postal 35, CEP 33.600-000 Pedro Leopoldo, MG.
Edição e revisão: Caroline Del Negri Sartoretto de Oliveira, Lúcio Akio Kikuchi
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Macroprocesso: Inspeção de produtos de origem animal e vegetal |
Objetivo: A microscopia de alimentos para animais objetiva subsidiar o estudo e a identificação dos componentes presentes na elaboração dos produtos tecnologicamente processados. |
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Processo: Fiscalizar estabelecimentos e produtos de origem animal e vegetal |
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Entrega: Segurança e qualidade dos alimentos |
Público alvo e demais interessados: Servidores atuantes na fiscalização de alimentos para animais e setor produtivo relacionado.
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Setor responsável e responsabilidades A Coordenação Geral de Programas Especiais do Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal é responsável pela elaboração, atualização e envio para aprovação deste manual, tendo responsabilidade quanto aos procedimentos descritos no documento |
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CGPE - Coordenação Geral de Programas Especiais
DIPOA - Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal
LFDA - Laboratório Federal de Defesa Agropecuária
MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
SDA - Secretaria de Defesa Agropecuária
O presente manual possui vigência e prazo indeterminado e será revisado sempre que necessário, no mínimo anualmente, pela Coordenação Geral de Programas Especiais do Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal (CGPE/DIPOA) e aprovada pela Secretaria de Defesa Agropecuária (SDA).
A gestão desse manual está sob a responsabilidade da CGPE/DIPOA que prestará auxílio ao público alvo leitor dúvidas e/ou sugestões quanto à aplicação deste manual devem ser submetidas ao Departamento responsável.
A publicação e atualização das versões na plataforma oficial da SDA para acesso pelo público alvo será de responsabilidade da Secretaria representada pelo DIPOA.
A microscopia de alimentos para animais objetiva subsidiar o estudo e a identificação dos componentes presentes na elaboração dos produtos tecnologicamente processados.
A alimentação de animais, principalmente monogástricos, representa a maior parte do custo de produção. Pode-se afirmar que erros nas formulações de dietas ou emprego de ingredientes de má qualidade ou inadequados, acarretarão prejuízos inevitáveis.
A análise laboratorial constitui o indispensável suporte técnico para a garantia de qualidade dos alimentos, quando produzida por laboratórios que forneçam resultados confiáveis e adequados aos objetivos pretendidos.
Os trabalhos de Henneburg & Stohman (1860, 1864) que originaram o Sistema de Weende, foram embasados nas determinações de umidade, proteína bruta, fibra bruta, extrato etéreo, cinzas e extratos não nitrogenados (Fonnesbeck, 1976). Decorridos mais de 130 (cento e trinta) anos, uma série de metodologias foram desenvolvidas, mas a maioria dos níveis de garantia de nutrientes estampados nos rótulos de “concentrados”, “rações” e “ingredientes de origem animal e vegetal”, são sustentados pelas análises citadas com algumas variações e poucos acréscimos.
Segundo Austic & Scott (1991), mais de 36 nutrientes são necessários na dieta de aves, em concentrações apropriadas e balanceadas, de maneira que possam maximizar a habilidade desses animais em expressar seu potencial genético de crescimento e reprodução.
Considerando os custos necessários para realização de todas as análises (equipamentos, pessoal técnico bem treinado, tempo) e testes biológicos serem viáveis somente em situações específicas por serem demorados e às vezes caros, a estimativa do valor nutritivo de um alimento envolvendo análises complementares ao Sistema de Weende, não constitui tarefa rotineira.
O nutricionista conta, na maioria das situações, com os níveis de garantia estampados nos rótulos dos produtos ou um pequeno grupo de resultados analíticos, envolvendo provas físico-químicas, às vezes microbiológicas e toxicológicas, quando não está recorrendo às tabelas de composição de alimentos, nem sempre condizentes com a realidade dos ingredientes disponíveis na região.
A microscopia de alimentos para animais preenche boa parte desta lacuna e constitui excelente ferramenta auxiliar na análise laboratorial. Segundo Bonetto (s/d) além de fornecer dados que não seriam possíveis por meio da análise química, é um método rápido, barato, dispensa equipamentos de alto custo e deve ser considerado o instrumento número um, onde determinadas análises químicas são limitadas.
A identificação e avaliação microscópica de ingredientes ou misturas que os contenham, são efetuadas principalmente por meio de dois métodos distintos: a observação das características externas ou das características celulares. O primeiro método é o mais usado, requerendo pouca preparação da amostra, e depende basicamente da habilidade do analista em identificar os constituintes, pela sua forma, cor, tamanho do fragmento, textura, dureza, brilho, odor, sabor, provas químicas qualitativas etc.
O outro método depende do conhecimento da estrutura celular de tecidos animais e vegetais. Ambos podem ser usados independentemente, embora os melhores resultados sejam obtidos com a sua combinação (AAFM, 1992).
Os seguintes materiais constituem o básico para o laboratório que se propõe a trabalhar apenas com a observação das características externas: microscópio estereoscópico (8 a 50 x ou mais); peneiras ou tamis de uso manual com malhas de 2.0, 1.0, 0.50 e 0.25 mm, coleção de ingredientes, adulterantes, sementes de gramíneas e leguminosas incluindo também as tóxicas, placas de Petri, pinças, estiletes, frascos conta-gotas, almofariz, reagentes específicos e outros.
A colheita da amostra deve ser convenientemente efetuada, obedecendo critérios de amostragem conforme o tamanho do lote, em vários pontos do carregamento ou partida, de maneira que possa refletir a real composição do produto. A quantidade deve ser suficiente para realização de toda a parte analítica bem como armazenamento em arquivo, destinada à revisão ou perícia. Faz-se o quarteamento da amostra dividindo-a em porções e acondicionando de maneira a conservar in natura as características físicas, químicas e organolépticas. Para produtos sólidos, adotar sacos plásticos resistentes e, para líquidos, frascos plásticos ou vidro (MARA, 1992).
Chegando ao laboratório, uma das porções é destinada para análises microbiológicas ou toxicológicas quando solicitadas e a outra é submetida a novo quarteamento encaminhando-se parte para a moagem e posteriores análises químicas. O remanescente deste quarteamento é avaliado de maneira macroscópica e preparado para as análises microscópicas.
A preparação para o exame microscópico visa facilitar a visualização dos fragmentos e pode obedecer os seguintes processos:
Os ingredientes ou misturas contêm fragmentos de tamanhos diferenciados e quando separados da parte mais fina, normalmente constituída de amido, facilitam a visualização e ajudam a selecionar estruturas de tamanhos específicos. Emprega-se preferencialmente um conjunto de peneiras de uso manual, com malhas de 2.0, 1.0, 0.50 e 0.25 mm com tampa e bandeja. Após a separação, fazer a transferência das porções retidas, inclusive da bandeja, para as placas de Petri. As amostras peletizadas recebem um tratamento diferenciado, pois este sistema de processamento e outros semelhantes, une os fragmentos com as cascas e a parte mais fina, impedindo a visualização individualizada. A reversão da peletização às vezes resulta em melhores resultados que a desintegração da amostra em almofariz ou moagem. O procedimento consiste em umedecer a amostra, fazendo agitações ocasionais com uma espátula ou bastão, até a sua completa desintegração. Isto ocorre normalmente no espaço de 1 (uma) a 2 (duas) horas e o material resultante é vertido em peneira com malha de 0.1 a 0.2 mm e lavado com água. O remanescente é transferido para um funil de sucção provido com papel de filtro e após a filtragem da maior parte da água, seca-se com acetona. Transferir o material para recipiente apropriado (bandeja), aguardar a completa evaporação do solvente e levar para estufa de secagem com ventilação forçada (65°C). O material seco deve ser fragmentado e em seguida tamisado, procedendo-se da mesma maneira que o especificado para amostras fareladas. Recomenda-se a análise do filtrado em paralelo, em virtude do carreamento de substâncias solúveis em água e solventes orgânicos.
Produtos com teores de gordura elevados são de difícil separação pelo sistema de tamisação, além de fornecerem imagens pouco definidas ao microscópio. A maior parte da gordura deve ser removida e, para isto, transfere-se a amostra para um frasco cônico, adiciona-se éter etílico, agita-se repetidas vezes e faz-se a filtragem. O solvente residual é evaporado e em seguida procede-se ao peneiramento.
Algumas análises e produtos exigem a separação da parte orgânica e inorgânica ou com maior densidade. O procedimento consiste em transferir pequena quantidade de amostra para um tubo de ensaio, adicionar clorofórmio até próximo a borda do tubo e aguardar alguns minutos até a completa separação das fases. Recolher o sobrenadante e transferir para um papel de filtro ou absorvente. Descartar o solvente e com o auxílio de uma espátula recolher e transferir o precipitado para outro papel de filtro ou absorvente. Efetuar os trabalhos que envolvam o emprego de solventes em capela de exaustão.
Misturas de Ingredientes:
1º Pesar cerca de 15 g de amostra e transferir para funil de separação (orifício da torneira Ǿ 5 mm);
2º Adicionar cerca de 80 mL de clorofórmio, homogeneizar e aguardar a separação das fases;
3º Drenar a fração precipitada sobre uma cápsula e devolver o excesso de clorofórmio presente na cápsula para o funil de separação. Ocorrendo entupimento no funil de separação, utilizar uma haste metálica fina para auxiliar a drenagem do material;
4º Transferir o conteúdo da cápsula para uma placa de Petri, previamente identificada com o número da amostra e da fase correspondente. Aguardar até a completa evaporação do solvente, podendo-se utilizar um funil de Büchner acoplado a um frasco Kitasato, com o auxilio de vácuo;
5º Adicionar ao funil de separação contendo clorofórmio e a fração remanescente da amostra, níveis crescentes de éter etílico ou éter de petróleo, fazendo agitação e aguardando que ocorra a precipitação de cada fase com maior densidade;
6º Drenar a fração precipitada sobre outra cápsula e devolver o excesso da mistura de solventes na cápsula, para o funil de separação;
7º Transferir o conteúdo da cápsula para uma placa de Petri, previamente identificada com o número da amostra e da fase correspondente. e aguardar até a completa evaporação;
8º Repetir os procedimentos constantes nas etapas 5ª, 6ª e 7ª empregando éter etílico ou éter de petróleo até a completa separação das fases com diferentes densidades. Havendo necessidade de reverter o processo antes da drenagem, adicionar clorofórmio, obedecendo os procedimentos de agitação e aguardando a separação;
9º Completar a secagem das amostras em estufa ventilada (temperatura entre 50 e 70 C° e tempo não inferior a 30 minutos); e
10º Após a secagem tamisar cada uma das fases separadamente em conjunto de peneiras e transferir as porções retidas nas peneiras e bandeja para placas de Petri previamente identificadas.
Produtos com teores de gordura elevados são de difícil separação pelo sistema de tamisação, além de fornecerem imagens pouco definidas ao microscópio. A maior parte da gordura deve ser removida e, para isto, transfere-se a amostra para um frasco cônico, adiciona-se éter etílico, agita-se repetidas vezes e faz-se a filtragem. O solvente residual é evaporado e em seguida procede-se ao peneiramento.
O método mais empregado consiste em separar com o auxílio de mistura de solventes de baixa e alta densidades (éter etílico ou petróleo e clorofórmio), os constituintes de uma mistura com peso conhecido. A preparação da amostra deve ser criteriosa e a tarefa exige bastante experiência do analista (Huss, 1979; Khajarern et al., 1987).
O exame macroscópico é efetuado ao mesmo tempo em que a amostra é preparada para o exame microscópico. Esta fase pode revelar a presença de contaminações, materiais estranhos, homogeneização inadequada e particularidades como sabor, odor e aparência típica do produto.
A presença de grumos nos ingredientes ou suas misturas pode ser indicativa de fungos ou ácaros, devendo este material ser cuidadosamente separado para a investigação microscópica. Quando não ocorre a detecção, as possíveis causas podem ser: Excesso de umidade, que normalmente reduz a estabilidade do produto durante a estocagem; ou A presença de gordura ou de ingredientes viscosos como o melaço.
A cor pode ser indicativa do excesso ou falta de aquecimento durante o processamento industrial. Existindo este tipo de suspeita, como exemplo soja ou seus subprodutos, recomendam-se as análises de atividade ureática e solubilidade protéica em KOH a 0.2%. A coloração marrom-escura e a presença de fragmentos carbonizados são encontrados na maioria dos produtos submetidos a sistemas de secagem direta, podendo às vezes ser visualizados sem o auxílio do microscópio.
Informações adicionais podem ser obtidas com o odor e sabor. Os odores mais encontrados e suas indicações são os seguintes:
a. ranço ou sabão - degradação de gordura;
b. amônia, sulfeto de hidrogênio - degradação de proteína;
c. mofo - presença abundante de fungos; e
d. queimado - superaquecimento.
Odores indicativos de deterioração podem tornar-se mais pronunciados quando uma pequena quantidade do material suspeito é ligeiramente aquecido (30°a 40°C) em recipiente fechado ou misturado com água (40°a 50°C) de maneira a formar uma pasta. Cobre-se com vidro de relógio, aguarda-se algum tempo e faz-se a avaliação (Huss, 1975).
A avaliação de grãos atacados por pragas deve ser criteriosa, pois a perda da proteção natural da semente predispõe ao desenvolvimento de fungos, às vezes produtores de micotoxinas. Ácaros, insetos ou fragmentos que indicam a sua presença nos alimentos devem constituir objeto de alerta, pois em função de sua rápida multiplicação acarretam prejuízos econômicos e do valor nutricional em curto espaço de tempo. Dejeções de aves, morcegos e ratos são mais facilmente detectadas à microscopia e normalmente são carreadores de patógenos.
As recomendações da AAFM (1992) indicam que as frações peneiradas devem ser espalhadas em pedaços de papel (ou placas de Petri) e examinadas com aumentos de 10x a 20x, iniciando-se da fração mais grossa. A pesquisa é executada de uma extremidade a outra e com o auxílio de pinça e estilete separa-se o examinado, de maneira que todos os fragmentos sejam observados em camada fina. Pinças pontiagudas e afiadas são recomendadas para a retirada de pequenos fragmentos e posterior exame de textura, dureza, estrutura, provas químicas e outras características. Adulterantes são às vezes finamente moídos para escapar à detecção, necessitando-se recorrer a um segundo exame com aumento de 100x, usando-se microscópio composto.
Estimativa de produção de misturas de ingredientes para o ano 2015 – 68,7 milhões toneladas, com as seguintes destinações:
a. avicultura corte – 47.2%;
b. avicultura postura – 8.0%;
c. suinocultura – 22.8%;
d. bovinocultura leite – 7.7%;
e. bovinocultura corte – 4.0%;
f. “pet food” – 3.5%;
g. eqüinocultura – 0.8%;
h. aquacultura – 1.4%;
i. mistura mineral – 3.5%; e
j. outros – 1.2% .
(Sindirações, 2015).
Os ingredientes descritos a seguir foram escolhidos em função da sua maior participação no total de misturas produzidas no país ou detecção de problemas no produto.
Produto obtido durante o processamento industrial de carcaças de mamíferos, resultante da cocção, secagem e moagem de tecidos.
a. Características macroscópicas/microscópicas: A cor varia do marrom-claro ao marrom-escuro, dependendo do percentual de ossos, gordura, contaminações e processamento. A textura, uniformidade e tamanho dos fragmentos (<2.5 mm) também são variáveis. O produto é gorduroso e o odor deve ser de carne e gordura cozidos, sem ranço. A observação microscópica, com pequeno aumento, permite verificar que a parte mais fina é granular e as maiores têm a superfície rugosa, ligeiramente engordurada, com quantidades variáveis de grãos finos aderidos. Freqüentemente a mesma amostra pode conter fragmentos de cores variáveis. Os fragmentos de ossos são brancos ou amarelados e diferenciam-se dos ossos de aves porque estes se fragmentam em lascas com bordas angulares (AAFM, 1978). A separação da parte orgânica e inorgânica (flotação) facilita a visualização.
b. Contaminações/adulterações/processamento: A presença de sangue, pêlo, casco, chifre, couro, conteúdo ruminal são admissíveis nas quantidades inevitáveis aos bons métodos de processamento (MA, 1989; AAFM, 1992). Fragmentos superaquecidos, couro oriundo de curtumes (tratado com óxido crômico ou ácido tânico), farinha de penas, farinha de ostras, areia, terra e o excesso dos “admissíveis”, são normalmente encontrados.
A qualidade da farinha de carne e ossos deve ser avaliada principalmente pela quantidade e tipos de contaminações e adulterações (AAFM, 1992). A análise de solubilidade em pepsina a 0.2% (AOAC, 1990; MARA, 1992), constitui um dos parâmetros de avaliação de subprodutos de origem animal, mas segundo Johnston & Coon (1979) e outros autores, este percentual de diluição da pepsina não é sensível para a distinção entre farinhas de boa e má qualidade. O Compêndio Brasileiro de Alimentação Animal (Sindirações, 2013) recomenda o emprego de solução de pepsina 0.002% e conforme Bellaver et al. (2000) o uso da pepsina na concentração de 0.0002% melhora a sensibilidade do processo.
Produto resultante da moagem do grão de soja, após processo industrial de extração do óleo com solvente e posterior tostagem.
a. Características macroscópicas/microscópicas: O grão de soja é elíptico, ligeiramente achatado, com aproximadamente 6-10 mm de diâmetro. A cobertura é lisa, brilhante e firme; a cor amarela é predominante na maioria das espécies. O hilo tem a forma elíptica com aproximadamente 3x1 mm, na cor preta ou marrom-escura, com a borda e ranhura elevadas; em um dos extremos encontra-se a micrópila, pequeno orifício através do qual a raiz primária da semente jovem emerge. A superfície externa da casca apresenta depressões semelhantes a picadas, distanciadas de 0.1 a 0,2 mm, características da soja. A superfície interna é quase branca, ligeiramente estriada, porosa, com espessura de aproximadamente 0.1 mm e aparência esponjosa. Os fragmentos do farelo de soja têm a forma irregular e achatada, bordas arredondadas, aparência translúcida, superfície cerosa e variam da cor creme ao marrom-claro (Bonetto, s/d; AAFM, 1978; AAFM, 1992). A detecção de soja nos alimentos pode ser efetuada com o auxilio de provas químicas e possibilita visualizar farelos de soja tratados e não tratados convenientemente, em misturas que os contenham (Huss, 1975). A prova não é aplicável quando existe superaquecimento.
b. Contaminações/adulterações/processamento: Excesso de cascas, fragmentos superaquecidos, areia, terra, resíduos de cultura, farelo de amendoim etc.
Produto obtido no processamento industrial do grão de trigo, consistindo de pericarpo, aleurona, fragmentos de gérmen e pequena quantidade de grãos. Segundo Nunes (1991), farelo e farelinho correm nos moinhos em bicas separadas. Entretanto, no mercado brasileiro a rotina é a sua mistura, formando um produto único
a. Características macroscópicas/microscópicas: A cor da semente de trigo varia do amarelo ao marrom. O grão é duro, profundamente sulcado e comprimento de 6 a 8 mm. Os fragmentos do grão são reconhecidos nas misturas, pelo farelo aderido ou pela dureza do endosperma. O trigo é mais difícil de moer que outros grãos. O germe que é separado no processo de moagem é facilmente reconhecido pela sua cor amarelo-clara e aspecto oleoso, que pode ser comprovado pressionando-o com uma pinça. Os fragmentos de farelo são encontrados na maioria dos produtos derivados do trigo, e são usados para identificação. A cor varia do branco ao marrom-avermelhado, são delgados, levemente rugosos, podendo ter tricomas. A presença de amido na forma sólida e cor branco-brilhante, aderidos na superfície interna do pericarpo, é o indicador mais significativo para identificação em pequeno aumento (AAFM, 1978; AAFM, 1992; Bonetto, s/d).
b. Contaminações/adulterações/processamento: Excesso de cascas, resíduos da cultura, terra, areia, trigo mourisco, triguilho, ácaros etc.
O grão de milho destinado para consumo animal deve ser isento de sementes tóxicas e resíduos de pesticidas e enquadrar-se nos tipos 1, 2 e 3 da Resolução 103 do CONCEX: matérias estranhas, impurezas e fragmentos (max.): tipo 1 - 1.5%; tipo 2 - 2.5%; tipo 3 - 3.0%; avariados total: 11%; 18% e 24% respectivamente; ardidos e brotados (max.): 3%; 6% e 10% respectivamente (MA, 1989).
a. Características macroscópicas/microscópicas: As variedades mais utilizadas são de cor amarela, podendo se distinguir pela dureza e cor do grão. O formato é semelhante a um dente, sendo coberto por um pericarpo com aparência cerosa, lisa, delgada, semitransparente e pequenos sulcos lineares semelhantes à unha. O endosperma córneo está localizado principalmente na parte posterior e longitudinal do grão, e o endosperma farináceo branco circunda a parte posterior do germe. O milho não perde as suas características básicas quando moído, podendo ser identificado em fragmentos de tamanho e forma irregulares. O germe pode ser encontrado separadamente, assim como fragmentos do pericarpo (AAFM, 1978; AAFM, 1972; Bonetto, s/d).
b. Contaminações/adulterações/processamento: Excesso de sabugo, palha, sementes de gramíneas e leguminosas, sementes tóxicas, milho tratado para plantio (corado vermelho), presença de fungos, ácaros, insetos etc.
Alguns subprodutos do milho perdem as características do grão, como é o caso dos farelos de glúten 21 e glúten 60, oriundos da produção de amido. O primeiro é obtido após a extração da maior parte do amido, do glúten e do germe e tem como características principais películas de forma retangulares, vítreas e algumas translúcidas. O glúten 60 é obtido após a remoção da maior parte do amido, do germe e do pericarpo, tendo como característica principal grânulos esféricos de cor amarela a alaranjada. A presença de fragmentos superaquecidos é um ponto importante a ser pesquisado nestes ingredientes.
Os farelos de germe, germe desengordurado e milho degerminado, constituem outros subprodutos do milho disponíveis no mercado e são facilmente identificados quando se conhece as características básicas do milho grão.
São especificados 2 tipos no Brasil: integral e “desengordurado”. O primeiro consiste do pericarpo, estando presentes germe e pequena quantidade de fragmentos de cascas, provenientes exclusivamente do processo normal de obtenção. Poderão ainda estar presentes, em pequena participação, quirera ou arroz quebrado e, em certos casos, onde o polimento é mais acentuado, o próprio grão de arroz finamente moído. O farelo “desengordurado” é obtido pelo processo de extração do óleo contido no farelo de arroz integral (MA, 1989).
a. Características macroscópicas/microscópicas: O arroz tem a casca na cor creme a marrom, com sombreamento cruzado na superfície externa. São rugosas e ásperas ao tato. O grão é liso, alongado e elíptico ao corte transversal, cor branco-brilhante, translúcido a opaco, com dois sulcos longitudinais paralelos em cada superfície plana. O embrião ocupa 1/3 do comprimento e se localiza na superfície plana, na base do grão. Os fragmentos de grão auxiliam na identificação, mas o sombreamento cruzado da casca constitui o principal indicativo da presença de subprodutos de arroz, quando se trabalha com pequeno aumento (AAFM, 1978; AAFM, 1992; Bonetto, s/d).
b. Contaminações/adulterações/processamento: Excesso de cascas, terra, areia, sementes de gramíneas e leguminosas, resíduos da cultura, ácaros etc.
São especificados 3 subprodutos de aves no Brasil: farinhas de resíduo de abatedouro, vísceras e penas. A farinha de resíduo de abatedouro é resultante da prévia hidrólise de penas limpas sobre as quais, em fase posterior do processamento, são adicionadas vísceras sem conteúdo intestinal e demais resíduos do abate de aves e submetidos à cocção. Farinha de vísceras é o resultante da cocção de vísceras de aves sem conteúdo intestinal, sendo permitido a inclusão de cabeças e pés. Farinha de penas hidrolisadas é o resultante da cocção sob pressão, de penas limpas e não decompostas, obtidas no abate de aves.
a. Características macroscópicas/microscópicas: As farinhas de subprodutos de aves possuem textura mais suave do que as farinhas de carne ou carne e ossos, embora a cor seja similar. O odor é típico. Os produtos são identificados pela presença dos seguintes constituintes: penas, ossos, escamas dos pés e pernas, bicos, unhas, cascas de ovos (resíduos de incubatório) etc. Algumas penas após o processamento se assemelham a pêlos e outras a tubos plásticos. A aparência é vítrea, variando a cor do amarelo-ouro ao marrom, dependendo do tipo de processamento e material utilizado. A hidrólise completa modifica a sua estrutura normal, embora o canhão (raque) mantenha as características. A presença de barbas e bárbulas podem ser indicativos de processamento insuficiente. As escamas quando presentes são ligeiramente curvadas nas bordas, predominando a cor amarelo-clara. Os fragmentos de bico e unha são semelhantes à unha humana. Resíduos de incubatório diferenciam dos demais, pela presença de cascas de ovos, e são reconhecidos por sua estrutura calcária quebradiça e superfície porosa. As paredes dos ossos de aves são mais finas e quebram mais facilmente que os ossos de mamíferos, fragmentando em lascas com bordas angulares (AAFM, 1978; AAFM, 1992; Bonetto, s/d).
b. Contaminações/adulterações/processamento: Fragmentos superaquecidos, areia, terra, casca de arroz, presença de constituintes não especificados para o produto (exemplo: farinha de penas com vísceras).
Produto resultante da cocção, secagem e moagem do peixe inteiro, cortes ou ambos, com ou sem a extração de parte do óleo.
a. Características macroscópicas/microscópicas: A cor pode variar do amarelo-claro ao marrom. A maioria das amostras são untuosas, com odor intenso de peixe, auxiliando a identificação nas misturas, mesmo em pequenas quantidades. Os fragmentos mais finos são granulares e os maiores são rugosos, conservando parcialmente a estrutura fibrosa. Os ossos têm aparência perolada, alguns são finos e pontiagudos e outros têm o formato de vértebra. Podem ser opacos ou translúcidos, encontrando-se também fragmentos na cor âmbar. As escamas são chatas ou curvas, translúcidas e com anéis concêntricos. Os ossos e as escamas são constituintes ímpares que indicam a presença do produto. Dentes, otólito e cristalino dos olhos podem ser encontrados (AAFM, 1978; AAFM, 1992).
b. Contaminações/adulterações/processamento: Fragmentos superaquecidos, couro oriundo de curtumes (tratado com óxido crômico ou tanino), farinha de penas, areia etc.
Produto resultante do processamento do sangue fresco e limpo, empregando tambor rotativo ou “spray dryer”.
a. Características macroscópicas/microscópicas: Os fragmentos de farinha de sangue seca em tambores rotativos, são normalmente esféricos, variando o tamanho e forma, podendo apresentar bordas pontiagudas. A coloração é vermelha escura a negro púrpura; superfície lisa, opaca ou quando friccionados em papel ficam brilhantes. São resistentes à fragmentação e apresentam brilho vítreo no seu interior e fraturas conchoidais.
A farinha de sangue obtida através do sistema “spray dryer” é uniforme, apresentando fragmentos pequenos e esféricos, quebrando-se com facilidade.
b. Contaminações/adulterações/processamento: Conteúdo ruminal, ossos, pêlos, fragmentos superaquecidos, cloreto de sódio, fragmentos de insetos etc.
a. Sal (NaCl) - Cristais cúbicos ou granulares, transparentes ou translúcidos quando em fragmentos maiores. Confirmar com prova química qualitativa para cloreto;
b. Gesso - Baixa dureza, colorações branca, cinza, amarela ou marrom, apresentando ao microscópio clivagem bem desenvolvida em uma das direções e baixo relevo. Confirmar com provas químicas qualitativas para sulfato e cálcio;
c. Ostras, farinha – Fragmentos resistentes, opacos a semitranslúcidos, colorações branca, cinza ou rósea, superfície lisa podendo apresentar linhas concêntricas ou paralelas, alternando raias claras e escuras e bordas às vezes serrilhadas. Confirmar com provas químicas qualitativas para carbonato e cálcio;
d. Ossos, farinha – Os fragmentos de tecido ósseo esponjoso apresentam espaços medulares amplos formando trabéculas, enquanto o tecido compacto não tem esta característica. Os canais de Havers e Volkmann são mais facilmente visualizados na farinha calcinada. A coloração dos fragmentos varia de branca a amarela (autoclavada) e branca-opaca a cinza-escuro (calcinada); a resistência à fragmentação é maior na farinha autoclavada. Tecidos muscular e conjuntivo são encontrados na farinha autoclavada, com formatos irregulares, semitransparentes, amarelados, superfície lisa ou não e também presença de sangue, pêlo, casco e chifre;
e. Fosfatos, rocha (apatita) e industrializados – Os fragmentos de apatita são geralmente xenomórficos, às vezes aciculares, brilho vítreo, incolores ao microscópio e cor de interferência cinza sob polarização cruzada, relevo alto e fraturas conchoidais quando fragmentados; não reagem com solução de nitrato de prata 10%. Os fosfatos industrializados (bicálcico, monoamônico e supertriplo) são xenomórficos, amorfos, apresentando cor de interferência cinza-escuro sob polarização cruzada; reagem com solução de nitrato de prata 10% desenvolvendo cor amarela e formando agulhas; e
f. Calcários, calcítico e dolomítico - O calcário calcítico é geralmente incolor, podendo variar a cor conforme as impurezas; ao microscópio é incolor, com clivagem bem definida em duas direções (losangular); relevo apresenta grande variação conforme a orientação do mineral em relação ao polarizador, várias cores em uma mesma partícula, predominando o tom bege quando em lâminas delgadas. O calcário dolomítico pouco difere do calcítico ao microscópio com polarização. Fazer provas qualitativas para cálcio e carbonato; o calcário dolomítico apresenta menor efervescência inicial do que o calcítico.
A Encefalopatia Espongiforme Bovina associada à doença de Creutzfeldt-Jakob em humanos, resultou, entre várias providências, em legislações proibindo o uso de determinados subprodutos de origem animal na alimentação de ruminantes.
Entre as metodologias mais utilizadas para este tipo de finalidade encontram-se as protéicas (ELISA e SDS-PAGE), DNA (dot blot e PCR) e microscópica, que oferecem sensibilidade de aproximadamente 0.1% para produtos de origem bovina tratados termicamente (Momcilovic & Rasooly, 2000). Segundo os mesmos autores, a microscopia é objetiva, exige pouca preparação da amostra e equipamentos baratos. Citam, ainda, as conclusões obtidas em controle interlaboratorial envolvendo 28 laboratórios da União Européia:
a) limite de detecção de fragmentos ósseos - 0,1% ou menos;
b) as quantificações só poderão ser efetuadas quando da presença dos referidos fragmentos;
c) o método isolado não permite diferenciação entre espécies; e
d) exigência de razoável competência do analista.
Os procedimentos para a validação do método no Laboratório Federal de Defesa Agropecuária - LFDA/MG, empregando níveis conhecidos de diferentes subprodutos de origem animal (0.05% a 0.8%) em rações não peletizadas para bovinos, com ou sem a presença de ossos na sua composição, permitem sugerir os procedimentos a seguir, que diferem do recomendado na literatura:
I. utilizar cápsula de porcelana ou vidro borossilicato em vez de tubo;
II. pesar cerca de 15 g de amostra;
III. separar as fases por flotação, obedecendo os passos descritos (vide colheita e preparo da amostra) e se necessário separar os constituintes conforme MAPA,2003;
IV. após a secagem da/s fase/s sobrenadante/s e do precipitado, separar por tamisação inicialmente o precipitado (vide colheita e preparo da amostra);
V. transferir as porções retidas nas peneiras, inclusive bandejas para placas de Petri;
VI. repetir o mesmo procedimento com a/s fase/s sobrenadante/s; e
VII. levar ao microscópio, examinar cada uma das frações e se necessário empregar provas químicas qualitativas para confirmação.
A identificação e confirmação da presença de ingredientes, aditivos não nutrientes, contaminações e adulterações, nem sempre são possíveis de serem efetuadas com a simples visualização através do microscópio estereoscópico ou composto.
O emprego de provas químicas qualitativas ajuda o microscopista nesta tarefa e são aplicáveis a vários compostos orgânicos e inorgânicos. Estas provas envolvem a reação de uma pequena quantidade de amostra com um reagente, de maneira a formar um complexo de cor característico, possível de ser observado ao microscópio.
Os testes podem ser efetuados retirando-se fragmentos e transferindo-os para papel de filtro, vidro de relógio, placa de Petri, lâminas, placa de porcelana com 6 ou 12 concavidades etc., dependendo do tipo de prova. Pinças, pequenas espátulas e frascos conta-gotas para armazenamento dos reagentes são necessários.
Para algumas análises, um ou dois testes são suficientes, enquanto para outras, diversos reagentes devem ser usados no estabelecimento do padrão de cor resposta, para o qual é único ou distinto suficiente para uma identificação.
O produto estando presente em fragmentos pequenos e em pouca quantidade, a sensibilidade pode ser melhorada usando papel de filtro impregnado com reagente. O aumento da superfície favorece a reação e as cores são localizadas, distintas e não desaparecem rapidamente como ocorrem nas placas.
Algumas provas, reagentes e reações correspondentes, sem abordar em detalhes o preparo de material e descrição das metodologias, constam na Tabela I.
TABELA I - Provas, reagentes e reações
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PROVAS |
REAGENTES |
REAÇÕES/CORES |
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amônia |
Nessler |
marrom-avermelhado |
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cálcio |
dissolver em. HCl 1:1, adic. sol. sat. Oxalato amônio + 1 gota NH4OH |
ppt branco |
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cloreto |
Sol. alcol. nitrato de prata 10% |
branco/expande |
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sulfatos |
nitrato de prata 10% |
agulhas brancas |
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sulfatos |
1 gota HCl 1:1 + 1gota de BaCl2 10% |
ppt branco |
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fósforo |
dissolver em. HCl 1:1; adic 3 gotas molibdato amônio 2,5% + 1 gota sol. reag. Sulfato de p - metilaminofenol |
azul |
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fosfatos ind. |
nitrato de prata 10% |
agulhas amarelas |
|
carbonatos |
1 gota HCl 1:1 |
efervescência rápida |
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ossos |
HCl 1:1 |
efervescência lenta |
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celulose x pêlo |
(100g ZnCl2 + 60mL H2O) + 20g KI + 0,5g I |
Celulose – púrpura Pelo - cor do reagente |
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casco/chifre |
ácido acético glacial 1:1 + H2O/após 1 hora |
resistente |
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gelatina |
Idem |
macio |
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cistina (penas, pêlos) |
2 g acetato de chumbo + 100 mL NaOH 10%; aquecer cuidadosamente |
marrom escuro |
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sangue |
Transferir p/ lâmina + 1 gota H2SO4; cobrir c/ lamínula e levar ao microscópio imuno fluorescência (580 a 650 nm) |
fluorescência vermelha |
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sangue |
tetrametilbenzidina (1 g/100 ml ácido acético) Dil. 150 ml H2O |
azul ao redor partícula |
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uréia |
1) Sol. urease 0,2%; 2) 0,15 g azul de bromotimol c/2,4 ml NaOH 0,1N; completar p/50ml H2O; 3) papel de filtro tiras; 4) mist. 1+2 em béquer umedecendo tiras; secar. Umedecer tiras c/ H2O, pulverizar amostra sobre as tiras. |
azul (mancha) |
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Co, Cu e Fe |
1) Sol. tartarato Na e K 20%; 2) sol. Sal-R-nitroso 0,2%. Umedecer papel filtro c/1; pulverizar amostra; acrescentar gotas de 2 |
rosa, marrom e verde-azulado |
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Co, Cu, Fe e Mn |
Solubilizar 0,003 g ferrocianeto de K em 10 gotas H2O; pulverizar amostra na solução |
verde, turquesa, marrom-avermelhado, azul e branco |
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zinco |
1) Sol NaOH 2N; 2) adicionar 10 mg difeniltiocarbazona em 100 ml tetracloreto de carbono. Umedecer papel de filtro c/1; pulverizar amostra; adicionar 1-2 gotas sol. 2 |
fúcsia |
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iodato |
Ácido hipofosforoso (30%-32%) e papel de amido. Umedecer papel de amido com ácido; pulverizar amostra |
azul-púrpura |
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furazolidona ácido ascórbico violeta genciana menadiona |
Solução alcoólica sat. nitrato de prata |
amarelo-claro ppt azul-escuro mancha púrpura vermelho-tijolo |
Fonte: Butolo, 2002; AAFM, 1978; Huss, W, 1975; Khajarern et al., 1987; AAFM, 1992.
As freqüências de contaminações/adulterações e problemas de processamento em subprodutos de origem animal e vegetal mais analisados no LFDA/MG, constam nas tabelas II e III.
Outros ingredientes disponíveis no mercado, as técnicas microscópicas detalhadas, as combinações com provas químicas e as descrições de âmbito celular, poderão ser complementadas com as referências citadas.
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TABELA II – Contaminações/adulterações/problemas de processamento em subprodutos de origem vegetal |
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Ingrediente → Cont./Adult./Proces.↓ |
algodão, farelo |
arroz, farelo |
glúten21 |
milho, farelo |
soja, farelo |
trigo, farelo |
| ácaro/inseto | + | ++ | ++ | +++ | ||
| amendoim, far. | + | |||||
| aquecim. exces./insuf. | ++ | ++ | ++ | |||
| areia/terra | + | ++ | + | + | + | |
| arroz, casca | + | |||||
| cascas, excesso | +++ | + | + | |||
| resíduo cultur/limpeza | ++ | + | +++ | + | ++ | |
|
semente estranha compos./tóxic |
+ | + | ++ | + | + | |
+ baixa
++ moderada
+++ alta
| TABELA III – Contaminações/adulterações/problemas de processamento em subprodutos de origem animal | ||||||
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Ingrediente → Cont./Adult./Proces.↓ |
carne/ ossos,farinha |
ossos, farinha |
ostras, farinha |
penas, farinha |
sangue, farinha |
vísceras, farinha |
| aquecim. exces./insuf. |
++ |
++ |
++ |
+ |
++ |
|
| areia/terra |
+ |
+ |
+++ |
+ |
+ |
|
| arroz, casca |
+ |
+ |
||||
| calcário |
+ |
+ |
+ |
|||
| casco/chifre |
++ |
+++ |
||||
| conteúdo ruminal |
+ |
++ |
||||
| couro/colágeno |
+++ |
++ |
||||
| hidrólise incompl. |
++ |
|||||
| ossos |
+ |
++ |
++ |
|||
|
ostras |
+++ |
|||||
| penas |
++ |
++ |
||||
| sal |
+ |
+ |
||||
| sangue/vísceras |
+ |
+ |
++ |
|||
+ baixa
++ moderada
+++ alta
As sugestões para aprimoramento ou possíveis correções deste documento devem ser direcionadas ao Departamento responsável, para alinhamento das melhores práticas de mercado, legislação vigente e/ou regulamentações, que não tenham sido contempladas na versão vigente.
| Versão | Conteúdo alterado | Data | Motivo |
|---|---|---|---|
| 1 | - | 06/01/2023 | Elaboração do documento |