¶ Folha de Resumo
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Ano 2025
Elaboração, distribuição, informações:
Ministério da Agricultura e Pecuária
Secretaria de Defesa Agropecuária - SDA
Departamento de Serviços Técnicos - DTEC
Esplanada dos Ministérios, Bloco D, Anexo, Ala B, 4º andar, sala 433
CEP: 70043-900, Brasília - DF
www.agricultura.gov.br
e- mail: cgal@agro.gov.br
Central de Relacionamento: 0800 704 1995
Equipe técnica:
- CGAL
¶ Folha de rosto
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Macroprocesso: Laboratórios |
Objetivo: Estabelecer os métodos oficiais de ensaios para análise microbiológica de amostras de alimentos para animais destinados aos laboratórios oficiais e credenciados da Rede Nacional de Laboratórios Agropecuários. |
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Processo: Análises Laboratoriais |
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Entrega: Segurança e qualidade de alimentos |
Público alvo e demais interessados: Laboratórios oficiais ou credenciados do Ministério da Agricultura e Pecuária (Mapa) |
Versão do documento: 2 |
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Setor responsável e responsabilidades A Coordenação Geral de Laboratórios Agropecuários do Departamento de Serviços Técnicos é responsável pela elaboração, atualização e envio para aprovação deste manual, tendo responsabilidade quanto aos procedimentos descritos no documento. |
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¶ 1. Definições e siglas
Não aplicável
¶ 2. Responsabilidades
O presente manual possui vigência e prazo indeterminado e será revisado sempre que necessário, no mínimo a cada 5 anos, pela Coordenação Geral de Laboratórios Agropecuários do Departamento de Serviços Técnicos (CGAL/DTEC).
A gestão desse manual está sob a responsabilidade da CGAL/DTEC que prestará auxílio ao público alvo leitor dúvidas e/ou sugestões quanto à aplicação deste manual devem ser submetidas ao Departamento responsável.
A publicação e atualização das versões na plataforma oficial da SDA para acesso pelo público alvo será de responsabilidade da Secretaria representada pelo DTEC.
¶ 3. Objetivo
O Objetivo do Manual é o de publicar os métodos analíticos que devem ser utilizados pelos laboratórios oficiais e credenciados do Ministério da Agricultura e Pecuária (MAPA), na execução das análises demandadas pela Defesa Agropecuária.
¶ 4.Procedimentos
¶ 4.1 Preparo de amostras
O preparo de amostras para análise microbiológica deve seguir os procedimentos preconizados nas normas ISO 6887-4 e ISO 7218.
¶ Bibliografia
- ISO 6887-4:2017 Microbiology of the food chain — Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination. Part 4: Specific rules for the preparation of miscellaneous products.
- ISO 7218:2024 Microbiology of the food chain — General requirements and guidance for microbiological examinations.
¶ 4.2 Métodos normalizados
| Determinação | Técnica | Método |
|---|---|---|
| Coliformes termotolerantes a 45 °C | Contagem por inoculação em profundidade | Contagem de Coliformes Termotolerantes, neste manual |
| Coliformes termotolerantes a 45 °C | Contagem por inoculação em superfície | AFNOR 3M 01/02-09/89C |
| Enterobacteriaceae | Contagem por inoculação em profundidade | ISO 21528-2 |
| Enterobacteriaceae | Contagem por inoculação em superfície | AFNOR 3M 01/06-09/97 |
| Salmonella spp. | Detecção e isolamento | ISO 6579-1 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por reação em cadeia de polimerase | AFNOR QUA 18/03-11/02 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por reação imunoenzimática | AFNOR BIO 12/16-09/05 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por reação imunoenzimática | AFNOR BIO 12/32-10/11 |
¶ 4.3 Contagem de Coliformes Termotolerantes
Prova presuntiva: baseia-se na inoculação das diluições desejadas das amostras sob teste em ágar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA) e posterior contagem das colônias suspeitas. O ágar cristal violeta vermelho neutro bile apresenta em sua composição sais biliares e cristal violeta, responsáveis pela inibição de microrganismos Gram positivos e vermelho neutro, um indicador de pH que revela a fermentação da lactose pelos microrganismos presentes. A adição de sobrecamada visa à prevenção do crescimento e do espraiamento de colônias na superfície do ágar.
Prova confirmativa para coliformes termotolerantes: a confirmação da presença de coliformes termotolerantes é feita por meio da inoculação das colônias suspeitas em caldo EC e posterior incubação em temperatura seletiva de (45,0 ± 0,2)°C, em banho-maria com agitação ou circulação de água. A presença de gás nos tubos de Durham evidencia a fermentação da lactose presente no meio. O caldo EC apresenta em sua composição uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante impedindo a sua acidificação. A seletividade é devido a presença de sais biliares responsáveis pela inibição de microrganismos Gram positivos.
¶ Campo de aplicação
Contagem de coliformes totais e coliformes termotolerantes em amostras de matérias-primas, alimentos e rações, devendo ser utilizado quando o limite máximo tolerado for igual ou superior a 100 UFC/g ou mL.
¶ Materiais e equipamentos
- Vidrarias e equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos;
- Banho-maria com movimentação de água (agitação ou circulação).
¶ Meios de cultura, reagentes e soluções
- Insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos;
- Ágar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA);
- Caldo verde brilhante bile 2% lactose;
- Caldo EC;
- Solução salina peptonada 0,1%.
¶ Preparo da amostra
- Após seu recebimento no laboratório as amostras devem ser mantidas até o momento do início da análise de acordo com norma ISO específica.
- Pesar 25 g ± 5% ou pipetar 25 mL ± 5% da amostra.
- Adicionar 225 mL de solução salina peptonada 0,1%.
- Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em “stomacher”.
Esta é a diluição 10-1.
¶ Procedimentos da análise
¶ Procedimentos de controle
Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório.
¶ Prova presuntiva
A partir da diluição inicial (10-1), efetuar as demais diluições desejadas em solução salina peptonada 0,1%. No caso de produtos líquidos a inoculação pode ser realizada a partir da diluição 100.
Sempre utilizar mais de uma placa, seja uma duplicata da mesma diluição, seja duas ou mais de diluições diferentes.
Inocular 1 mL de cada diluição desejada em placas de Petri esterilizadas. Adicionar a cada placa cerca de 15 mL de VRBA previamente fundido e mantido a 46°C–48°C em banho-maria. Homogeneizar cuidadosamente e deixar em repouso até total solidificação do meio. Adicionar, sobre cada placa, cerca de 10 mL de VRBA previamente fundido e mantido a 46°C–48°C em banho-maria, formando uma segunda camada de meio. Deixar solidificar.
Após completa solidificação do meio, incubar as placas em posição invertida em temperatura de (35 ± 1)°C por 18 a 24 horas.
As contagens deverão ser realizadas imediatamente após o período de incubação das placas. Na impossibilidade de realizar a contagem imediatamente após o período de incubação, manter as placas sob refrigeração em temperatura de 4°C a 7°C por um período não superior a 24 horas. Esse procedimento não deve tornar-se uma prática rotineira.
As colônias deverão ser contadas com o auxílio de contador de colônias, o qual deverá:
- estar equipado com placa de vidro ou acrílico, com diâmetro compatível com o das placas utilizadas, dividido milimetricamente em quadrantes com 1 cm2 de área e com iluminação artificial uniforme;
- ter capacidade para aumento de 1 a 2 vezes, com dispositivo de regulagem de altura para melhor ajuste do foco, podendo ainda dispor de sistema eletrônico ou manual de registro das contagens; e
- estar localizado em local onde não haja incidência direta de luz sobre a plataforma de apoio da placa, para evitar possíveis enganos na identificação das colônias.
Utilizar o estereoscópio para observação de características morfológicas das colônias, para diferenciar microrganismos de partículas da amostra ou do meio e para seleção e isolamento de colônias.
Verificar sempre a proporcionalidade dos resultados obtidos nas diluições sucessivas.
Selecionar placas que contenham entre 15 e 150 colônias.
Contar as colônias que apresentarem morfologia típica de coliformes, ou seja, colônias róseas com 0,5 a 2 mm de diâmetro rodeadas ou não por uma zona de precipitação da bile presente no meio. Anotar os resultados de contagem.
Contar separadamente colônias típicas e atípicas e submeter 3 a 5 colônias de cada uma às provas confirmativas.
¶ Provas confirmativas
¶ Coliformes termotolerantes
Inocular as culturas suspeitas de coliformes termotolerantes em tubos contendo caldo EC. Incubar os tubos a (45,0 ± 0,2)°C por 24 a 48 horas em banho maria com agitação.
A presença de coliformes termotolerantes é confirmada pela formação de gás (mínimo 1/10 do volume total do tubo de Durham) ou efervescência quando agitado gentilmente. Anotar o resultado obtido para cada tubo, bem como a diluição utilizada.
Observação: A leitura pode ser feita após 24 horas de incubação, porém, só serão válidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo deverão ser reincubados por mais 24 horas.
¶ Expressão dos resultados
Para alimentos comercializados no MERCOSUL os resultados da contagem de coliformes termotolerantes correspondem à determinação “coliformes a 45°C”.
A aplicação de procedimentos de controle durante o processo analítico visa à garantia da confiabilidade do resultado final, assegurando a sua repetibilidade, precisão e exatidão.
A precisão e a exatidão do método também dependerão da correta observação e aplicação dos procedimentos padronizados estabelecidos para a área analítica.
A garantia da validade dos resultados da contagem estará assegurada quando os resultados dos controles indicarem não haver qualquer falha em nenhuma etapa do processo analítico.
Para o cálculo final das contagens de coliformes totais e termotolerantes, proceder de acordo com o estabelecido na ISO específica.
Expressar o resultado em UFC/g ou mL.
¶ Bibliografia
BRASIL. Ministério da Agricultura e do Abastecimento. Regulamentos técnicos de identidade e qualidade de leite e produtos lácteos. Ministério da Agricultura e do Abastecimento/ Secretaria de Defesa Animal/ Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal/ Divisão de Normas Técnicas. Brasília, D.F. Série Regulamentação Técnica de Identidade e Qualidade de Produtos de Origem Animal; n.2, 1997, 77p.
International Commission on Microbiological Specifications for Foods. Microorganismos de los Alimentos - Técnicas de Análisis Microbiológico. International Commission on Microbiological Specifications for Foods. V.1. 2. ed. Acribia, Zaragoza, Espanha.
Hitchins, A. D.; Feng, P.; Watkins W. D.; Rippey S. R.; Chandler L. A. Escherichia coli and the Coliform bacteria. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponível em: http://www.cfsan.fda.gov.
Kornacki, J. L.; Johnson, J. L. Enterobacteriaceae, Coliforms and Escherichia coli as Quality and Safety Indicators. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p. 69-82.
¶ 4.4 Meios de Cultura, Reagentes e Soluções
Como medida de segurança, as substâncias componentes dos meios de cultura, das soluções e dos reagentes incluídas neste Manual estão sinalizados com uma letra, indicando o grupo de risco ao qual pertencem, sendo:
N = nocivo;
I = irritante;
T = tóxico;
H = hidropoluente;
P = perigoso para o meio ambiente;
C = corrosivo;
O = oxidante;
F = inflamável;
E = explosivo;
M = mutagênico;
Co = comburente.
Recomenda-se que, antes da manipulação e descarte das referidas substâncias, sejam consultadas fichas próprias ou manuais de segurança, visando o reconhecimento dos principais riscos inerentes e das medidas indispensáveis para prevenir ou evitar à ocorrência de acidentes e minimizar os danos à saúde do usuário e ao meio ambiente.
Meios de cultura desidratados fornecidos por diferentes fabricantes podem apresentar pequenas diferenças em suas composições. Observar atentamente a quantidade necessária de meio desidratado, em gramas por litro de meio a ser preparado, o modo de preparo, o tempo e a temperatura de esterilização em cada caso.
Ao adquirir meios de cultura, observar atentamente a formulação, comparando-a com aquela indicada neste manual. Às vezes, as diferentes marcas utilizam diferentes termos para uma mesma substância. Por exemplo, os termos triptona e tripticase referem-se à peptona de caseína obtida por digestão tríptica ou pancreática. Assim, os produtos ágar tripticase soja, ágar soja triptona, Caso ágar (antigo Casoy) referem-se a um produto que contem peptona de caseína (obtida por digestão tríptica ou pancreática) e peptona de farinha de soja.
As soluções preparadas por meio da dissolução do reativo em álcool etílico, seguida ou não da adição de água destilada/deionizada, neste manual serão denominadas como “solução alcóolica”. Ex.: α-naftol solução alcóolica 5%.
As soluções preparadas por meio da dissolução do reativo em água destilada/deionizada, neste manual serão denominadas como “solução aquosa”. Ex.: Novobiocina solução aquosa 4%.
As soluções preparadas por meio da dissolução do reativo em meio alcalino ou ácido, neste manual serão acompanhadas da indicação do diluente usado para sua preparação. Ex.: Ácido nalidixico solução 2% em NaOH 0.1 mol L−1, α-naftilamina solução 0,5% em ácido acético 5 mol L−1.
Onde houver a indicação “Esterilizar por Filtração” utilizar filtro com membrana de 0.22 μm previamente preparado e esterilizado.
¶ 4.4.1 Meios de cultura
¶ Ágar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA)
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(N*) - nocivo por ingestão, por contato com os olhos e pele (N) - nocivo por ingestão (I) - pode causar lesões oculares graves (H) - hidropoluente (P) - a longo prazo, pode causar efeitos negativos no meio ambiente aquático |
Pesar o ágar cristal violeta vermelho neutro bile de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporção indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado e adicionar o volume de água destilada/ deionizada correspondente. Deixar repousar por 15 minutos. Aquecer até completa dissolução. Normalmente não e necessário esterilizar este meio, porém, se for preciso, este meio pode ser autoclavado a (121 ± 1)°C por 5 minutos.
A composição básica de ágar cristal violeta vermelho neutro bile deverá ser a seguinte, por litro de meio:
- Peptona de carne - 7,0 g;
- Extrato de levedura - 3,0 g;
- Lactose - 10,0 g;
- Cloreto de sódio - 5,0 g;
- Sais biliares nº 3 - 1,5 g;
- Vermelho neutro (N*) - 0,03 g;
- Cristal violeta (N/I/H/P) - 0,002 g;
- Ágar - 15,0 g
- pH 7,4 ± 0,2.
¶ Caldo EC
Pesar o caldo EC de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporção indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de água destilada/deionizada correspondente. Agitar até completa dissolução. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma específica do laboratório. Distribuir volumes de 10 mL em tubos de ensaio previamente preparados com tubos de Durham invertidos. Identificar e datar. Autoclavar a (121 ± 1)°C por 15 minutos.
A composição básica de caldo EC deverá ser a seguinte, por litro de meio:
- Peptona - 20,0 g;
- Lactose - 5,0 g;
- Bile bovina - 1,5 g;
- Cloreto de sódio - 5,0 g;
- Fosfato de potássio dibásico - 4,0 g;
- Fosfato de potássio monobásico - 1,5 g;
- pH 6,9 ± 0,2.
¶ Caldo verde brilhante bile lactose 2%
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(N) - nocivo por ingestão |
Pesar o caldo Verde brilhante bile lactose 2%, de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporção indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado e adicionar o volume de água destilada/deionizada correspondente. Agitar até completa dissolução. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especifica do laboratório. Distribuir volumes de 10 mL em tubos de ensaio com tubos de Durham invertidos. Autoclavar a (121 ± 1)°C por 15 minutos.
A composição básica de caldo Verde brilhante-bile 2%-lactose deverá ser a seguinte, por litro de meio:
- Peptona - 10,0 g;
- Lactose - 10,0 g;
- Bile bovina - 20,0 g;
- Verde brilhante (N) - 0,0133 g;
- pH 7,4 ± 0,2.
¶ 4.5 Preparo de reagentes e soluções
¶ Solução salina peptonada 0,1%
Pesar, separadamente, 8,5 g de cloreto de sódio e 1,0 g de peptona. Transferir para recipiente adequado e adicionar 1000 mL de água destilada/deionizada. Agitar com auxilio de bastão de vidro até dissolução. Verificar a necessidade de ajuste do pH em 7,0 ± 0,2, conforme norma especifica do laboratório. Distribuir de forma a garantir o volume desejado após a autoclavação. Identificar e datar. Autoclavar a (121 ± 1)°C por 15 minutos. Armazenar adequadamente.
¶ 5. Base legal e documentos de referência
¶ 5.1 Base legal
- BRASIL. MAPA - Ministério da Agricultura, Portaria SDA no. 1110 de 13 de maio de 2024
- BRASIL. MAPA - Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, PORTARIA MAPA Nº 747, DE 23 DE DEZEMBRO DE 2024 - Estabelece os critérios e requisitos para o credenciamento e fiscalização de laboratórios pelo Ministério da Agricultura e Pecuária.
¶ 5.2 Documentos de referência
- BRASIL. INMETRO - Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Acreditação. ABNT NBR ISO/IEC 17025 – Requisitos Gerais para a Competência de Laboratórios de Ensaio e Calibração.
¶ 6. Disposições Gerais
As sugestões para aprimoramento ou possíveis correções deste documento devem ser direcionadas ao Departamento responsável, para alinhamento das melhores práticas de mercado, legislação vigente e/ou regulamentações, que não tenham sido contempladas na versão vigente.
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7. Histórico de revisões
| Versão | Conteúdo alterado | Data | Motivo |
|---|---|---|---|
| 1 | - | 21.05.2025 | Elaboração do documento |
| 2 | Alteração do item 4.1 | 29.05.2025 | Inclusão do preparo das amostras e renumeração dos itens do item 4. |