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Ano 2025
Elaboração, distribuição, informações:
Ministério da Agricultura e Pecuária
Secretaria de Defesa Agropecuária - SDA
Departamento de Serviços Técnicos - DTEC
Esplanada dos Ministérios, Bloco D, Anexo, Ala B, 4º andar, sala 433
CEP: 70043-900, Brasília - DF
https://www.gov.br/agricultura/pt-br
e- mail: cgal@agro.gov.br
Central de Relacionamento: 0800 704 1995
Equipe Técnica
Fabrício Pedrotti – Coordenador-Geral CGAL/DTEC
Marcos Vinícius de Santana Leandro Júnior – Coordenador CDL/CGAL/DTEC
Cairo Henrique Sousa de Oliveira – LFDA-GO
Carlos Eduardo Marchi – LFDA-SP
Fabricia Cristina dos Reis – LFDA-SP
Maria da Glória Trindade – LFDA-GO
Mirian de Freitas Borges – LFDA-SP
Nilson César Castanheira Guimarães – CDL/CGAL
Regina Melo Sartori Coelho – CDL/CGAL
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Macroprocesso: Laboratórios |
Objetivo: Estabelecer diretrizes para as metodologias de análise na área de microbiologia agrícola, com foco em bioinsumos, destinadas aos laboratórios oficiais e credenciados da Rede Nacional de Laboratórios Agropecuários. |
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Processo:
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Entrega:
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Público alvo e demais interessados: Laboratórios oficiais e credenciados do Ministério da Agricultura e Pecuária (MAPA) |
Versão do documento: 1 |
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Setor responsável e responsabilidades A Coordenação Geral de Laboratórios Agropecuários do Departamento de Serviços Técnicos é responsável pela elaboração, atualização e envio para aprovação deste manual, tendo responsabilidade quanto aos procedimentos descritos no documento. |
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O laboratório deve operar um sistema de gestão da qualidade em conformidade com os requisitos da norma ISO/IEC 17025, sustentado por uma política formal da qualidade e pela manutenção de manuais, procedimentos e registros continuamente atualizados. No escopo desse sistema, é essencial a implementação de uma abordagem metodológica estruturada para o gerenciamento de riscos, abrangendo aspectos como imparcialidade, confidencialidade, competência técnica, confiabilidade dos resultados, além da integridade dos equipamentos, reagentes e insumos utilizados.
Devem ser realizadas auditorias internas periódicas, com escopo abrangente e abordagem crítica, contemplando todas as etapas do processo analítico, desde o preparo de amostras até a emissão dos laudos, incluindo a revisão sistemática das metodologias empregadas e dos resultados obtidos. Para o tratamento de não conformidades, deve haver procedimento documentado que contemple sua identificação, análise de causa, implementação de ações corretivas e verificação da eficácia das medidas adotadas. Como parte da melhoria contínua, o laboratório deve conduzir revisões críticas regulares do sistema de gestão, baseadas em análise de desempenho técnico, registros de qualidade e indicadores laboratoriais.
As metodologias aplicadas para a verificação da conformidade de bioinsumos, abrangendo ensaios para as garantias de pureza do produto, concentração e identidade do ingrediente ativo, devem estar em conformidade com os métodos de referência publicados neste manual. É exigido que os laboratórios integrantes da Rede Nacional disponham de métodos confiáveis e tecnicamente validados para determinação da pureza do produto, concentração e identidade do ingrediente ativo.
Para a identificação de espécies, podem ser adotadas metodologias baseadas em reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) e/ou sequenciamento genético, de acordo com protocolos amplamente aceitos pela comunidade científica internacional. A utilização de metodologias não normalizadas – ou seja, aquelas não padronizadas por organismos internacionais ou pela legislação brasileira – requer autorização prévia do Ministério da Agricultura e Pecuária (MAPA), acompanhada de validação analítica robusta que comprove desempenho e reprodutibilidade.
Todos os métodos implementados no laboratório devem ser verificados internamente antes do uso rotineiro, com especial atenção para a avaliação de fatores que possam interferir na eficiência da extração e amplificação do DNA, como a presença de inibidores. Os parâmetros avaliados devem incluir, minimamente, sensibilidade, especificidade, robustez e reprodutibilidade, sendo documentados conforme os critérios estabelecidos no sistema de gestão.
A qualificação técnica da equipe constitui fator essencial para a confiabilidade dos resultados. Os profissionais responsáveis pelas análises devem possuir formação acadêmica compatível, capacitação contínua e experiência prática nos métodos adotados. Devem ser mantidos registros atualizados sobre a qualificação individual, histórico de treinamentos e participação em ensaios de proficiência, tanto internos quanto externos.
As instalações laboratoriais devem estar adequadas ao nível de biossegurança requerido pelas análises realizadas, garantindo a segregação física de ambientes críticos e prevenindo contaminações cruzadas ou interferência entre ensaios.
No que se refere aos equipamentos críticos, sua utilização deve estar condicionada à calibração e verificação metrológica periódica, conforme critérios de aceitação definidos no sistema da qualidade. Devem ser implementados controles internos de desempenho, especialmente para instrumentos de análise molecular ou espectrofotométrica. Os reagentes, kits e insumos laboratoriais devem possuir grau analítico adequado, com certificados de qualidade, registros completos de lote, validade, armazenamento e histórico de uso.
O recebimento e o manuseio das amostras devem seguir os critérios técnicos estabelecidos pela autoridade competente ou por protocolos oficiais, assegurando rastreabilidade plena desde o momento da recepção até a emissão dos resultados. Isso inclui documentação clara da origem, identificação, integridade e histórico de tratamento das amostras, assim como dos operadores, equipamentos e métodos utilizados. Para tanto, deve-se utilizar sistemas informatizados seguros e com controle de acesso, com políticas de backup e integridade dos dados críticos.
O controle de qualidade dos ensaios deve ser rigoroso, incluindo o uso sistemático de controles positivos, negativos e ambientais, particularmente em métodos moleculares. A performance dos métodos deve ser monitorada continuamente e reavaliada periodicamente, preferencialmente por meio de programas de proficiência interlaboratoriais ou comparações colaborativas com laboratórios de referência.
Este manual possui vigência indeterminada, sendo sua revisão prevista sempre que necessário, sob responsabilidade da Coordenação-Geral de Laboratórios Agropecuários do Departamento de Serviços Técnicos (CGAL/DTEC).
A gestão do documento, bem como o suporte técnico ao público-alvo, é atribuição da CGAL/DTEC. Dúvidas ou sugestões devem ser formalmente encaminhadas ao departamento responsável.
A publicação e atualização das versões oficiais ficam a cargo da Secretaria de Defesa Agropecuária (SDA), por meio do DTEC, na plataforma institucional.
Estabelecer e padronizar os métodos oficiais para a verificação da conformidade de bioinsumos, abrangendo ensaios para as garantias de pureza do produto, concentração e identidade do ingrediente ativo no âmbito da Rede Nacional de Laboratórios Agropecuários, integrante do Sistema Unificado de Atenção à Sanidade Agropecuária (SUASA), garantindo a harmonização técnica e a conformidade com padrões internacionais reconhecidos, como os definidos pela ISO e organismos nacionais e internacionais de referência.
A adequada condução dos ensaios microbiológicos exige a observância de boas práticas laboratoriais, que, embora não estejam descritas de forma repetitiva ao longo dos métodos apresentados neste manual, constituem requisitos fundamentais para o correto desenvolvimento das atividades analíticas e devem ser rigorosamente seguidas. Ainda que os materiais analisados não representem risco biológico elevado, a adoção dessas práticas é indispensável para garantir a qualidade e a confiabilidade dos resultados obtidos. A seguir, são destacados alguns pontos fundamentais que devem ser observados.
As análises microbiológicas e moleculares devem ser realizadas em ambientes limpos, organizados e compatíveis com cada estágio do processo. Etapas consideradas críticas devem ser realizadas em áreas fisicamente separadas ou com uso de barreiras eficazes na prevenção de contaminações cruzadas. Em especial, deve-se adotar rigorosos controles e áreas exclusivas para procedimentos envolvendo materiais com elevado potencial de dispersão, tais como esporos de microrganismos e produtos de amplificação (amplicons) de PCR. Minimamente é obrigatória a segregação de atividades que envolvam manipulação de microrganismos (diluições, inoculação, isolamentos) esporulantes e não esporulantes, extração de DNA, amplificação por PCR e eletroforese.
O fluxo de amostras deverá ocorrer de modo unidirecional entre as etapas laboratoriais (cultura → extração de DNA → PCR → pós‑PCR), respeitando a lógica dos processos microbiológicos e de biologia molecular, evitando-se qualquer retrocesso que possa comprometer a integridade analítica. Para tanto, deve-se estabelecer equipamentos dedicados, protocolos de higienização e descarte e controle de acesso de pessoal e insumos.
As superfícies de trabalho devem ser descontaminadas antes e após cada uso, utilizando soluções apropriadas denaturantes de ácido nucleico. Em áreas com manipulação de esporos resistentes, recomenda-se o uso de solução de hipoclorito de sódio a 2%, seguido de solução de etanol a 70%, podendo ser aplicados outros protocolos, de forma substitutiva ou complementar, para efetiva eliminação de contaminantes.
A abertura da embalagem primária de insumos agrícolas contendo microrganismos vivos cultiváveis em meio de cultura, assim como a realização das etapas analíticas e ensaios subsequentes, deve ser realizada exclusivamente em câmara de fluxo laminar ou em cabine de segurança biológica, sob condições assépticas e com a utilização de meios de cultura, soluções e materiais previamente esterilizados. Os insumos utilizados nos ensaios de biologia molecular adicionalmente devem estar e livres de DNase, RNase e DNA.
A limpeza regular de equipamentos como estufas, centrífugas, incubadoras e sistemas de eletroforese também é essencial para evitar acúmulo ou disseminação de contaminantes no ambiente laboratorial.
Devem ser utilizados Equipamentos de Proteção Individual (EPIs) compatíveis com as atividades executadas. Como requisitos mínimos, é obrigatório o uso de jaleco de mangas longas, luvas descartáveis sem talco e calçados fechados, mesmo quando o risco biológico for classificado como baixo. O uso adequado dos EPIs visa garantir a proteção do analista e evitar a contaminação das amostras. O profissional responsável pela execução das atividades analíticas deve manter atenção constante e postura cautelosa durante todas as etapas da operação.
Devem ser evitadas ações que possam gerar aerossóis ou respingos durante procedimentos como pipetagem, homogeneização ou abertura de frascos e tubos.
Durante o processo analítico, devem ser observadas e registradas quaisquer anormalidades na embalagem primária e/ou no conteúdo da amostra, como estufamento, vazamento, odores atípicos, alterações de aparência ou presença de corpos estranhos, bem como quaisquer ocorrências e desvios nas etapas e ensaios subsequentes.
Nos métodos analíticos descritos neste manual, não serão detalhados materiais de uso rotineiro de laboratório, exceto quando houver requisitos específicos relacionados à sua capacidade, material de fabricação ou desempenho.
Os reagentes devem apresentar grau de pureza compatível com a natureza e os requisitos do ensaio. Na ausência de especificações, recomenda-se o uso de reagentes de grau analítico adequados à microbiologia ou biologia molecular. Quando aplicável, poderá ser exigido grau de pureza superior, conforme a sensibilidade e finalidade do método.
Para a realização de diluições, devem ser utilizados recipientes (tubos ou frascos) com tampa segura e volume adequado, de modo que a suspensão (amostra + diluente) não ultrapasse dois terços da capacidade total do recipiente.
Devem ser utilizadas micropipetas calibradas cuja capacidade máxima não exceda em mais de dez vezes o volume a ser aspirado, a fim de assegurar maior precisão, reprodutibilidade e controle durante as pipetagens. É obrigatório o uso de ponteiras estéreis, compatíveis com as micropipetas usadas. Recomenda-se também que as ponteiras sejam descartáveis e com filtro em todas as etapas críticas, para prevenir contaminações cruzadas, especialmente na manipulação de ácidos nucleicos.
Devem ser incluídos controles positivos e negativos apropriados nas etapas de cultivo, extração e amplificação, com o intuito de garantir a confiabilidade dos resultados obtidos.
As informações disponíveis no item 5.2 envolvem os principais gêneros de microrganismos utilizados na produção de insumos agrícolas com microrganismos vivo cultivável em meio de cultura como ingrediente ativo.
Os métodos microbiológicos apresentam uma elevada variabilidade inerente tornando fundamental a implementação de ferramentas sistemáticas de controle voltadas tanto para o monitoramento do desempenho global quanto para a verificação contínua da validade dos resultados obtidos, buscando assegurar a validade dos resultados analíticos. Essas ferramentas devem ser apropriadas à complexidade do ensaio e compatíveis com os objetivos da análise. As principais ferramentas incluem: participação em ensaios de proficiência e/ou comparações interlaboratoriais; comparações intralaboratoriais; indicadores de desempenho; auditorias; controles (positivos, negativos); materiais de referência ou culturas padrão; cartas de controle; verificação metrológica de equipamentos críticos; reensaios e replicatas; análise crítica dos dados.
Todos os elementos considerados críticos para a análise, isto é, que podem impactar diretamente a confiabilidade, rastreabilidade ou conformidade dos resultados analíticos, devem ser submetidos a prévia verificação e aprovação, baseado em evidências objetivas, da adequação ao uso proposto.
A eliminação dos resíduos gerados durante as análises microbiológicas deve seguir a legislação ambiental vigente e as diretrizes internas do laboratório para descarte de resíduos biológicos, garantindo a segurança do ambiente e dos profissionais envolvidos.
A verificação da conformidade microbiológica de insumos agrícolas que contenham microrganismos vivos cultiváveis em meio de cultura como ingrediente ativo deve ser realizada por meio de análise laboratorial comparativa com a cepa de referência correspondente, previamente depositada em banco de germoplasma homologado pelo MAPA para a conservação de microrganismos utilizados na produção desses insumos. A informação sobre qual o banco de germoplasma está depositada determinada cepa deve vir do setor responsável pelo registro e fiscalização do insumo.
Para a realização dos ensaios, o acesso ao microrganismo declarado no produto deve ser formalmente solicitado ao banco de germoplasma responsável por sua guarda. Juntamente com o material de referência, o banco deve, no mínimo, fornecer as informações técnicas especificadas no Documento de Solicitação de Material de Referência Microbiológico, indispensáveis à identificação correta e à rastreabilidade da cepa. Todo o processo analítico de verificação da conformidade microbiológica depende da identidade correta da cepa de referência correspondente, a qual constitui o parâmetro essencial para a comparação e validação dos resultados obtidos.
O laboratório deve manter registro documentado e atualizado de todas as etapas relacionadas às cepas de referência, incluindo recebimento, preparo, armazenamento e condições associadas. Devem ser adotados procedimentos que assegurem, de forma contínua, a viabilidade, a pureza e a identidade das cepas, respeitando os limites de subcultivo, que não devem exceder cinco gerações, incluindo a cultura original. Atentar para qualquer informação relacionada a risco biológico, adotando medidas de proteção adequadas. A rastreabilidade e a autenticidade dos controles microbiológicos são essenciais para a confiabilidade dos resultados analíticos.
A amostra deve ser armazenada de acordo com as condições recomendadas pelo fabricante. Durante os procedimentos analíticos iniciais, incluindo limpeza e homogeneização da embalagem, retirada e manipulação da unidade analítica, a temperatura do ambiente não deve ultrapassar 25 °C.
A homogeneização da embalagem primária deve ser realizada de forma a garantir que a porção removida, unidade analítica, seja representativa da amostra como um todo.
Embalagens contendo produtos líquidos ou sólidos (como turfa), que possuam espaço suficiente para a homogeneização, devem ser submetidas à agitação manual, a fim de garantir a mistura homogênea do conteúdo. Caso a embalagem não disponha de espaço livre adequado para uma homogeneização eficaz, pode ser necessário abertura para facilitar o processo. Para abertura de embalagem primária respeitar procedimentos específicos, item 5.2.2.2. Após abertura deve-se optar sempre por procedimentos de manipulações que otimize homogeneização e minimize a exposição do conteúdo. Dependendo das circunstâncias, pode ser suficiente criar uma pequena abertura para permitir a entrada de ar. Em outras situações, pode ser necessário realizar uma abertura maior, a fim de agitar o conteúdo com um bastão ou espátula, ou até mesmo transferir o material para um recipiente adequado, como um béquer, que permita a mistura eficaz do conteúdo.
A abertura de embalagens primárias deve ser obrigatoriamente realizada em câmara de fluxo laminar ou cabine de segurança biológica, utilizando técnicas assépticas e material estéril. Antes de ingressar nesse ambiente controlado, é necessário realizar a desinfestação externa da embalagem primária do produto (pacote, sachê, bolsa, bexiga ou frasco) com algodão ou papel toalha embebido em solução de álcool 70%.
Homogeneizar novamente amostra que permitam à agitação manual, para garantir uma boa uniformidade do conteúdo.
Para abertura de embalagens flexíveis e sem ponto de acesso (tampas), cortar com uma tesoura estéril abrindo conforme a necessidade de acesso ao conteúdo (apenas coleta ou homogeneização e coleta). No caso de embalagens rígidas com tampa rosqueável, desrosquear e remover a tampa. Caso exista uma selagem de segurança realizar o rompimento com cuidado para evitar respingos.
A técnica de Contagem de Unidades Formadoras de Colônia (UFC) tem como finalidade quantificar microrganismos viáveis presentes em uma amostra, por meio da formação de colônias visíveis em meio de cultura sólido. Trata-se de uma estimativa direta e funcional da viabilidade celular, baseada na capacidade de microrganismos viáveis, isolados ou em agrupamentos, formarem colônias distintas após incubação sob condições controladas. Cada colônia é considerada originada de uma unidade viável, permitindo expressar o resultado em UFC por grama ou mililitro. A contagem de UFC constitui uma etapa fundamental na avaliação da conformidade de insumos agrícolas que contenham microrganismos vivos cultiváveis como ingrediente ativo.
Ressalta-se a importância da homogeneização da amostra e da coleta da unidade analítica como etapas essenciais para assegurar a representatividade dos resultados. A homogeneização adequada tem como objetivo garantir que a porção retirada, seja por volume ou pesagem utilizando instrumentos calibrados, reflita com precisão a composição da amostra como um todo. Qualquer falha nas etapas relacionadas às medições metrológicas pode comprometer a confiabilidade dos resultados.
De cada amostra, serão retiradas duas unidades analíticas para a constituição de duas séries de diluição, denominadas série A e série B, preparadas simultaneamente. Cada unidade analítica será diluída em solução diluente para a obtenção da suspensão inicial. Ver Recomendações para microrganismo alvo (ensaio concentração), quanto a solução diluente indicada para o microrganismo ingrediente ativo do insumo analisado.
Após a retirada das unidades analíticas, o material remanescente deve ser mantido em sua embalagem original até o momento do descarte adequado.
Com auxílio de micropipeta e ponteira estéril, subtrair uma alíquota de 1,0 mL da diluição 10-1 e transferir para um tubo/frasco contendo 9,0 mL de solução fisiológica, formando a diluição 10-2.
Repetir o procedimento acima, conforme a Figura 1. A concentração declarada no registro do produto determina o número de diluições a ser realizado, sendo recomendável acrescentar uma diluição adicional a fim de assegurar uma contagem adequada, caso o produto esteja com a concentração superior ao valor garantido.
Em cada procedimento de transferência da alíquota de 1,0 mL, descartar a ponteira utilizada e agitar o tubo em agitador tipo vórtex por 20 segundos, cuidando para que o intervalo entre a homogeneização e a coleta da alíquota seja mínimo.
Figura 1: Esquema ilustrativo da preparação de diluições decimais sucessivas.
Devem ser incluídas placas de controles negativo e positivo no ensaio. Os controles negativos estão conformes quando visualmente não for detectado crescimento de microrganismos. O controle positivo apresenta conformidade quando for detectado crescimento de colônias típicas da cepa referência inoculada, sem a presença de contaminantes. Em casos de desvios avaliar possíveis causas e necessidade de repetição do ensaio.
Tabela 01 – Controles microbiológicos no ensaio de determinação de UFC.
| Controles | |||
| Negativos (Brancos) | Esterilidade do meio de cultura | 2 placas | Contendo apenas o meio de cultura. |
| Ambiental | 1 placa | Abrir 1 (uma) placa na câmara de fluxo laminar ou cabine de segurança biológica durante o período de distribuição das soluções nos tubos de ensaio ou frascos de diluição, a fim de monitorar possíveis contaminações ambientais. | |
| Solução de diluição e materiais | 3 placas | Pipetar 0,1 mL de solução fisiológica, distribuída com espalhador estéril, para verificar a esterilidade dos materiais e da solução utilizados. | |
| Positivo | 1 placa | Estriar a cepa de referência do microrganismo declarado no insumo, com o objetivo de verificar o meio de cultura e o processo de incubação. | |
Todas as placas de Petri devem ser devidamente identificadas de forma clara, legível e indelével.
As placas devem ser incubadas de acordo com as condições específicas recomendadas para o microrganismo ingrediente ativo do insumo analisado. O período de incubação necessário para a contagem das Unidades Formadoras de Colônia (UFC) poderá variar conforme o microrganismo. As orientações específicas para microrganismos dos principais gêneros utilizados na fabricação de insumos agrícolas estão estabelecidas nas Recomendações para microrganismo alvo (ensaio concentração).
Como procedimento padrão, as placas de Petri devem ser incubadas na posição invertida, com a tampa voltada para baixo, a fim de evitar a condensação e o gotejamento sobre o meio de cultura. Para favorecer a homogeneidade térmica em incubadoras sem sistema de circulação de ar, recomenda-se o empilhamento máximo de seis placas e espaçamento mínimo de 2 cm entre pilhas. Pilhas mais altas com menor espaçamento podem ser aceitáveis em incubadoras equipadas com sistemas circulação de ar. Quando for necessário reduzir o risco de contaminações cruzadas, como em análises que envolvem microrganismos esporulantes, ou minimizar a perda de umidade do meio durante períodos prolongados de incubação, pode-se considerar a vedação das placas com filme plástico semipermeável (por exemplo, filme de PVC ou parafilme), desde que se mantenha a troca gasosa adequada ao crescimento microbiano. Deve-se evitar movimentação de placas inoculadas com microrganismos esporulentes até o momento da contagem. Ressalva-se que microrganismos específicos podem requerer condições diferenciadas de incubação.
Deve-se iniciar um monitoramento das placas a partir do dia seguinte à inoculação. Para microrganismos de crescimento rápido, como os pertencentes ao gênero Bacillus, pode ser necessário planejar o horário de plaqueamento de forma a possibilitar a primeira observação com menos de 24 (vinte e quatro) horas após a inoculação.
A contagem de UFC pode ser realizada manualmente, com o auxílio de contadores de colônias tradicionais. Também é permitida a utilização de contadores automáticos, desde que o processo de contagem esteja previamente validado para o microrganismo-alvo, no respectivo meio de cultura utilizado no ensaio.
Para a contagem, deve-se verificar se a relação entre as diluições está conforme o esperado e considerar a diluição cuja média do número de UFCs das três repetições esteja dentro da faixa de 30 a 300 UFCs. No caso específico de fungos, admite-se considerar a diluição cuja média do número de UFCs das três repetições esteja dentro a faixa de 15 a 150 UFCs, em razão da dificuldade de quantificação precisa quando há grande número de colônias.
Caso nenhuma das diluições sucessivas se enquadre nesse critério, deve-se calcular a média das duas diluições mais próximas da faixa de contagem.
Caso uma das três repetições apresente discrepância superior a 50% em relação à média das outras duas, ela deve ser desconsiderada no cálculo da média.
Deve-se observar nas placas os diferentes padrões morfológicos de colônias presentes. Essa avaliação tem início com a análise das características morfofisiológicas das colônias, incluindo atributos visuais como formato, borda, elevação, coloração e textura, bem como aspectos como o tempo de crescimento, presença de halos e zonas de interação com o meio de cultura. Esses critérios são fundamentais para a diferenciação preliminar entre o microrganismo declarado como ingrediente ativo e possíveis colônias contaminantes. Ferramentas de microscopia podem ser utilizadas como suporte à avaliação morfológica. Ressalta-se que as características apresentadas pelas colônias podem variar significativamente em função da formulação do produto, o que demanda uma análise criteriosa.
A contagem das colônias deve ser registrada de forma adequada para garantir a rastreabilidade, a inclusão de imagens pode facilitar o processo. As colônias devem ser classificadas de acordo com o padrão morfofisiológico observado, uma vez que a identificação definitiva do microrganismo declarado como ingrediente ativo somente poderá ser confirmada após os ensaios de identificação. Na amostragem para identificação devem estar contemplados os diferentes padrões observados, sempre que possível com repetições, incluindo: colônias morfofisiologicamente semelhantes às esperadas para o microrganismo declarado; colônias com morfofisiologia atípica; e colônias suspeitas de serem contaminantes. Em amostras com homogeneidade morfofisiológica das UFCs, o limite mínimo de UFCs a ser identificado deve corresponder ao triplo do número de microrganismos declarados. A amostragem pode ser ampliada conforme necessário, a fim de garantir a representatividade da diversidade microbiológica presente e dirimir dúvidas.
Nota: Em análises microbiológicas de insumos que contenham duas cepas da mesma espécie, condição comum no mercado, e apresentam morfologia semelhante, recomenda-se a amostragem de no mínimo oito (8) colônias para identificação, visando aumentar a probabilidade de detecção de ambas as cepas. Estimativas probabilísticas indicam que, ao selecionar 8 colônias de uma placa com média de 40 UFC na diluição 10⁻⁷, a chance de identificar ao menos uma colônia distinta atinge 99,8% quando as estirpes estão em proporção igual (1:1) e 60,7% quando em desproporção (1:9). Dessa forma, esse número mínimo de colônias oferece um equilíbrio entre viabilidade analítica e representatividade da diversidade presente no produto.
A identificação das colônias é etapa obrigatória para a confirmação da identidade do microrganismo quantificado. O microrganismo declarado como ingrediente ativo deve ser identificado por meio de técnicas analíticas validadas, capazes de comprovar a correspondência com a cepa de referência, bem como de diferenciá-lo de outras cepas da mesma espécie e de cepas de outras espécies com características morfofisiológicas semelhantes. A técnica empregada deve possibilitar discriminação genética em nível intraespecífico, apresentar sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade adequadas, e utilizar controle positivo proveniente de banco de germoplasma homologado pelo MAPA. A técnica de rep-PCR (Repetitive Element Palindromic PCR), descrita no item 5.2.4.2 deste manual, é recomendada para análises de rotina, por ser simples e efetiva para esse fim, promovendo a diferenciação genética por meio do perfil de DNA (“DNA fingerprinting”) gerado pela amplificação de regiões repetitivas no genoma.
O número de UFC por grama ou mililitro de amostra é calculado pela fórmula:
Como exemplo, considerando-se a inoculação de 0,1 mL das diluições 10-5, 10-6 e 10-7, o cálculo pode ser efetuado empregando-se os fatores da Tabela 02.
Tabela 02 – Cálculo do número de UFC a partir das diluições decimais (10-5, 10-6 e 10-7).
| Diluição | Fator (f) | Nº de UFC/g ou mL de inoculante |
| 10-5 | 106 | N x 106 |
| 10-6 | 107 | N x 107 |
| 10-7 | 108 | N x 108 |
O resultado final da contagem do microrganismo declarado para cada amostra deve ser expresso como a média dos resultados obtidos nas duas séries de diluição (A e B). Para os ensaios que foram aplicados mais de um meio de cultura, e o insumo apresenta uma única garantia global de concentração, o resultado deverá ser expresso como a soma das concentrações obtidas para cada microrganismo declarado como ingrediente ativo.
Placas de Petri com crescimento de colônias que não puderem ser analisadas imediatamente após a incubação devem ser refrigeradas (5 °C ± 3 °C) por até 24 horas, de forma excepcional, para evitar coalescência de colônias. Essa prática não deve ser adotada rotineiramente, nem utilizada quando a refrigeração puder comprometer a contagem ou a morfologia das UFCs.
O ensaio de pureza microbiológica tem como finalidade verificar a ausência de microrganismos não declarados como ingrediente ativo em insumos agrícolas à base de microrganismos vivos cultiváveis, considerando o limite de tolerância estabelecido. O método fundamenta-se na técnica de espalhamento em meio de cultura sólido, com avaliação das colônias presentes na diluição 10-5, a partir de duas séries independentes de diluições (A e B). A presença de colônia(s) com identidade distinta(s) da(s) esperada(s) caracteriza contaminação do produto. Avaliar a necessidade do plaqueamento em outros meios de cultura não seletivos, para detecção contaminantes.
As mesmas séries de diluições preparadas para a determinação da concentração de UFC podem ser aproveitadas, utilizando-se, por exemplo, a diluição 10⁻⁵. Quando o ensaio de determinação da pureza for realizado de forma independente, devem ser seguidos os procedimentos descritos para preparação da suspensão inicial, realização das diluições e plaqueamento em placas de Petri.
Os controles microbiológicos devem ser conduzidos conforme estabelecido. Quando utilizadas as mesmas séries de diluições da determinação da concentração do inoculante, os controles positivo e negativos poderão ser compartilhados.
A incubação deve seguir os procedimentos descritos, com monitoramento contínuo das placas ao longo do período. Deve-se registrar detalhadamente quaisquer desvios em relação ao esperado, tais como ausência ou antecipação do crescimento, bem como o surgimento de colônias com características morfofisiológicas distintas daquelas previstas para o(s) microrganismo(s) declarado(s).
As colônias presentes nas placas inoculadas com a diluição 10-5 devem ser avaliadas, inicialmente com base em suas características morfofisiológicas, tais como formato, borda, elevação, coloração, textura, tempo de crescimento e presença de halos ou zonas de interação com o meio de cultura. Ocorrências registradas durante a incubação devem sem consideradas. Essa análise constitui a primeira etapa do processo de diferenciação entre o(s) microrganismo(s) declarado(s) e possíveis contaminantes. Podem ser usadas ferramentas de microscopia para complementar a análise morfológica.
Em determinadas situações, a análise de pureza pode ser concluída com base na avaliação morfofisiológica das colônias, quando forem observadas divergências inquestionáveis em relação às características esperadas para o microrganismo declarado. Exemplos incluem a presença de colônias fúngicas em produtos cujo ingrediente ativo é bacteriano, ou vice-versa, bem como o surgimento de colônias em tempo de incubação claramente incompatível com o perfil de crescimento do microrganismo declarado.
Ressalta-se que a morfologia das colônias de microrganismo declarado como ingrediente ativo pode apresentar variações significativas em função da formulação do insumo. Assim, a análise deve ser criteriosa, colônia apresentando qualquer aspecto morfofisiológico distinto deve ser devidamente amostrada para seguir no processo de determinação da identidade. Pode ser necessário uma etapa de estriamento da colônia em uma nova placa de Petri, contendo o mesmo meio e incubada nas mesmas condições, para promover seu isolamento.
O processo de identificação das colônias deve ser finalizado por meio da aplicação de técnicas analíticas apropriadas, capazes de confirmar a identidade da cepa declarada como ingrediente ativo, por comparação com controle positivo obtido diretamente do banco de germoplasma de depósito. Essas técnicas devem também permitir a diferenciação genética intraespecífica. A presença de colônias com resultado de identidade distinto do controle positivo caracteriza contaminação por microrganismos não declarados.
O resultado da análise de determinação da pureza microbiológica será considerado conforme quando nenhuma colônia contaminante for observada nas placas correspondentes à diluição 10-5. A presença de uma única colônia identificada como distinta do microrganismo declarado em qualquer uma das placas caracteriza não conformidade.
Esta determinação tem como objetivo confirmar a identidade genética do microrganismo isolado do insumo agrícola, verificando sua conformidade com o ingrediente ativo declarado, por comparação com material de referência obtido do Banco de Germoplasma de depósito. A identificação é realizada por meio da técnica de REP-PCR (Repetitive Extragenic Palindromic - Polymerase Chain Reaction), que gera perfis de “impressão digital” do genoma, permitindo a diferenciação intraespecífica. Trata-se de uma metodologia molecular altamente discriminatória, baseada na amplificação de sequências repetitivas naturalmente presentes no genoma.
Para a obtenção de resultados válidos em análises comparativas utilizando a técnica de rep-PCR, é fundamental assegurar a repetibilidade e a acurácia dos perfis eletroforéticos gerados. Para isso, devem ser observados os seguintes requisitos:
Para a identificação dos microrganismos presentes em insumos agrícolas à base de microrganismos vivos cultiváveis, o DNA genômico deve ser extraído a partir de UFCs representativas, isoladas nos ensaios de determinação da concentração e/ou de pureza microbiológica. Conforme situação, uma amostragem adequada deve incluir UFCs com morfologia típica do(s) microrganismo(s) declarado(s), UFCs com características morfológicas distintas e aquelas sob suspeita de representar contaminação.
A extração do DNA pode ser realizada diretamente a partir da UFC isolada. Quando o método de extração exigir maior quantidade de material biológico, a UFC pode ser previamente inoculada em meio líquido estéril com composição nutricional equivalente ao meio sólido utilizado, sendo o cultivo incubado sob condições apropriadas para multiplicação celular. O cultivo resultante deve ser utilizado como matriz para a extração.
Deve-se extrair o DNA genômico da cepa referência, controle positivo, a partir de colônia pura cultivada em meio sólido ou de cultivo em meio líquido estéril com composição nutricional equivalente, conforme as exigências do método de extração adotado.
A extração de DNA genômico pode ser realizada por métodos clássicos, por kits comerciais validados ou por sistemas automatizados de extração, desde que previamente validados quanto ao seu desempenho e aprovados para atender aos parâmetros necessários, preferencialmente em cabine de segurança biológica, mínimo Classe II, B1.
As Figuras 1, 2, 3 e 4 apresentam diferentes métodos de extração de ácido nucleico validados para distintas matrizes.
Figura 1. Extração de ácido nucleico pelo método CTAB modificado (fase 1), aplicado a amostras de folhas e isolados de agentes patogênicos.
Figura 2. Extração de ácido nucleico utilizando kit com coluna, aplicada a isolados de microrganismos (Referência: DNeasy Mericon Food, Qiagen).
Figura 3. Extração de ácido nucleico utilizando kit com coluna, aplicada a amostras de insetos (Referência: DNeasy Mericon Food, Qiagen).
Figura 4. Extração de ácido nucleico (DNA/RNA) por meio de beads magnéticas, aplicada a diferentes tipos de matriz, incluindo matrizes complexas (Referência: Kit Maxwell® RSC PureFood GMO and Authentication, Sistema Maxwell, Promega).
Quando necessário, as amostras extraídas são quantificadas utilizando espectrofotometria ou fluorimetria.
A quantificação é realizada com base na absorbância dos ácidos nucleicos, especialmente em 260 nm. O equipamento faz leituras nos comprimentos de onda 230, 260, 280 e 320 nm para cálculo da concentração e pureza. A concentração é calculada usando a equação de Beer-Lambert, com fatores específicos para cada tipo de ácido nucleico (DNA fita dupla, fita simples, RNA).
Para análise:
A quantificação por fluorimetria utiliza a fluorescência emitida pela amostra, proporcional à concentração do ácido nucleico.
Para análise:
No link encontra-se descrição básica da composição da reação de amplificação utilizada nos ensaios de rep-PCR, aplicável aos principais gêneros de microrganismos utilizados como ingredientes ativos em insumos. Ressalta-se que essa composição tem caráter orientativo, podendo ser ajustada conforme as especificações dos reagentes utilizados.
Nota: A adoção de reagentes comerciais otimizados na etapa de amplificação por PCR é recomendada, especialmente aqueles que contribuam para a redução de erros de pipetagem e do risco de contaminações. Como exemplo, kit reação de amplificação por PCR prontos para uso, compatíveis ou não com adição direta de amostra (sem extração de DNA), enzimas de amplificação com diferentes sistemas de ativação e capacidade de processamento, reagentes para otimizar amplificação. A seleção e o uso desses insumos devem ser precedidos de validação interna no laboratório, considerando as recomendações dos fabricantes, as características do microrganismo-alvo e a finalidade analítica do ensaio, que no caso do rep-PCR é a geração de perfis eletroforéticos de qualidade adequada para análise comparativa.
Para preparação da reação de amplificação por PCR retire todos os componentes da PCR do congelador. Os reagentes devem ser mantidos em gelo ou em suporte refrigerado (tipo cooler) para o preparo da reação, evitando a degradação dos componentes termo-sensíveis.
É essencial realizar a homogeneização de todos os componentes da reação de PCR após o descongelamento, uma vez que pode ocorrer separação de fases, mesmo que não seja visível. A falta de homogeneização adequada pode comprometer a eficiência da reação, resultando em bandas fracas, ausência de amplificação ou perfis não reprodutíveis. Cada reagente deve ser homogeneizado individualmente antes do uso, bem como a mistura final da reação. A homogeneização deve ser feita suavemente, evitando a formação de bolhas, preferencialmente por meio de pipetagem lenta (movimentos “up and down”) com micropipeta de volume compatível.
Os volumes dos reagentes devem ser ajustados com base em suas concentrações e no volume final da reação de PCR, garantindo-se a proporção correta de cada componente na mistura.
A preparação da reação de amplificação deve considerar o número total de reações a serem executadas, acrescida de 10% de volume adicional para compensar perdas decorrentes de erros de pipetagem.
Após homogeneização, a mistura de reação deve ser aliquotada em microtubos de 0,2 mL ou 0,5 mL, previamente identificados.
Devem ser incluídos nos ensaios os tubos-controle processados em paralelo com as amostras. Quando ocorrer perfis falhos ou inconsistentes nos controles de extração e controle(s) positivo(s) ou quando for detectada amplificação no controle negativo deve-se avaliar as causas, corrigir possíveis fontes de desvios e repetir o ensaio.
Tabela 03 – Controles experimentais nos ensaios de rep-PCR.
| Controles | |
| Extração | Reação com alíquota da solução de DNA de cepa referência (correspondente a ingrediente ativo declarado) submetida ao mesmo protocolo de extração da amostra sob análise. |
|
Negativo
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Mistura de reação contendo todos os reagentes, exceto o DNA molde (adicionar água livre de DNA ou tampão). Serve para detectar contaminação de reagentes ou ambiente, no preparo da reação de amplificação, e confirmar que os sinais obtidos nas amostras são resultado exclusivo da amplificação do DNA alvo. Nenhuma banda deve observada após a eletroforese. |
|
Positivo
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Reação com alíquota da solução de DNA da cepa referência. Podendo ser a duplicata do controle de extração ou solução de DNA previamente extraído. Serve para confirmar que os reagentes da PCR, o equipamento térmico e as condições do ensaio estão conformes. |
Os microtubos contendo a reação de amplificação devem ser mantidos em gelo ou em rack tipo cooler térmico.
O volume total da reação (mistura de amplificação + solução de DNA genômico) não deve ser inferior a 20 µL.
A quantidade recomendada de DNA genômico extraído a ser adicionada por reação varia entre 20 e 100 ng, sendo o volume correspondente da solução de DNA, em geral, próximo de 5% do volume total da reação, não devendo ultrapassar 20%, a fim de evitar diluição excessiva dos componentes da mistura.
Com o objetivo de otimizar o tempo de análise, amostras de DNA obtidas por métodos que forneçam soluções de qualidade presumidamente adequada podem ser encaminhadas diretamente à reação de amplificação, sem a obrigatoriedade de quantificação prévia da concentração e da pureza. Contudo, na ocorrência de falhas na amplificação ou de perfis eletroforéticos inconsistentes ou inadequados, recomenda-se proceder à avaliação da solução de DNA quanto à sua concentração e pureza, por meio de espectrofotometria (relações A260/A280 e A260/A230) e/ou análise em gel de agarose, visando verificar se os parâmetros estão dentro dos limites aceitáveis para o ensaio.
A etapa de eletroforese pode ser realizada em gel de agarose, permitindo a separação dos fragmentos amplificados com resolução adequada para análise comparativa dos perfis genéticos. Sistemas automatizados de eletroforese, como a eletroforese capilar, podem ser utilizados desde que previamente avaliados quanto ao desempenho analítico e validados para atender aos critérios de repetibilidade, resolução e fidelidade necessários à geração de perfis eletroforéticos compatíveis com a finalidade do ensaio.
A ordem de aplicação das amostras deve ser registrada em formulário específico, indicando-se claramente a posição de cada amostra, bem como a dos controles positivos, negativos e dos padrões de peso molecular.
O gel deve ser preparado com agarose tipo I-A, com baixa eletroendosmose (low EEO) na concentração de 1,5% (m/v) em tampão TBE (Tris-Borato-EDTA) 1X. A utilização de agarose tipo I-A com baixa eletroendosmose é recomendada para garantir maior resolução dos fragmentos de DNA.
A dissolução da agarose deve ser realizada em frasco apropriado, com aquecimento gradual, em forno de micro-ondas ou banho-maria, até a completa homogeneização da solução. Após resfriamento a aproximadamente 50 a 60 °C, o gel deve ser vertido na cuba de eletroforese contendo pente compatível com o número e o volume das amostras.
A dimensão do gel de agarose pode variar de acordo com a necessidade, sendo que para o comprimento recomenda-se um mínimo de 15 cm, de modo a favorecer a separação eficiente dos fragmentos amplificados por rep-PCR. Géis mais longos permitem maior resolução dos fragmentos de DNA, promovendo melhor distinção entre bandas com pesos moleculares próximos. Contudo, apresentam como desvantagem o aumento do tempo de corrida, o que pode ocasionar gradientes de pH ao longo do tampão, formação de zonas de condensação, aumento da temperatura do sistema e consequente perda de nitidez nas bandas. Por outro lado, géis mais curtos reduzem o tempo de corrida e minimizam os efeitos de variação de pH e aquecimento, mas comprometem a resolução entre fragmentos de tamanhos semelhantes.
Após a solidificação completa do gel de agarose, deve-se adicionar tampão TBE 1X sobre os poços, de forma a preenchê-los antes da aplicação das amostras. Este procedimento pode ser realizado com o gel ainda fora da cuba de eletroforese ou após sua acomodação na cuba (gel totalmente coberto pelo tampão condutor), para garantir que o ambiente onde a amostra será depositada esteja hidratado e saturado com íons, facilitando a entrada suave da amostra e a condução elétrica uniforme desde o início da corrida.
Após a amplificação, deve-se adicionar tampão de carregamento ao produto de PCR na proporção recomendada pelo fabricante do reagente.
A mistura deve ser homogeneizada cuidadosamente, preferencialmente por movimentos suaves de aspiração e dispensação com micropipeta (movimentos “up and down”) ou, alternativamente, com auxílio de agitador tipo vortex em baixa rotação, evitando formação de bolhas ou degradação do DNA.
A amostra deve ser aplicada cuidadosamente nos poços do gel de agarose, garantindo que a ponta da micropipeta esteja posicionada dentro do poço, sem perfurar o fundo do gel nem derramar conteúdo fora do poço, o que pode comprometer a definição das bandas e a qualidade do resultado da eletroforese.
Deve-se aplicar padrão de peso molecular (DNA ladder) compatível com a análise dos fragmentos gerados por rep-PCR em canaletas posicionadas antes e depois das amostras e controles, podendo-se incluir aplicações adicionais em posições intermediárias, conforme a quantidade de amostras e a necessidade de orientação na análise comparativa. Recomenda-se que o marcador contenha, no mínimo, dez bandas distintas e bem definidas, distribuídas em uma faixa de separação compreendida entre 200 pb e 3.000 pb, a fim de permitir adequada estimativa do tamanho dos fragmentos amplificados. Devem ser seguidas as instruções do fabricante quanto ao preparo, volume e forma de aplicação do padrão.
A voltagem aplicada deve ser de aproximadamente 5 V/cm, calculada com base na distância efetiva entre os eletrodos da cuba de eletroforese. A corrida deve ser realizada à temperatura ambiente, por tempo suficiente para garantir a separação adequada dos fragmentos, recomendando-se duração não inferior a 3 horas. A progressão da migração deve ser monitorada por meio do corante de carga, de modo a evitar que os fragmentos ultrapassem o limite do gel. O tempo de eletroforese influencia diretamente a resolução dos perfis eletroforéticos, tempos mais longos favorecem a separação entre bandas próximas, aumentando a capacidade de discriminação entre fragmentos de tamanhos similares. Entretanto, esse tempo deve ser cuidadosamente otimizado, uma vez que a migração excessiva pode comprometer a definição das bandas, resultando em perda de nitidez e dificultando a interpretação dos perfis obtidos.
Devido ao tempo prolongado comumente necessário para a técnica de rep-PCR, recomenda-se a utilização de cubas com sistema de recirculação do tampão, a fim de manter estáveis a temperatura e o pH durante toda a corrida. Essa prática contribui para a qualidade e a reprodutibilidade da separação eletroforética.
Após a eletroforese, submeter o gel à coloração em solução de corante fluorescente adequado à visualização de ácidos nucleicos, seguindo rigorosamente as instruções do fabricante. A coloração deve ser realizada após a corrida eletroforética, por meio de imersão (banho), uma vez que a adição do corante ao gel antes da corrida pode interferir na migração dos fragmentos de DNA e comprometer a resolução dos perfis.
Utilizar preferencialmente corantes fluorescentes de alta sensibilidade e baixa toxicidade, compatíveis com sistemas de excitação por luz ultravioleta (UV) ou por LED azul, que possibilitem a visualização nítida de fragmentos de DNA em ampla faixa de tamanhos, incluindo capacidade de detecção de fragmentos em baixa concentração e pequenos (≤ 300 pb). A visualização deve ser realizada em transiluminador adequado ao corante empregado, com filtros compatíveis com o comprimento de onda de excitação recomendado, de modo a garantir a nitidez e a segurança na análise.
A documentação da imagem do gel deve ser realizada por sistema de fotodocumentação digital que garanta alta qualidade de imagem, fidelidade dos perfis eletroforéticos e rastreabilidade dos dados analíticos. Recomenda-se que o sistema inclua software próprio para aquisição, arquivamento e organização das imagens, com recursos automáticos de controle de exposição, foco e contraste. As imagens devem ser obtidas com resolução mínima de 300 dpi e profundidade de cor de, preferencialmente, 16 bits, assegurando definição espacial e sensibilidade adequadas à detecção e análise das bandas.
Após a corrida da PCR os produtos são multiplexados. As condições de volume da PCR conforme intensidade do fluoróforo e respectivas diluições também estão estabelecidas no protocolo de validação do método.
Após multiplexar os produtos da PCR a microplaca contendo os produtos multiplexados deve ser homogeneizada no agitador de placas por aproximadamente dois minutos e pulsada em centrífuga para que sejam realizadas as diluições de forma a não estourar a capacidade de leitura do instrumento. Entre as diluições repetir o mesmo procedimento de homogeneização e pulsagem da microplaca. Finalizando a última diluição, preparar o mix de carregamento composto por formamida e LIZZ Standard calculando-se o número de poços de corrida com um excesso em conformidade com as informações estabelecidas. Anotar o preparo da solução que deve ser pipetada na microplaca seguida da adição do produto da PCR e levada para o termociclador para linearizar o ácido nucleico pelo aquecimento da placa a 97°C por 3 minutos, seguido de resfriamento a 4°C por 3 min (etapa da formamida). Carregar a placa no instrumento Genetic Analyzer no módulo de análise de fragmentos.
As amostras eluídas podem ser colocadas diretamente no sequenciador. Siga as instruções para manipulação do instrumento conforme estabelecido no protocolo interno e nos tutoriais do instrumento.
A comparação deve ser feita entre o perfil obtido da UFC isolada do insumo agrícola e o perfil da cepa de referência. A técnica gera um perfil eletroforético característico para cada cepa, com alta repetibilidade quando as condições do ensaio são mantidas constantes. Esses perfis permitem a diferenciação intraespecífica entre microrganismos.
É importante ressaltar que variações nas condições do ensaio podem impactar o padrão de bandas obtido. Por esse motivo, recomenda-se que a análise comparativa seja realizada apenas entre perfis gerados no mesmo ensaio padronizado, de modo a minimizar interferências experimentais.
Além disso, os dados obtidos ao longo dos ensaios para isolamento das UFCs, incluindo características morfológicas, fisiológicas e de crescimento observadas nas etapas anteriores, devem ser considerados na análise e interpretação dos perfis eletroforéticos. A integração dessas informações auxilia na verificação da consistência do resultado, contribuindo para uma identificação microbiológica mais robusta e tecnicamente fundamentada.
Na rotina laboratorial, os perfis eletroforéticos obtidos por rep-PCR podem ser avaliados visualmente. Quando for necessária a determinação do tamanho dos fragmentos, cálculo de similaridade e construção de dendrogramas, deve-se utilizar software específico.
Tabela 04 – Critérios de avaliação na comparação visual de perfis eletroforéticos.
| Critérios de avaliação na comparação visual de perfis eletroforéticos | |||
| Perfis | Resultado | Interpretação | Conclusão |
| Indistinguível (idênticos) | Mesmo padrão de bandas em número, posição e intensidade, sem diferenças visíveis. | Indicam equivalência genética, dentro dos limites da técnica, entre o isolado do insumo agrícola e a cepa de referência. | Conforme com o ingrediente ativo declarado |
| Distintos | Diferenças evidentes no número, posição ou padrão das bandas em relação à cepa de referência. | Indicam que o isolado do insumo agrícola é, dentro dos limites da técnica, geneticamente diferente da cepa de referência. | Não conforme com o ingrediente ativo declarado |
| Similares | Similaridade no padrão de bandas, com presença de variações - banda(s) adicional(is), ausente(s), com leve diferença de posição. | Resultado inconclusivo. | Deve-se investigar as causas e repetir o ensaio. |
| Baixa resolução | Bandas fracas, difusas, ausentes ou insuficientes para análise conclusiva. | Resultado inconclusivo. | Deve-se investigar as causas e repetir o ensaio. |
As imagens dos géis de eletroforese devem ser analisadas utilizando software específico para análise de bandas, com capacidade de detecção, alinhamento intra-gel, estimativa de peso molecular e comparação de perfis. Todas as amostras, podendo incluir isolado do insumo agrícola, as cepas de referência e os controles, devem ser processadas no mesmo gel, permitindo a comparação direta dos perfis eletroforéticos sob as mesmas condições analíticas.
A comparação dos perfis deve ser realizada com base na similaridade ou dissimilaridade dos padrões de bandas, utilizando os seguintes critérios:
A estimativa do peso molecular das bandas deve ser realizada por interpolação, com base na migração de marcadores de peso molecular aplicados no mesmo gel. Recomenda-se a inclusão de marcadores de peso molecular a cada conjunto de até oito canaletas, para garantir a precisão local das estimativas de tamanho das bandas. Devem ser incluídos controles positivos e negativos no gel, preferencialmente nas extremidades e/ou intercalados entre as amostras. Também é recomendada a inclusão de replicatas técnicas para verificação da reprodutibilidade dos perfis obtidos.
O limiar de detecção de bandas (threshold) deve ser ajustado no software de modo a excluir ruídos de fundo e artefatos. Os resultados da segmentação das bandas pelo software devem ser validados visualmente pelo analista, para garantir a fidelidade da detecção automática às imagens reais do gel.
Tabela 05 – Critérios de avaliação de perfis eletroforéticos com base em coeficientes de similaridade.
| Critérios de avaliação com base nos coeficientes de similaridade | ||||
| Coeficiente de Similaridade (CJ) | Coeficiente de Dissimilaridade (CD = 1 - CJ) | Resultado | Interpretação | Conclusão |
| CJ ≥ 0,80 | CD ≤ 0,20 | Alta Similaridade Intraespecífica | Indicam equivalência genética, dentro dos limites da técnica, entre o isolado do insumo agrícola e a cepa de referência. | Conforme com o ingrediente ativo declarado |
| CJ < 0,80 | CD > 0,20 | Baixa Similaridade Intraespecífica | Indicam que o isolado do insumo agrícola é, dentro dos limites da técnica, geneticamente diferente da cepa de referência. | Não conforme com o ingrediente ativo declarado |
Os resultados obtidos por análise digital devem ser interpretados em conjunto com a avaliação visual descrita no item anterior, especialmente em casos limítrofes ou com baixa resolução analítica (resolução marginal). Coeficientes de similaridade inconclusivos, ambíguos ou incoerentes devem ser inicialmente verificados quanto à possibilidade de falhas na interpolação dos dados ou na detecção automática de bandas. Nessas situações, as possíveis causas devem ser investigadas, incluindo revisão dos parâmetros de segmentação, qualidade da imagem, aplicação do marcador e distribuição das amostras no gel. Quando identificadas falhas que comprometam a análise, o ensaio deve ser repetido (todo ou em parte) com revisão dos pontos críticos do processo.
A interpretação dos perfis eletroforéticos obtidos por REP-PCR requer atenção aos limites da técnica e às condições experimentais. Algumas situações podem resultar em dúvidas quanto à identidade do microrganismo isolado, exigindo medidas adicionais de verificação. Procedimentos gerais recomendados:
Na comparação de perfis moleculares, é fundamental considerar aspectos técnicos e biológicos que impactam a correta interpretação dos resultados:
Nota: No desenvolvimento de novos ingredientes ativos à base de microrganismos vivos cultiváveis em meio de cultura para insumos de uso agrícola, é necessário realizar caracterização que comprove a inovação por sua diferenciação em relação a outros ingredientes ativos já registrados junto ao Ministério da Agricultura e Pecuária (MAPA). Essa distinção deve ser inequívoca, permitindo a identificação eficaz do microrganismo declarado como ingrediente ativo. Caso evidências objetivas demonstrem que as técnicas descritas em métodos oficiais não são suficientes para diferenciação, o interessado deve apresentar ao órgão responsável pelo registro, conforme regulamentação vigente, protocolo alternativo validado para uso proposto que permita determinar a identidade do ingrediente ativo.
Este manual descreve os métodos para análise de inoculantes à base de FMAs, bem como inoculantes mistos que os contenham. São abordados os seguintes aspectos:
A análise da presença de organismos que crescem em meio de cultura e que não são especificados no rótulo do inoculante será analisada pelo método de espalhamento em placas de uma diluição seriada decimal, e verificação do crescimento de colônias de microrganismos contaminantes nas diluições.
Para análise de pureza dos inoculantes devem ser observados os seguintes critérios para abertura da embalagem:
A diluição seriada decimal do inoculante deve ser realizada em capela de fluxo laminar e serem observados os seguintes procedimentos:
Durante a análise de pureza dos inoculantes devem ser observados os seguintes procedimentos:
A quantificação dos esporos de FMAs nos inoculantes é realizada por contagem direta sob microscópio do número de esporos.
Para a análise de quantificação dos esporos de FMAs nos inoculantes deve ser considerado propágulos de FMA apenas os esporos intactos, externos e/ou internos aos segmentos de raízes.
Para a análise de quantificação de esporos nos inoculantes seguem os seguintes procedimentos:
A análise de mensuração da colonização micorrízica primária, promovida exclusivamente pelos propágulos iniciais do inoculante contendo FMAs, deve ser feita por meio de bioensaios de infectividade micorrízica do inoculante nas seguintes condições:
A identificação das espécies de FMAs no inoculante será por técnicas de análise biológica do código genético ou, quando a cepa contida no inoculante permitir, pela morfologia dos esporos.
Para a identificação dos FMAs no inoculante por técnicas de análise biológica do código genético, devem ser observados as seguintes condições:
Para a identificação dos FMAs por morfologia dos esporos os esporos devem ser obtidos do inoculante e montados em lâminas para microscopia seguindo técnicas publicadas cientificamente para identificação de FMAs.
O método deve ser desenvolvido sob condições assépticas. Todos os utensílios e micropipetas utilizados para a PCR devem ser exclusivos para este fim e devem estar livres do ácido nucleico e enzimas que o degradam ou qualquer contaminante. Devem ser usadas, sempre que possível, ponteiras com filtros e luvas descartáveis sem talco, estéreis, e devem ser trocadas sempre que houver possibilidade de contaminação. Deve-se usar a quantidade de ácido nucleico por reação da PCR, conforme Relatório de verificação de desempenho do método. Pode-se utilizar a diluição do ácido nucleico conforme resultado da quantificação ou uma outra diluição (por exemplo 1:10 ou 1:4) de solução de ácido nucleico não quantificado, ou ainda, o ácido nucleico não quantificado, desde que os resultados da PCR se adequem aos critérios de aceitabilidade.
Preconiza-se o uso de material de referência e controles adequados e dentro de uma dinâmica estabelecida para o método analítico usado e a amostra teste analisada. Sempre que necessário, a ausência de compostos inibidores de PCR deve ser comprovada. Para a análise de sequência de um gene alvo numa amostra teste, deve utilizar protocolos descritos nos Relatórios de verificação de métodos do laboratório.
A PCR convencional é utilizada para análise qualitativa, detectando a presença ou ausência de uma sequência específica de ácido nucleico na amostra.
Antes da análise, ligar o equipamento e selecionar o programa correspondente. Verificar se as condições de amplificação (tempo e temperatura) estão de acordo com o método validado.
Separar e organizar as amostras de ácido nucleico utilizando um rack apropriado, seguindo o mapa previamente registrado (em formulário impresso ou sistema on-line).
Nota: Sempre que possível, incluir os controles de extração (CE) e ambientais (CA) na mesma reação para maior confiabilidade na detecção de contaminações.
a) Realizar a limpeza da câmara de adição do ácido nucleico. Planejar e registrar o mapa da placa com as posições de amostras e controles aplicáveis (positivo, reação, extração, ambiental e negativo).
b) Adicionar o mix da reação nos microtubos ou microplacas conforme o mapa.
c) Adicionar as amostras de ácido nucleico nas posições designadas.
d) Selar a microplaca e centrifugar brevemente.
e) Inserir no termociclador e iniciar o programa de ciclagem apropriado para a amplificação da sequência alvo.
Após a amplificação, o produto pode ser:
Visualizado por eletroforese em gel de agarose;
Submetido ao sequenciamento ou à genotipagem, conforme aplicabilidade;
Armazenado a ≤ -20 °C para uso posterior.
Para a eletroforese ou corrida seca em E-gel, seguir os procedimentos descritos no manual do equipamento.
A metodologia é específica para amplificação em equipamento de PCR em tempo real, sendo aplicada na detecção e, quando necessário, na quantificação da sequência alvo de ácido nucleico. Uma vez validada, pode ser realizada a quantificação de células viáveis por meio da adição de EMA ou PMA — e de suas variantes comerciais, como PMAxx™ e EMAxx™ — que bloqueiam seletivamente a amplificação do DNA proveniente de células inviáveis ou extracelular.
Devem ser utilizados pontos de calibração e replicatas, conforme aplicabilidade, que abranjam a faixa de quantificação. Exemplo: quatro pontos com três replicatas. A qualidade da curva afeta a incerteza da medição.
Nota: Quando não houver pontos suficientes, os dados devem ser usados apenas para indicar presença/ausência ou se o percentual é maior/menor que o ponto de corte. Resultados abaixo do LOD prático podem ser expressos como "<" ou "não detectado".
Planejar e registrar o mapa da placa (impresso ou no sistema on-line). A análise pode conter amostras e, conforme aplicável, os seguintes controles: positivo (CP), reação (CR), extração (CE), ambiental (CA) e negativo (CN/P0).
Na câmara de segurança biológica, adicionar o mix e as amostras nos tubos ou microplacas ópticas, manualmente ou por pipetagem automatizada. Selar com adesivo óptico incolor, centrifugar brevemente e inserir no termociclador.
Nota 1: Não escrever nas tampas dos microtubos que serão inseridos no equipamento.
Nota 2: Preferencialmente, usar dois poços por amostra para detecção e quatro poços para quantificação.
Após a corrida:
Resultados inesperados devem ser investigados e, se necessário, medidas corretivas adotadas, como nova extração ou limpeza do ambiente.
A interpretação dos resultados deve considerar os seguintes critérios:
Em alguns sistemas, a validação do método pode indicar a ocorrência de amplificação inespecífica após determinado ciclo. Nestes casos, deve-se considerar o Ct limite validado como referência para a tomada de decisão.
Na análise quantitativa, analisar os parâmetros da curva de calibração e observar a eficiência de amplificação. O valor médio da inclinação da curva padrão utilizada para estimar o percentual do gene alvo, deve estar entre -3,1 e -3,6. O valor médio do R2 da equação de regressão deve ser ≥ 0,98. Se houver variação entre repetições da mesma amostra em 1 ΔCt ou 10% do resultado final ou 2 Cts para os endógenos da(s) amostra(s) em relação aos pontos da curva de quantificação, deverá ser repetida a reação e, caso necessário, deve ser feita uma diluição serial da amostra, para verificar a ocorrência de inibidores. Caso os requisitos não sejam atendidos, analisar a presença de valores outliers pela aplicação de testes estatísticos específicos (como por exemplo: Teste de Grubbs) e excluir os mesmos observando-se o limite de exclusão de 22,2% dos dados. Com base nos controles do laboratório, o conhecimento de dados discrepantes permite a exclusão de outliers sem a aplicação de testes estatísticos específicos. Uma vez removido os outliers, se os critérios de aceitabilidade não forem atendidos, a reação deverá ser repetida. Sempre que possível, incluir uma amostra de concentração conhecida na reação, como controle.
Nota: Para avaliação da presença de inibidores, poderá ser feito um teste de inibição através da diluição em série da amostra (por exemplo 1:4) seguida da amplificação de gene endógeno. A interpretação dos resultados deve ser feita conforme procediemento de validação de métodos de extração de ácido nucleico.
A PCR digital é indicada para aplicações que exigem a detecção de quantidades muito pequenas de ácido nucleico ou uma quantificação precisa da sequência alvo, sendo a análise baseada na detecção do número absoluto de cópias. Para a realização das análises, devem ser seguidas as instruções descritas no manual do fabricante do equipamento. O registro dos dados pode ser realizado no formulário específico ou diretamente no sistema on-line.
Esta metodologia descreve os métodos de sequenciamento Sanger para geração de barcodes e de Sequenciamento de Nova Geração (NGS) para geração de metabarcodes pela técnica de primer fusion, com o objetivo de identificação de espécies.
Aplicável para determinar a sequência de bases nucleotídicas em fragmentos de ácido nucleico gerados por PCR, o procedimento requer condições assépticas. Reagentes devem ser armazenados e manuseados em ambiente sem contato com ácido nucleico ou enzimas que o degradem. Utensílios e micropipetas devem ser exclusivos e livres de contaminantes. Utilizar ponteiras com filtro e luvas estéreis sem talco, trocando-as sempre que necessário. Quando aplicável, comprovar a ausência de inibidores de PCR. Kits fluorescentes devem ser protegidos da luz. Operar equipamentos conforme manuais, verificando a finalização de programas térmicos corretamente. Procedimentos devem ser realizados preferencialmente em cabines de segurança biológica limpas e operadas adequadamente.
O método utiliza uma fita de ácido nucleico como molde para gerar fragmentos de diferentes tamanhos por incorporação aleatória de ddNTPs marcados. A separação ocorre por eletroforese capilar e as sequências (A, C, T, G, N) são obtidas por leitura óptica. Utilizam-se protocolos validados em bases de dados disponíveis. Quando não disponíveis, utilizar métodos validados da literatura científica.
A amplificação segue protocolo pré-definido. O produto pode ser purificado (opcional) com ExoSAP-IT ou reagente equivalente, puro ou diluído. Reação de sequenciamento é feita com BigDye, utilizando mix apropriado e programa de ciclagem. Produtos são purificados preferencialmente com Sephadex G50, eluídos em placas de PCR, secos, ressuspensos com Hi-Di Formamida, selados e desnaturados antes da corrida no Genetic Analyzer.
Permite sequenciamento paralelo de várias moléculas de ácido nucleico com o uso de primers fusion. Requer plano de corrida no Ion Torrent Suíte e importação para o Ion Chef e Ion S5 para obtenção dos resultados.
A utilização de metodologias não previstas nas normas oficiais ou de organismos internacionais reconhecidos deve ser previamente autorizada pelo MAPA.
A solicitação para autorização deverá conter:
A validação de métodos deve ser realizada para assegurar que o método proposto é adequado para o uso pretendido, fornecendo resultados confiáveis e rastreáveis.
O laboratório deve registrar os resultados obtidos e o procedimento utilizado para a validação de métodos. Métodos que são publicados com todas as informações sobre suas características de desempenho são considerados como “Métodos totalmente validados”, referidos como métodos normalizados (standard methods) na NORMA ISO/IEC 17025.
O processo geral para a validação de métodos envolve os seguintes passos:
A comparação de um teste (A) com um teste validado (B) é um meio alternativo de validação que pode ser útil em certas situações. Esta comparação apenas demonstra que o método A é tão bom quanto o método B com relação aos critérios de desempenho. A extensão do processo de validação é sempre um balanço entre custos, riscos e o que é tecnicamente possível. Quando for necessário algum desvio dos procedimentos aqui descritos, dependendo da combinação entre microrganismo/matriz, as razões para o desvio devem ser documentadas.
Como referência, consultar o link com exemplos de delineamentos experimentais para validação e verificação de métodos.
Sempre que o laboratório realizar modificações significativas em um método previamente validado, deve ser conduzido um processo formal de validação do novo método ou da versão modificada, a fim de comprovar sua adequação ao uso pretendido. Alterações consideradas menores — como ajustes de volumes, reagentes equivalentes ou mudanças de marca de consumíveis — requerem avaliação técnica criteriosa, com base no julgamento profissional da equipe responsável, para decidir se uma verificação de desempenho é necessária. Independentemente do grau da alteração, é obrigatória a autorização prévia do Responsável Técnico (RT) da unidade e o devido registro documental da decisão tomada e das evidências técnicas que a sustentam.
Os resultados de validação ou verificação de desempenho realizados pelo próprio laboratório, em especial os dados relacionados à reprodutibilidade, bem como os resultados obtidos em testes de proficiência ou comparações interlaboratoriais, oferecem subsídios importantes para a avaliação da robustez do método — isto é, sua capacidade de manter desempenho consistente mesmo diante de variações controladas nos reagentes ou nas condições de execução.
Adicionalmente, dados sobre sensibilidade e especificidade diagnóstica podem ser obtidos por meio da comparação com métodos de referência ou métodos alternativos validados, fortalecendo a confiança no método adotado.
Sensibilidade analítica: Recomenda-se determinar a menor densidade celular (em UFC/mL ou UFC/g) que fornece um resultado positivo em ensaios moleculares ou de cultivo e analisar séries de amostras fortificadas (10¹–10⁶ UFC/mL) em diferentes matrizes (ex.: turfa, líquido, carvão vegetal).
Especificidade analítica: Avaliar isolados da bactéria alvo cobrindo diversidade genética. Testar também microrganismos filogeneticamente próximos e contaminantes comuns.
Seletividade: Se relevante, determinar se a matriz do bioinsumo (turfa, polímeros, nutrientes, presença de outros microrganismos) interfere na performance do método.
Repetibilidade: Analisar pelo menos três replicatas de amostras em baixa concentração do organismo alvo.
Reprodutibilidade: Da mesma forma que estabelecido para repetibilidade, mas, se possível, com diferentes técnicos, em diferentes dias, e com diferentes instrumentos, quando relevante.
Sensibilidade analítica: Determinar o número mínimo de indivíduos ou partes de indivíduo que pode ser identificado ou quantificado (ex.: ovos/Trichogramma).
Especificidade analítica: Incluir espécies próximas ou espécimes de diferentes populações, para garantir distinção adequada. No caso de análise por técnicas moleculares, para organismos não-alvos, a concentração de ácido nucleico deve ser alta o suficiente para maximizar a possibilidade de reação cruzada e ainda assim, permanecer realista. Em adição, os resultados podem ser confirmados por comparação in silico das sequências de primers e sondas a sequências de uma biblioteca genômica.
Seletividade: Não aplicável para insetos. Se relevante, determinar se variações na amostra afeta o desempenho do método.
Repetibilidade e Reprodutibilidade: Conforme descrito para os demais organismos.
Sensibilidade analítica: Determinar a quantidade mínima detectável do fungo (ex.: número de conídios, UFC/g de produto ou ng de DNA alvo/reação). Realizar pelo menos três experimentos com diluições seriais. Se resultados consistentes não forem obtidos após três séries, diluições adicionais devem ser preparadas e testadas. A sensibilidade analítica refere-se a um conjunto específico de parâmetros os quais devem ser definidos e padronizados, por exemplo, no caso de reação em cadeia de polimerase, marca dos reagentes de PCR (em particular DNA polimerase) e condições de ciclagem de PCR.
Especificidade analítica: Avaliar diversidade genética do alvo e possíveis organismos não alvo com proximidade filogenética (ex.: diferentes espécies de Beauveria, Metarhizium, Trichoderma).
Seletividade: Considerar variações da matriz (ex.: diferentes formulações líquidas ou sólidas).
Repetibilidade e Reprodutibilidade: Conforme descrito para os demais organismos.
Sensibilidade analítica: Determinar o número mínimo de juvenis infectivos por grama de produto formulado detectável por método morfológico ou molecular.
Especificidade analítica: Incluir na análise espécies diferentes do mesmo gênero e organismos do solo que possam estar presentes como não alvos.
Seletividade: Avaliar se variações de matriz (tipo de solo, substrato do bioinsumo, mistura com outros organismos) afetam o desempenho do método.
Repetibilidade e Reprodutibilidade: Conforme descrito para os demais organismos.
Sensibilidade analítica (sensibilidade relativa): Em função do fato de que a concentração de vírus e outros microrganismos não cultiváveis nunca é conhecida. Determinar a diluição máxima de corpos de oclusão (baculovírus), propágulos ou ácido nucleico detectada. Realizar pelo menos três experimentos com diluições seriais. Se resultados consistentes não forem obtidos, séries adicionais devem ser preparadas e testadas. No caso de análise por técnicas moleculares, a sensibilidade analítica refere-se a um conjunto específico de parâmetros os quais devem ser definidos e padronizados, por exemplo, marca dos reagentes de PCR (em particular DNA polimerase) e condições de ciclagem de PCR.
Especificidade analítica: Testar a diversidade intraespecífica e organismos não alvo, como outros vírus de insetos ou microrganismos presentes na mesma matriz. No caso de análise por técnicas moleculares, confirmar, quando possível, por análise in silico das sequências de primers/sondas. Para organismos não-alvos, a concentração de ácido nucleico deve ser alta o suficiente para maximizar a possibilidade de reação cruzada e ainda assim, permanecer realista. Em adição, os resultados podem ser confirmados por comparação in silico das sequências de primers e sondas a sequências de uma biblioteca genômica.
Seletividade: Se relevante, determinar se variações na matriz (ex.: presença de restos do hospedeiro, substratos de produção) interferem no desempenho do método.
Repetibilidade e Reprodutibilidade: Conforme descrito para os demais organismos.
O objetivo de um processo de extração do DNA é fornecer DNA de qualidade adequada para análise posterior. A qualidade depende do comprimento médio, integridade estrutural e pureza química do DNA extraído. É reconhecido que DNA altamente fragmentado e extraído junto com impurezas pode dificultar os métodos de PCR subsequentes. Ingredientes diversos podem exercer efeito de matriz, dependendo do método de extração de DNA empregado, e prejudicar a sensibilidade da etapa analítica subsequente. Para este propósito, etapas críticas de extração e purificação de DNA devem ser claramente evidenciadas na documentação técnica que acompanha um método e os critérios de aceitação devem ser estabelecidos para permitir a determinação objetiva da qualidade dos extratos de DNA para PCR. Esses extratos devem ser considerados adequados para os experimentos de detecção subsequente (por exemplo, PCR qualitativa e/ou PCR quantitativa).
Procedimentos de extração de DNA devem resultar em recuperação repetível de perfil de fragmentação, concentração de DNA para PCR e de qualidade de extratos de DNA. Para avaliar esse critério nos ensaios de validação e verificação de métodos de extração, recomenda-se processar o protocolo de extração de DNA de pelo menos uma amostra, em dias diferentes (mínimo três dias), com um número adequado de repetições (mínimo seis repetições por dia), por analista. Os critérios abaixo devem ser utilizados para avaliar o desempenho do método.
Definição: Quantidade de um analito por unidade de volume de uma solução.
Critério de aceitação: O método de extração de DNA empregado deve ser apropriado para obtenção de ácido nucléico na quantidade necessária para as análises subsequentes. A concentração de DNA medida como peso do analito por unidade de volume da solução deve ser maior que a concentração de trabalho descrita no protocolo do método de detecção.
Exemplo: Se o protocolo de PCR em tempo real indica 20 ng/µL como concentração da solução de DNA a ser adicionada ao mix, a concentração de DNA extraída deve ser maior que 20 ng/µL.
Definição: Quebra do DNA genômico de alto peso molecular em fragmentos menores de DNA.
Critério de aceitação: Para análises quantitativas baseadas em PCR em tempo real, o peso molecular da amostra de DNA extraída deve ser no mínimo maior que o tamanho do produto amplificado para o evento específico e que o sistema de referência da espécie como estabelecido por comparação com marcador padrão de ácido nucléico. Para análises qualitativas, a presença de certa proporção de moléculas de DNA de peso molecular menor que o tamanho do produto amplificado para o evento específico pode ser considerado aceitável.
Definição: ausência de compostos que prejudicam a eficiência da reação de PCR atrasando o início da fase exponencial do perfil de amplificação.
Critério de aceitação: A diferença média (ΔCt) entre o valor de Ct estimado e o valor de Ct obtido para a primeira diluição da amostra do teste de inibição deve ser menor que 0,5 e a inclinação (slope) da curva de inibição deve estar entre -3,6 e -3,1.
O ensaio de PCR para testes de inibição pode ser feito com um controle interno (por exemplo, o sistema de referência da espécie). A quantidade total de DNA da primeira amostra da diluição serial não deve ser menor que a quantidade total de DNA utilizada no método (por exemplo, a quantidade total de DNA indicada no protocolo de PCR para o sistema de referência da espécie).
Definição: é a determinação da concentração de DNA em uma amostra visando assegurar resultados reprodutíveis. As bases nitrogenadas posicionadas ao longo da molécula do DNA absorvem a luz ultravioleta no comprimento de onda de 260 nm. Nesse comprimento de onda, a absorbância é proporcional à concentração de DNA. A quantificação de DNA geralmente é determinada pela leitura da absorbância nos seguintes comprimentos de onda: 230 nm, indicativo de presença de sal na solução, 260 nm, usado especificamente para determinar o ácido nucléico na solução, 280 nm, para detectar a presença de proteína, 320 nm, para detectar presença de compostos insolúveis que espalham a luz.
Critério de aceitação: Ausência de compostos inibidores de PCR. Para comprovar a ausência de inibição pode-se utilizar quatro diluições seriais de base 4 e amplificação em reação de PCR em tempo real, calcular o Ct das diluições pela expressão Ct diluições = f[ln (Concentração)]. Para amostras não diluídas o Ct estimado – Ct obtido < 0,5. Outras formas disponíveis de comprovação também poderão ser utilizadas, desde que devidamente documentadas.
Para a verificação de métodos normalizados ou totalmente validados, se o método de extração de DNA foi validado previamente, a extração de DNA deve ser conduzida pelo menos duas vezes (recomenda-se três vezes), sendo cada vez em duas amostras teste, se possível em diferentes dias e com diferentes operadores, caso variação entre resultados obtidos seja constatada entre os operadores. A extração de DNA deve adequar-se aos critérios de aceitação para concentração e qualidade do DNA (por exemplo, controlando-se a eficiência de amplificação e a presença de inibição nas reações de PCR). Métodos de extração de DNA aplicado a uma matriz podem não serem adequados para outras matrizes. Pode ser necessário fazer a verificação em diferentes matrizes.
Procedimento: A concentração de DNA deve ser medida pelo método aplicável às amostras de rotina.
Critério de aceitação: No processo de verificação, quando o método de extração de DNA é aplicado à mesma matriz do estudo de validação, a quantidade de DNA extraída deve ser comparável aos resultados obtidos no estudo de validação. O método deve proporcionar DNA em concentração apropriada para as análises pretendidas (pelo menos suficiente para adequação ao LOQ/LOD prático desejado). Se o método de extração de DNA não proporcionar uma quantidade de DNA adequada para a análise pretendida em uma matriz particular, o LOD prático será afetado.
Procedimento: Cada repetição da extração de DNA é diluída para a diluição de trabalho (por exemplo 20 ng/μL). Desta diluição de trabalho, uma série de diluições, por exemplo, quatro pontos são analisados usando PCR em tempo real (pelo menos duas repetições de PCR por diluição). Uma curva de calibração é obtida destas quatro diluições. Deve-se utilizar preferencialmente para o teste de inibição o sistema gênico de referência da espécie (sistema de referência táxon específico). A quantidade total de DNA na diluição de trabalho deve ser pelo menos a mesma quantidade de DNA pretendida para uso no processo de verificação e na rotina analítica (por exemplo, a quantidade de DNA indicada para PCR no protocolo do sistema de referência da espécie).
Critério de aceitação: A diferença média (Ct) entre o valor de Ct medido e o valor de Ct calculado da diluição serial deve ser < 0,5 [(Ct medido – Ct calculado) <0,5] e a inclinação (slope) da curva de inibição deve estar no intervalo entre -3.6 e -3.1. Se uma solução de DNA contém inibidores, o DNA deve ser purificado ou diluído a um nível em que não mais se observa a inibição na reação de PCR, antes do seu uso.
Definição: Descrição dos analitos, matrizes e concentrações para os quais o método pode ser aplicado.
Critério de aceitação: A aplicabilidade deve proporcionar informações sobre o escopo do método e incluir dados que atendam aos requisitos determinados para os índices listados abaixo para os produtos aplicáveis. A descrição deve incluir também avisos sobre interferentes conhecidos ou inaplicabilidade para certas matrizes e situações.
Definição: Facilidade de operação, viabilidade e eficiência de implantação, associados ao custo unitário (exemplo, custo/amostra) do método.
Critério de aceitação: O método deve ser praticável em consonância com outros métodos para propósito similar. Especificamente, o método é considerado inaceitável, salvo justificativa adequada, se:
- Exige um novo tipo de aparelho (geralmente não disponível) ou instrumento caro, ou os recursos necessários para executar o método (tempo, trabalho, reagentes, custo) são consideravelmente maiores do que os recursos necessários para executar outros métodos para propósitos similares. Outras considerações de ordem prática podem também classificar o método como impraticável.
Nota: Para a verificação de métodos, uma vez que a praticabilidade já foi estabelecida no contexto da validação do método, este parâmetro não necessita ser novamente investigado. Na seleção do método o laboratório deve considerar este critério considerando as facilidades disponíveis no laboratório.
Definição: Propriedade de um método em responder exclusivamente ao analito de interesse.
Procedimento: Para validação de métodos para análises de genes específicos por PCR este experimento deve ser conduzido com, pelo menos, 6 amostras com 5 replicatas independentes, sendo analisado MRC específico do evento e, quando possível, amostras MRC de eventos específicos que estão no escopo do laboratório. Quando houver necessidade de estudo de especificidade para sequência alvo da espécie.
Nota: Para a verificação de métodos, uma vez que a especificidade já foi investigada no contexto da validação do método, este parâmetro não necessita ser novamente investigado.
Critério de aceitação: O método não deve produzir sinais de amplificação com sequências diferentes da sequência alvo para a qual o método foi desenvolvido. Isto deve ser comprovado por pesquisa de similaridade em bancos de dados ou por resultados empíricos de testes do método com genes não alvos.
A especificidade da sequência alvo deve ser verificada por estudos em comparação com sequências disponíveis em banco de dados e experimentalmente demonstrada pela ausência de produtos de amplificação quando a análise da sequência específica é realizada em PCR individual com DNA genômico puro de amostra representativa das espécies mais próximas à espécie alvo.
Procedimento: Faixa dinâmica, Coeficiente R2 e eficiência de amplificação são validados e verificados simultaneamente da curva padrão quando são testados outros parâmetros, tais como exatidão e precisão. Devem ser considerados os valores médios de pelo menos duas curvas padrões.
Critério de aceitação para faixa dinâmica: A faixa dinâmica deve cobrir os valores correspondentes ao uso esperado e pode ser expressa como variação no número de cópias.
Exemplo: 50 e 2500 cópias do genoma se o alvo for 500 cópias.
Critério de aceitação para eficiência de amplificação: Tanto para métodos qualitativos quanto para quantitativos, o valor médio da inclinação da curva padrão deve estar entre -3,6 e -3,1, correspondendo a uma eficiência de amplificação entre 90 e 110 %.
Critério de aceitação para o coeficiente R2: O valor médio de R2 deve ser maior que 0,98.
Procedimento: A exatidão deve ser determinada a um nível próximo ao limite estabelecido em legislação, ou de acordo com o uso pretendido para o método e adicionalmente a um nível próximo ao limite de quantificação. A exatidão pode ser medida usando materiais de referência certificados (MRCs), com pelo menos dois níveis de concentração e, se possível, um terceiro nível no limite superior da faixa dinâmica. Alternativamente, uma amostra de referência pode ser feita de um material de referência certificado mais concentrado. As condições de testes (volume de reação, instrumento de PCR, etc.) devem ser as mesmas utilizadas durante as análises de rotina. Devem ser obtidos pelo menos 16 resultados de repetições de PCR. Se não houver disponíveis MRCs para avaliação da exatidão, pode se utilizar materiais de testes de proficiência, uma vez que o z-score de testes de proficiência pode fornecer uma indicação da exatidão do método.
Critério de aceitação: A exatidão obtida deve ser ± 25 % do valor aceito como referência ou pelo Z-escore dentro da variação de 2 e -2.
Procedimento: A repetibilidade pode ser determinada de forma similar à descrita para exatidão. Ela é calculada de repetições de PCR sob condições de repetibilidade e deve ser avaliada para todos os níveis de testados.
As condições de teste (volume de reação, instrumento de PCR) devem ser as mesmas utilizadas durante as análises de rotina. Pelo menos 16 resultados independentes devem ser obtidos.
Critério de aceitação: O desvio padrão relativo de repetibilidade deve ser menor que 25% na faixa dinâmica do método.
Definição: desvio padrão relativo dos resultados dos testes obtidos sobre condições de reprodutibilidade. Condições de reprodutibilidade são condições em que os resultados são obtidos com o mesmo método, em itens de ensaio idênticos, em diferentes laboratórios, com diferentes analistas, usando diferentes instrumentos.
Critério de aceitação: o desvio padrão relativo de reprodutibilidade deve ser menor que 35% em toda a faixa. No entanto, para concentrações muito baixas valores de RSDR menores que 50% são aceitáveis.
Nota 5: Estimativas de desvio-padrão de reprodutibilidade parcial devem ser obtidas com um número suficiente de dados, pelo menos 15 repetições, em três dias, por instrumento e por analista. Se baseado na experiência, o laboratório conseguir provar que a repetibilidade entre dois analistas experientes é semelhante à obtida por um único analista, não é necessário incluir a repetição feita por outro analista. Do mesmo modo, quando se atender aos critérios pré-estabelecidos após a análise de dados nos quais houve a adição de dados obtidos por um segundo analista, ou em diferentes condições de análises, não se justifica a execução de novo delineamento.
O LOQ relativo (em %) e/ou o LOQ absoluto (em número de cópias) pode ser determinado como descrito nos ensaios abaixo.
Procedimento para LOQ relativo (LOQrel): Se aplicável, um material controle positivo do gene alvo, por exemplo, 0,1% pode ser analisado em 10 repetições de PCR e 10 repetições do sistema de referência da espécie alvo. O desvio padrão do LOQrel deve ser menor que 25 %.
Procedimento para LOQ absoluto (LOQabs): Uma série de diluições de um material controle positivo conhecido pode ser medido em 10 repetições de PCR (por exemplo 80, 60, 40, 20, 10, 5 e 1 cópia). O LOQabs pode ser estimado como a última diluição serial onde o RSD for menor que 25 %. A curva padrão deve cobrir o valor do LOQabs. A distribuição de probabilidade sugere que 1 cópia deve dar aproximadamente 30% de resultados negativos. Portanto, como requerimento para verificar o número de cópias em uma diluição serial é aproximadamente correto, pelo menos uma repetição deve ser negativa para a diluição de 1 cópia. A média das 10 repetições de PCR pode ser parte da curva padrão enquanto a curva padrão ainda atender aos critérios de aceitabilidade de R2, inclinação/eficiência. O restante da curva padrão necessita somente de duas repetições de PCR por ponto.
Critério de aceitação: Quando os dados de validação estiverem disponíveis, o LOQ deve se alinhar (ou ser melhor) que estes dados.
O LOD relativo (em %) e/ou o LOD absoluto (em número de cópias) podem ser determinados como descrito nos ensaios abaixo.
Procedimento para determinação do LOD relativo (LODrel): Se aplicável, deve-se medir um material controle positivo do gene alvo em baixa concentração em 10 repetições de PCR e se todas as repetições forem positivas, pode ser inferido que o LODrel é menor ou igual ao nível do material controle positivo.
Procedimento para o LOD absoluto (LODabs): para calcular o LODabs de um método com 95% de confiança é necessário analisar 60 repetições de PCR para cada concentração testada. Como este procedimento não é muito prático, propõe-se calcular a taxa de falso negativo em um número menor de repetições como, por exemplo, 10. A taxa de falso negativo deve ser menor que 5% (i. e. todas as 10 repetições de PCR devem ser positivas). Este procedimento permite uma estimativa aproximada do LODabs. Por definição, a taxa de falso negativo é a probabilidade que uma dada amostra teste positiva ser classificada como negativa pelo método. Um aumento na taxa de falso negativo é observado quando a quantidade do analito aproxima-se do LOD do método. Diluições seriais podem ser utilizadas representando um intervalo acima e abaixo do LODabs esperado baseado em conhecimento anterior do desempenho do método (por exemplo, 20, 10, 5, e 1 cópias). A menor concentração onde todas as 10 repetições são positivas é o LODabs estimado. A distribuição de probabilidades sugere que 1 cópia resulta em 30% de resultados negativos. Portanto, como requerimento para verificar que o número de cópias de uma diluição serial está aproximadamente correto, pelo menos uma replicata deve ser negativa para a diluição de uma cópia.
Critério de aceitação: Quando os dados de validação estiverem disponíveis, o LOD deve se alinhar (ou ser melhor) que estes dados. O LOD prático está foram do escopo deste documento porque é dependente da amostra e não do método. No entanto, o LODprac deve ser determinado para cada amostra individualmente.
Definição: é a capacidade do método em não ser afetado por pequenos desvios ocorridos em condições experimentais descritas no procedimento.
Nota 1: A adequação do teste de robustez precisa ser demonstrada método a método. Atualmente, para método de PCR em tempo real, os seguintes fatores e suas fontes/origens devem ser considerados: diferentes modelos de termociclador, uracil-N-glicosilase, concentração de cloreto de magnésio, especificidade de primers/sonda, concentração do conjunto de primers/sonda, perfil de temperatura, perfil do tempo, dNTPx, incluindo concentrações de dUTP.
Critério de aceitação: a resposta de um ensaio frente a essas pequenas mudanças não deve desviar mais que 30%.
Nota 2: Uma vez que a robustez deve ser investigada previamente durante o desenvolvimento/otimização do método antes do método ser submetido aos ensaios colaborativos, não necessita ser reavaliada nos estudos de verificação do método.
Os laboratórios integrantes da Rede Nacional devem garantir que as metodologias aplicadas estejam sempre atualizadas e alinhadas aos padrões nacionais e internacionais vigentes.
Qualquer alteração metodológica, bem como dúvidas quanto à conformidade técnica, deve ser previamente consultada junto ao MAPA.
Os registros dos métodos aplicados, bem como os resultados obtidos, devem ser mantidos em conformidade com os requisitos de rastreabilidade e gestão da qualidade descritos na Norma ISO/IEC 17025 (versão atual).
BEEVER, R. E.; BOLLARD, E. G. The nature of the stimulation of fungal growth by potato extract. Journal of General Microbiology, v. 60, p. 273-279, 1970.
BRASIL. Ministério da Agricultura e Pecuária. Portaria SDA/MAPA nº 1110, de 13 de maio de 2024. Institui diretrizes para publicação e manutenção de manuais técnicos no âmbito da SDA.
BRASIL. Ministério da Agricultura e Pecuária. Sanidade Vegetal – Análise de Riscos de Pragas. Brasília: MAPA. Disponível em: https://www.gov.br/agricultura/pt-br/assuntos/sanidade-animal-e-vegetal/sanidade-vegetal/analise-de-riscos-de-pragas. Acesso em: 13 maio 2025.
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FERREIRA, Eduara; NOGUEIRA, Marco Antonio; HUNGRIA, Mariangela. Manual de análises de bioinsumos para uso agrícola: inoculantes. Brasília, DF: Embrapa, 2024. 164 p.
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Hougs L, Gatto F, Goerlich O, Grohmann L, Lieske K, Mazzara M, Narendja F, Ovesna J, Papazova N, Scholtens I, Žel J. Verification of analytical methods for GMO testing when implementing interlaboratory validated methods. EUR 29015 EN, Publication Office of the European Union, Luxembourg, 2017, ISBN 978-92-79-77310-5, doi:10.2760/645114, JRC 109940. Link.
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KING, E. O.; WARD, M. K.; RANEY, D. E. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin. Journal of Laboratory and Clinical Medicine, v. 44, n. 2, p. 301-307, 1954.
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VERSALOVIC, J.; SCHNEIDER, M.; DE BRUIJIN, F. J.; LUPSKY, J. R. Genomic fingerprinting of bacteria using repetitive sequence-based polymerase chain reaction. Methods in Molecular and Cellular Biology, v. 5, p. 25-40, 1994.
VINCENT, J. M. A manual for the practical study of root-nodule bacteria. Oxford: Blackwell Scientific, 1970. 164 p. (International Biological Programme Handbook, 15).
As sugestões para aprimoramento ou possíveis correções deste documento devem ser direcionadas ao Departamento responsável, para alinhamento das melhores práticas de mercado, legislação vigente e/ou regulamentações, que não tenham sido contempladas na versão vigente.
| Versão | Conteúdo alterado | Data | Motivo |
|---|---|---|---|
| 1 | - | 08.09.2025 | Elaboração do documento |
Para demonstrar proficiência no escopo por determinação ou identificação por classe de microrganismo ou agente benéfico, o laboratório deverá apresentar, as metodologias que serão empregadas na análise dos microrganismos ou agentes benéficos registrados como bioinsumos no site do MAPA. Nos casos em que os métodos se basearem em características morfológicas ou fisiológicas dos microrganismos ou agentes benéficos, o laboratório deverá incluir a descrição detalhada das características diagnósticas das espécies, acompanhada de material de referência catalogado, como chaves de identificação, imagens ilustrativas e resultados esperados de testes bioquímicos ou outros.
Exemplos de escopo: