¶ Folha de rosto
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Ano 2025
Elaboração, distribuição, informações:
Ministério da Agricultura e Pecuária
Secretaria de Defesa Agropecuária - SDA
Departamento de Serviços Técnicos - DTEC
Esplanada dos Ministérios, Bloco D, Anexo, Ala B, 4º andar, sala 433
CEP: 70043-900, Brasília - DF
www.agricultura.gov.br
e- mail: cgal@agro.gov.br
Central de Relacionamento: 0800 704 1995
Equipe Técnica:
Ana Cristina Gonçalves Pinto da Rocha
Ana Carolina de Oliveira Nascimento
Anapolino Macedo de Oliveira
Aerlem Cynara Silva
Ana Karina Cunha Callado
Andrea Padilha de Alencar
Anselmo Vasconcelos Rivetti Júnior
Antônio Augusto Fonseca Júnior
Cid Aristóteles de Siqueira Alencar
Dilmara Reischak
Fernanda Gomes Cardoso
Isabela Ciarlini de Azevedo
João Marcos Nacif da Costa
Juliana Nabuco Pereira Otaka
Luanda Bispo Santos do Nascimento Maués
Luciana Amaral Pinto
Luciana Rabello Ferreira
Luciana Taborda Corrêa
Marcelo Fernandes Camargos
Marco Antônio de Carvalho Marques Serqueira
Paulo Martins Soares Filho
Patrícia Gomes de Souza
Rene Ribeiro da Silva
Sheila de Matos Xavier
Silvio Orlan de Castro Chaves
Soraya Cecilia Albieri Camillo
¶ Folha resumo
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Macroprocesso: Laboratórios |
Objetivo: Realizar a padronização, harmonização, atualização e a unificação dos procedimentos para execução de ensaios laboratoriais da área de Diagnóstico Animal |
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Processo: Análises Laboratoriais |
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Entrega: Segurança e saúde dos rebanhos animais |
Público alvo e demais interessados: Laboratórios oficiais ou credenciados do Ministério da Agricultura e Pecuária (Mapa) |
Versão do documento: 1 |
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Setor responsável e responsabilidades A Coordenação Geral de Laboratórios Agropecuários do Departamento de Serviços Técnicos é responsável pela elaboração, atualização e envio para aprovação deste manual, tendo responsabilidade quanto aos procedimentos descritos no documento. |
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¶ 1. Definições e conceitos
Não Aplicável
¶ 2. Responsabilidades
O presente manual possui vigência e prazo indeterminado e será revisado sempre que necessário, no mínimo anualmente, pela Coordenação Geral de Laboratórios Agropecuários do Departamento de Serviços Técnicos (CGAL/DTEC).
A gestão desse manual está sob a responsabilidade da CGAL/DTEC que prestará auxílio ao público alvo leitor dúvidas e/ou sugestões quanto à aplicação deste manual devem ser submetidas ao Departamento responsável.
A publicação e atualização das versões na plataforma oficial da SDA para acesso pelo público alvo será de responsabilidade da Secretaria representada pelo DTEC.
¶ 3. Objetivo
O objetivo do Manual é reunir os métodos analíticos a serem empregados na execução de ensaios laboratoriais da área de Diagnóstico Animal da Rede Nacional de Laboratórios Agropecuários (Rede LFDA e Laboratórios credenciados junto ao Ministério da Agricultura e Pecuária).
¶ 4. Procedimentos - Multiespécies
¶ 4.1. FEBRE AFTOSA - FA
4.1.1. Amostras
São consideradas amostras para o diagnóstico da Febre Aftosa:
Detecção da Resposta Imune
- Soro sanguíneo
Identificação do Agente
- Epitélio;
- Líquido de vesículas;
- Líquido esofágico faríngeo (LEF) e
- Suabe de vesículas rompidas
4.1.2. Recebimento das Amostras
4.1.2.1. Para atendimento aos Programas e Controle Oficiais do MAPA os Laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
4.1.2.2. Deverão ser obedecidos aos critérios estabelecidos no capítulo de verificação de conformidade de amostras.
4.1.2.3. As amostras deverão ser encaminhadas ao laboratório, individualmente separadas por matriz, e obedecendo à critérios de biossegurança.
4.1.3. Técnicas de Diagnóstico
4.1.3.1. Somente poderão ser utilizados insumos de diagnóstico que tenham registro no MAPA, segundo legislação em vigor;
4.1.3.2 Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados;
4.1.3.3. O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos
- Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente
- Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 e 25ºC.
- Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados;
- O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios;
- Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada;
- Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório;
Nota: A utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitido quando:
I. A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos.
II. As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes.
III. O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
¶ A. ELISA 3ABC (ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO ELISA para proteínas não estruturais)
Materiais
- Luvas para procedimentos;
- Pipetas de vidro graduadas ou descartáveis;
- Provetas graduadas;
- Béqueres;
- Erlenmeyers;
- Ponteiras descartáveis;
- Descartador de ponteiras;
- Reservatórios para soluções (cubetas);
- Papel absorvente;
- Caneta para identificação de vidraria; e
- Cubas para descarte de materiais resistente à autoclavação.
Equipamentos e instrumentos
- Autoclave;
- Geladeira;
- Estufa;
- Termômetros
- Micropipetas monocanal e multicanal de volumes reguláveis;
- Pipetador automático ou manual;
- Leitora de ELISA;
- Cronômetros;
- Agitador de tubos tipo vórtex (opcional);
- Agitador de microplacas (opcional); e
- Lavadora de microplacas (opcional).
Insumos
- Kits de ELISA para a detecção de anticorpos para proteínas não estruturais do vírus da Febre Aftosa.
Soluções
- No preparo das soluções deve ser utilizado somente os reagentes fornecidos pelo fabricante, ou aqueles por ele indicados.
- Conjugados, substratos e solução de parada deverão ser utilizados obedecendo-se as condições do fabricante;
- No preparo da solução de lavagem deve-se assegurar que não existem cristais precipitados na solução; e
- Diluir a soluções utilizando água ultrapura ou destilada conforme instruções do fabricante e homogeneizar bem.
Realização do ensaio
- Para realização dos ensaios de ELISA devem ser consideradas as orientações do fabricante do kit de diagnóstico utilizado. Atentar para ocorrência de atualização na bula do kit, principalmente em mudanças de lote;
- A ordem de execução das etapas do ensaio, duração, volumes utilizados e temperatura de incubação variam de acordo com fabricante do kit utilizado;
- Homogeneizar gentilmente todos reagentes e amostras antes do uso;
- Utilizar ponteiras distintas para cada controle e amostra de soro;
- Homogeneizar as placas tocando-as na lateral ou utilizando um agitador de placas;
- Nas etapas de incubação, as placas devem ser seladas para se evitar evaporação;
- As placas devem ser lavadas com a solução indicada pelo kit. Após a última lavagem remover resíduos em um material absorvente (papel toalha ou toalha). Deixar as placas secas o mínimo de tempo possível entre a lavagem e adição do próximo reagente; e
- Decorridas todas as etapas do teste, realizar a leitura da absorbância na leitora de ELISA utilizando filtro com comprimento de onda indicado nas instruções do fabricante.
Critérios de aceitação do Ensaio
O resultado do ensaio será considerado válido somente se as DOs dos soros controles estiverem dentro dos limites aceitáveis e determinados pelo fabricante. Caso contrário, o ensaio deve ser repetido.
Interpretação dos resultados
- De acordo com as DOs obtidas considera-se as amostras como reagentes e não reagentes;
- No caso de uso de kits em que as amostras com DO entre os dois pontos de corte estabelecidos são consideradas inconclusivas, essas amostras deverão ser novamente ensaiadas. Se no reensaio o inconclusivo persistir, as amostras de bovinos e bubalinos devem ser submetidas ao ensaio de EITB - Ensaio Imunoenzimático de Eletrotransferência;
- Amostras de bovinos e bubalinos reagentes no ELISA devem ser submetidos ao ensaio de EITB; e
- Para amostras de outras espécies, reagentes no ELISA.
Emissão dos Resultados
Os resultados deverão ser emitidos e expresso como REAGENTE, NÃO REAGENTE, ou de acordo com o preconizado com o fabricante do insumo (kit de diagnóstico).
Descarte de Amostras e Resíduos
- Antes da realização do descarte de amostras e produtos de ensaio deverão ser observados os prazos mínimos estabelecidos. Retenção de Itens de Ensaio.
- Todo material utilizado na realização do ensaio deve ser imerso em cuba com solução de ácido cítrico 0,2%, hipoclorito de sódio 0,5% ou solução para descontaminação similar, por no mínimo de 1 hora;
- Após este período, todo o material utilizado na realização do ensaio deve ser submetido ao processo de autoclavação apropriado e validado. A efetividade de esterilização deve estar comprovada em procedimentos próprios do laboratório; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo processo de descarte.
Retenção de itens de ensaio
Soro sanguíneo
Poderão ser descartados 60 dias após a emissão do relatório de ensaio, registrando-se nos formulários próprios e conferidos antes do descarte.
¶ B. ELISA DE COMPETIÇÃO EM FASE LÍQUIDA (CFL) -Triagem
Materiais
- Luvas para procedimentos;
- Pipetas de vidro graduadas ou descartáveis;
- Provetas graduadas;
- Béqueres;
- Erlenmeyers;
- Ponteiras descartáveis;
- Descartador de ponteiras;
- Reservatórios para soluções (cubetas);
- Papel absorvente;
- Caneta para identificação de vidraria;
- Cubas para descarte de materiais resistente à autoclavação;
- Microplacas de fundo em “U”; e
- Microplacas NUNC MaxSorb, ou similar.
Equipamentos e instrumentos
- Autoclave;
- Geladeira;
- Estufa;
- Micropipetas monocanal e multicanal de volumes reguláveis;
- Pipetador automático ou manual;
- Leitora de ELISA;
- Cronômetros;
- Agitador de tubos tipo vórtex (opcional);
- Agitador de microplacas; e
- Lavadora de microplacas (opcional).
Insumos
- Set de ensaio de ELISA de competição em fase líquida (CFL) para a detecção de anticorpos contra a proteínas estruturais do vírus da Febre Aftosa (VFA), produzidos pelo Centro Panamericano de Febre Aftosa contendo soros captura, detector, controle negativo, fraco positivo e forte positivo, soros bloqueadores de bovino e coelho e antígeno;
- IgG de cabra anti-IgG de cobaio conjugado com peroxidase (Sigma nº catálogo A7289);
- Pastilhas de OPD (ortofenildiamina) de 2 ou 10mg;
- Albumina Bovina Grau II;
- Albumina Bovina Grau V;
- Fosfato de sódio;
- Ácido cítrico;
- Carbonato de sódio grau P.A.;
- Bicarbonato de sódio grau P.A;
- Peróxido de hidrogênio a 30%; e
- Tween 20 (Sigma cat. Nº P-1379).
Soluções
- No preparo das soluções deve ser utilizado somente os reagentes fornecidos pelo fabricante, ou aqueles por ele indicados.
- Conjugados, substratos e solução de parada deverão ser utilizados obedecendo-se as condições do fabricante;
- No preparo da solução de lavagem deve-se assegurar que não existem cristais precipitados na solução;
- PBST (Tampão salina fosfatada pH 7,4 com 1% de ovoalbumina Grau II e 0,05% de Tween 20), preparado como descrito abaixo:
- PBS tween 20x fornecido no kit - 100 mL
- água destilada q;s.p. - 2 litros
- 20 g ovoalbumina grau II
- pH 7,4 a 7,6.
caso o set não forneça o PBS, formular:
- cloreto de potássio, 0,2 g;
- cloreto de sódio, 8,0 g;
- fosfato de potássio, 0,2 g;
- fosfato de sódio, 2,9 g;
- água destilada q.s.p. - 1 L;
- adicionar 0,5 ml de tween 20 em 1 L de PBS;
- 10 g de ovoalbumina grau II;
- filtrar com membrana 0,8 um.
- Solução salina fisiológica 0,85% pH 7,2 – 7,4;
- Tampão carbonato-bicarbonato pH 9,6;
- Peróxido de hidrogênio a 30%; e
- Solução de ácido sulfúrico 1,5 mol/L.
Realização do ensaio
Sensibilização das placas com anticorpos captura – microplacas NUNC MaxSorb
- Identificar as placas em ordem sequencial;
- Descongelar os soros captura à temperatura ambiente;
- Preparar as diluições de uso de cada soro captura em tampão carbonato-bicarbonato, conforme recomendações do fabricante. Homogeneizar em agitador magnético;
- Colocar em cada poço da placa 100 µL de soro de captura diluído em tampão carbonato, distribuído como indicado a seguir;
- Empilhar as placas em grupos de 10, no máximo, e selar a placa superior;
- Incubar por 16 a 20 horas entre 4 ºC e 8 °C;
- Retirar da geladeira e mantê-las à temperatura ambiente por 1h;
- Descartar o conteúdo das placas e lavá-las uma vez com 200 µL de solução salina fisiológica por poço;
- Descartar o conteúdo das placas e batê-las sobre papel absorvente ou toalha;
- Adicionar 100 µL por poço de PBS com 1% de ovoalbumina Grau V;
- Incubar por 1h à temperatura ambiente;
- Descartar o conteúdo das placas e lavá-las uma vez com 200 µL de solução salina fisiológica por poço;
- Descartar o conteúdo das placas e batê-las sobre papel ou toalha absorvente;
- As placas podem ser utilizadas imediatamente ou podem ser armazenadas. Para isto, cobri-las com filme plástico e armazená-las a – 20°C em posição invertida.
Preparo do tampão bloqueador (PBSTB)
- Descongelar o PBST à temperatura ambiente; e
- Adicionar 2 mL de soro de coelho e 2 mL de soro de bovino para 100 mL do tampão PBST e homogeneizar antes do uso.
Diluições dos soros testes - fase líquida em microplacas fundo “U”
Sorotipos “O”, “A” e “C” – Triagem
- Em uma placa auxiliar preparar a diluição dos soros;
- Numerar as microplacas de fundo em U em ordem sequencial. A diluição final dos soros será de 1:126 (título 2,1);
- Adicionar 248 µL da solução PBSTB em todos os poços da placa, com exceção dos poços das colunas 5, 6, 11 e 12 (linhas D a H);
- Adicionar 4 µL dos soros de A até H (soro 1: A1, soro 2: B1, e assim sucessivamente até linha H, com exceção dos poços D a H das colunas 5, 6, 11 e 12;
- Homogeneizar o conteúdo da coluna 1 da placa de pré-diluição pelo menos 3 vezes e transferir 40 µL para as colunas 1 e 2 de outra placa de fase líquida correspondente;
- Homogeneizar o conteúdo da coluna 2 pelo menos 3 vezes e transferir 40 µL para as colunas 3 e 4 de outra placa de fase líquida correspondente. Repetir esse procedimento, trocando-se as ponteiras, até a transferência de todos os soros, em duplicata, para a placa de fase líquida correspondente, isto é, coluna 3 para as colunas 5 e 6, coluna 4 para as colunas 7 e 8, coluna 5 para as colunas 9 e 10 e coluna 6 para as colunas 11 e 12; e
- A partir da coluna 7, inicia-se o mesmo procedimento para outra placa de fase líquida correspondente, transferindo-se os soros desta coluna para as colunas 1 e 2 da próxima placa, e assim sucessivamente.
Sorotipos “O”, “A” e “C” – pequenos ruminantes (ovinos e caprinos)
- Em uma placa auxiliar preparar a diluição dos soros;
- Numerar as microplacas de fundo em U em ordem sequencial. A diluição final dos soros será de 1:10 (título 1);
- Adicionar 200 µL da solução PBSTB em todos os poços da placa, com exceção dos poços das colunas 5, 6, 11 e 12 (linhas D a H);
- Adicionar 50 µL dos soros de A até H (soro 1: A1, soro 2: B1, e assim sucessivamente até linha H com exceção dos poços D a H das colunas 5, 6, 11 e 12; e
- Diluir os soros controle e prosseguir conforme item “Desenvolvimento”.
Seleção de bovinos para controle de vacinas
- Para os vírus O e C adicionar 121 µL de PBSTB em todos os poços da placa, com exceção dos poços das colunas 5, 6, 11 e 12 (linhas D a H). Para o vírus A adicionar 95 µL de PBSTB;
- Adicionar 11 µL de soro por poço para os vírus O e C e para o vírus A 5 µL Soro 1: A 1; soro 2: B 1 e assim sucessivamente até linha H, com exceção dos poços D a H das colunas 5, 6, 11 e 12; e
- Diluir os soros controle e prosseguir conforme item “Desenvolvimento”
Distribuição dos controles
- Distribuir 40 µL de tampão PBSTB nos poços D10 a D12, E10 a E12 e F10 a F12;
- Distribuir 40 µL do tampão de diluição nos poços G9 a G12 (Controle do antígeno); e
- Distribuir 80 µL do tampão de diluição nos poços H9 a H12 (Branco).
Execução
- Diluir o antígeno à metade da concentração recomendada pelo fabricante;
- Acrescentar 40 µL do antígeno diluído em todos os poços, com exceção dos poços da linha H (9 a 12);
- Incubar as placas por 60 minutos a 37°C ± 1 °C, sendo os primeiros 20 minutos sob agitação;
- Descongelar as placas de fase sólida previamente sensibilizada 20 minutos na geladeira, 20 minutos à temperatura ambiente e 20 minutos na estufa a 37 º C ± 1 ºC (deixá-las sempre invertidas sobre papel toalha);
- Identificar as placas de fase sólida;
- Transferir 50 µL de cada poço da fase líquida para a placa de fase sólida seguindo-se a mesma ordem. Trocar as ponteiras a cada transferência. Para os soros controle, a transferência deve ser iniciada do soro mais diluído (coluna 12) para o soro mais concentrado (coluna 9). Nesse caso não é necessário trocar as ponteiras. Cada placa de fase sólida irá conter 38 soros em teste e os controles;
- Incubar por 30 ± 2 minutos, 37 °C ± 1 °C, sob agitação;
- Preparar a diluição do soro detector conforme recomendação do fabricante. Incubar a 37°C ± 1 °C até o momento do uso;
- Lavar a placa três vezes com salina fisiológica com Tween 20 a 0,05% (1 mL de Tween para 2 litros de salina);
- Distribuir 50 µL do soro detector em todos os poços da placa;
- Incubar a 37 °C ± 1 °C por 30 ± 2 minutos, sob agitação. Preparar a diluição do conjugado e incubá-lo a 37 °C ± 1 °C até o momento do uso;
- Lavar a placa três vezes com salina fisiológica com Tween 20 a 0,05%;
- Distribuir 50 µL do conjugado em todos os poços da placa;
- Incubar a 37°C ± 1°C por 30 ± 2 minutos, sob agitação;
- Preparar a solução de substrato-cromógeno nas seguintes proporções (quantidade suficiente para cinco placas), como descrito abaixo:
- - Fosfato de sódio 0,2 mol/L - 7,0 mL
- - Ácido cítrico 0,1 mol/L – 6,5 mL
- - Água destilada ou deonizada – 11,5 mL
- - Ortho-phenyldiamine (OPD) – 10,0 mg
- - 10,0 µL água oxigenada 30%
16. Lavar a placa quatro vezes com salina fisiológica com Tween 20 a 0,05%;
17. Adicionar o OPD ao tampão ácido e, em seguida, o peróxido de hidrogênio. Homogeneizar;
18. Distribuir 50 µL do substrato em todos os poços da placa;
19. Incubar a temperatura ambiente por 15 minutos, sob proteção da luz;
20. Adicionar 50 µL da solução de ácido sulfúrico 1,5 mol/L em todos os poços da placa.
Critérios de aceitação do Ensaio
O resultado do ensaio será considerado válido somente se as DOs dos soros controles estiverem dentro dos limites aceitáveis e determinados pelo fabricante. Caso contrário, o ensaio deve ser repetido.
Interpretação dos resultados
- O percentual de inibição (PI) dos soros em teste deve ser calculado pela fórmula PI = (média da DO dos soros em teste/média da DO do controle de antígeno) x 100;
- Amostra positiva (PI inferiores a 49%);
- Amostra negativa (PI superiores a 49%); e
- Amostra inconclusivo (PI 49% ≤ PI ≤ 51%). Soros com PI dentro desta faixa deverão ser submetidos à prova de titulação.
- Para a triagem de bovinos para o controle de vacinas serão considerados selecionados os animais com valor de PI superior a 51 %. No dia zero pós vacinação (0 dpv), animais reagentes ou inconclusivos deverão ser titulados. Caso os animais apresentem título inferior a 1,4 para os vírus C e O, e menor que 1,6 para o vírus A poderão ser utilizados. Até três, dos 18 bovinos utilizados no teste poderão ser eliminados em caso de reatividade no 0 dia pós vacinação (dpv).
Emissão dos resultados
Os resultados deverão ser emitidos em documento denominado “Relatório de Ensaio” e expresso como reagente, não reagente e inconclusivo.
Descarte de Amostras e Resíduos
- Antes da realização do descarte de amostras e produtos de ensaio deverão ser observados os prazos mínimos estabelecidos.
- Todo material utilizado na realização do ensaio deve ser imerso em cuba com solução de ácido cítrico 0,2%, hipoclorito de sódio 0,5% ou solução para descontaminação similar, por no mínimo de 1 hora;
- Após este período, todo o material utilizado na realização do ensaio deve ser submetido ao processo de autoclavação apropriado e validado. A efetividade de esterilização deve estar comprovada em procedimentos próprios do laboratório; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo processo de descarte.
Retenção de itens de ensaio
Soro sanguíneo
Poderão ser descartados 60 dias após a emissão do relatório de ensaio, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte.
¶ C. ELISA DE COMPETIÇÃO EM FSE LÍQUIDA (CFL) - Titulação
Materiais
- Luvas para procedimentos;
- Pipetas de vidro graduadas ou descartáveis;
- Provetas graduadas;
- Béqueres;
- Erlenmeyers;
- Ponteiras descartáveis;
- Descartador de ponteiras;
- Reservatórios para soluções (cubetas);
- Papel absorvente;
- Caneta para identificação de vidraria;
- Cubas para descarte de materiais resistente à autoclavação;
- Microplacas de fundo em “U”; e
- Microplacas NUNC maxsorb.
Equipamentos e instrumentos
- Autoclave;
- Geladeira;
- Estufa;
- Micropipetas monocanal e multicanal de volumes reguláveis;
- Pipetador automático ou manual;
- Leitora de ELISA;
- Cronômetros;
- Agitador de tubos tipo vórtex (opcional);
- Agitador de microplacas; e
- Lavadora de microplacas (opcional).
Insumos
- Set de ensaio de ELISA de competição em fase líquida (CFL) para a detecção de anticorpos contra a proteínas estruturais do vírus da Febre Aftosa (VFA), produzidos pelo Centro Panamericano de Febre Aftosa contendo soros captura, detector, controle negativo, fraco positivo e forte positivo, soros bloqueadores de bovino e coelho e antígeno;
- IgG de cabra anti-IgG de cobaio conjugado com peroxidase (Sigma nº catálogo A7289);
- Pastilhas de OPD (ortofenildiamina) de 2 ou 10mg;
- Albumina Bovina Grau II;
- Albumina Bovina Grau V;
- Fosfato de sódio;
- Ácido cítrico;
- Carbonato de sódio grau P.A.;
- Bicarbonato de sódio grau P.A;
- Peróxido de hidrogênio a 30%;
- Tween 20 (Sigma cat. Nº P-1379);
- Microplacas de fundo em “U”; e
- Microplacas NUNC maxsorb.
Soluções
- No preparo das soluções deve ser utilizado somente os reagentes fornecidos pelo fabricante, ou aqueles por ele indicados.
- Conjugados, substratos e solução de parada deverão ser utilizados obedecendo-se as condições do fabricante;
- No preparo da solução de lavagem deve-se assegurar que não existem cristais precipitados na solução;
- PBST (Tampão salina fosfatada pH 7,4 com 1% de ovoalbumina Grau II e 0,05% de Tween 20);
- Tampão PBST (preparo descrito no ensaio de traigem)
- Solução salina fisiológica 0,85% pH 7,2 – 7,4;
- Tampão carbonato-bicarbonato pH 9,6;
- Peróxido de hidrogênio a 30%; e
- Solução de ácido sulfúrico 1,5 mol/L.
Realização do ensaio
Sensibilização das placas com anticorpos captura – microplacas NUNC MaxSorb
- Identificar as placas em ordem sequencial;
- Descongelar os soros captura à temperatura ambiente;
- Preparar as diluições de uso de cada soro captura em tampão carbonato-bicarbonato, conforme recomendações do fabricante. Homogeneizar em agitador magnético;
- Colocar em cada poço da placa 100 µL de soro de captura diluído em tampão carbonato, distribuído como indicado a seguir;
- Empilhar as placas em grupos de 10, no máximo, e selar a placa superior;
- Incubar por 16 a 20 horas entre 4 ºC e 8 °C;
- Retirar da geladeira e mantê-las à temperatura ambiente por 1h;
- Descartar o conteúdo das placas e lavá-las uma vez com 200 µL de solução salina fisiológica por poço;
- Descartar o conteúdo das placas e batê-las sobre papel absorvente ou toalha;
- Adicionar 100 µL por poço de PBS com 1% de ovoalbumina Grau V;
- Incubar por 1h à temperatura ambiente;
- Descartar o conteúdo das placas e lavá-las uma vez com 200 µL de solução salina fisiológica por poço;
- Descartar o conteúdo das placas e batê-las sobre papel ou toalha absorvente; e
- As placas podem ser utilizadas imediatamente ou podem ser armazenadas. Para isto, cobri-las com filme plástico e armazená-las a – 20°C em posição invertida.
Preparo do tampão bloqueador (PBSTB)
- Descongelar o PBST à temperatura ambiente; e
- Adicionar 2 mL de soro de coelho e 2 mL de soro de bovino para 100 mL do tampão PBST e homogeneizar antes do uso.
Protocolo de titulação de 6 soros
- Em uma placa auxiliar (fase líquida), preparar a diluição dos soros conforme QUADRO 1;
- Adicionar 40 µL de PBSTB nas colunas 2 a 6 e 8 a 12. Na linha H, colunas 7 a 12 (branco), adicionar 80 µL de PBSTB;
- Adicionar 50 µL de cada soro nos seguintes poços: soro 01 (A1 e B1), soro 02 (C1 e D1), soro 03 (E1 e F1), soro 04 (G1 e H1), soro 05 (A7 e B7), soro 06 (C7 e D7). Trocar as ponteiras a cada amostra ou soro controle. Utilizar ponteiras novas;
- Adicionar 50 µL de soro controle negativo (C-) puro no poço E7, 50ìL do soro fraco positivo (C+) diluído 1:5 em F7 e 50ìL do soro forte positivo (C++) diluído 1:100 em G7;
- Diluir os soros controles homogeneizando três vezes e transferindo sucessivamente 10 µL da coluna E7 até E10 (soro negativo), da coluna F7 até F10 (soro fraco positivo) e da G7 até G10 (forte positivo). Ao final descartar 10 µL da última diluição;
- Diluir os soros teste transferindo 10 µL da coluna 1 para a coluna 2. Homogeneizar três vezes e transferir 10 µL da coluna 2 para a coluna 3, e assim até a coluna 6 (soros de 1 a 4) e do mesmo modo da coluna 7 a 12 (soros 5 e ¨6). Descartar os 10 µL da última diluição; e
- Prosseguir conforme item “Execução”.
QUADRO 1 - Distribuição das amostras (6 soros) e controles na placa auxiliar (fase líquida).
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | S1 | S1 | S1 | S1 | S1 | S1 | S5 | S5 | S5 | S5 | S5 | S5 |
| B | S1 | S1 | S1 | S1 | S1 | S1 | S5 | S5 | S5 | S5 | S5 | S5 |
| C | S2 | S2 | S2 | S2 | S2 | S2 | S6 | S6 | S6 | S6 | S6 | S6 |
| D | S2 | S2 | S2 | S2 | S2 | S2 | S6 | S6 | S6 | S6 | S6 | S6 |
| E | S3 | S3 | S3 | S3 | S3 | S3 | C- | C- | C- | C- | CA | CA |
| F | S3 | S3 | S3 | S3 | S3 | S3 | C+ | C+ | C+ | C+ | CA | CA |
| G | S4 | S4 | S4 | S4 | S4 | S4 | C++ | C++ | C++ | C++ | CA | CA |
| H | S4 | S4 | S4 | S4 | S4 | S4 | B | B | B | B | B | B |
Execução do Ensaio
- Diluir o antígeno à metade da concentração recomendada pelo fabricante;
- Acrescentar 40 µL do antígeno diluído em todos os poços, com exceção dos poços destinados aos brancos (H7 a H12);
- Incubar as placas por 60 minutos a 37 °C ± 1 °C, sendo os primeiros 20 minutos sob agitação;
- Descongelar as placas de fase sólida previamente sensibilizada 20 minutos na geladeira, 20 minutos à temperatura ambiente e 20 minutos na estufa a 37 °C ± 1 °C (em cada etapa, deixá-las invertidas sobre papel toalha);
- Identificar as placas de fase sólida;
- Transferir 50 µL de cada poço da fase líquida para a placa de fase sólida;
- Incubar por 30 minutos a 37 °C ± 1 °C, sob agitação;
- Preparar a diluição do soro detector conforme recomendação do fabricante. Incubar a 37 °C ± 1 °C até o momento do uso;
- Lavar a placa três vezes com 300 µL salina fisiológica com Tween 20 a 0,05 % (1 mL de Tween para 2 litros de salina);
- Distribuir 50 µL do soro detector em todos os poços da placa;
- Incubar a 37 °C ± 1 °C por 30 minutos, sob agitação. Preparar a diluição do conjugado e incubá-lo a 37 °C ± 1 °C até o momento do uso;
- Lavar a placa três vezes com salina fisiológica com Tween 20 a 0,05 %;
- Distribuir 50 µL do conjugado em todos os poços da placa;
- Incubar a 37 °C ± 1 °C por 30 minutos, sob agitação
- Preparar a solução de substrato-cromógeno nas seguintes proporções (quantidade suficiente para cinco placas), como descrito abaixo:
- - Fosfato de sódio 0,2 mol/L - 7,0 mL
- - Ácido cítrico 0,1 mol/L – 6,5 mL
- - Água destilada ou deonizada – 11,5 mL
- - Ortho-phenyldiamine (OPD) – 10,0 mg
- - 10,0 µL água oxigenada 30%.
16. Lavar a placa quatro vezes com 300 µL salina fisiológica com Tween 20 a 0,05 %;
17. Adicionar o OPD ao substrato e, em seguida, a água oxigenada. Homogeneizar;
18. Distribuir 50 µL do substrato-cromógeno em todos os poços da placa;
19. Incubar a temperatura ambiente por 15 minutos, sob proteção da luz;
20. Adicionar 50 µL da solução de ácido sulfúrico 1,5 mol/L em todos os poços da placa;
21. Proceder à leitura das placas em leitor de ELISA com filtro de 492 nm.
Critérios de aceitação do Ensaio
O resultado do ensaio será considerado válido somente se as Densidades Óticas (DOs) dos soros controles estiverem dentro dos limites aceitáveis e determinados pelo fabricante. Caso contrário, o ensaio deve ser repetido.
Interpretação dos resultados
- Para cálculo do título 50% dos soros, seguir os seguintes passos;
- Calcular a Densidade Ótica (DO) média do controle do antígeno (X);
- Obter 50% deste valor médio X/2 = Y;
- A partir do valor médio obtido anteriormente (Y), eleger a leitura imediatamente superior (A);
- Da mesma forma, eleger a leitura imediatamente inferior (B);
- Subtrair a leitura inferior da superior (A-B) = (Z);
- Subtrair do valor médio (Y), a leitura inferior (B): (Y-B);
- Multiplicar o logaritmo do fator de diluição (C) por (Y-B);
- Dividir o valor obtido no item 7 pelo valor de Z;
- Somar o valor obtido no item 8 com o logaritmo da diluição da leitura inferior B (D);
- Fórmula da interpolação linear, expressa como: Título 50%= ((Y-B)xC)/Z + D
- O resultado final será emitido como o valor do título alcançado no cálculo anterior.
Emissão dos resultados
Os resultados deverão ser emitidos e expresso com o título final do soro.
Descarte de Amostras e Resíduos
- Antes da realização do descarte de amostras e produtos de ensaio deverão ser observados os prazos mínimos estabelecidos. Retenção de Itens de Ensaio
- Todo material utilizado na realização do ensaio deve ser imerso em cuba com solução de ácido cítrico 0,2%, hipoclorito de sódio 0,5% ou solução para descontaminação similar, por no mínimo de 1 hora;
- Após este período, todo o material utilizado na realização do ensaio deve ser submetido ao processo de autoclavação apropriado e validado. A efetividade de esterilização deve estar comprovada em procedimentos próprios do laboratório;
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo processo de descarte.
Retenção de itens de ensaio
Soro sanguíneo
Poderão ser descartados 60 dias após a emissão do relatório de ensaio, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte.
¶ D. Ensaio Imunoenzimático de Eletrotransferência (EITB)
Materiais
- Luvas para procedimentos;
- Pipetas de vidro graduadas ou descartáveis;
- Provetas graduadas;
- Béqueres;
- Erlenmeyers;
- Ponteiras descartáveis;
- Descartador de ponteiras;
- Reservatórios para soluções (cubetas);
- Papel absorvente;
- Caneta para identificação de vidraria;
- Bandejas com canaletas para tiras de nitrocelulose; e
- Cubas para descarte de materiais resistente à autoclavação.
Equipamentos e instrumentos
- Autoclave;
- Geladeira;
- Micropipetas monocanal de volumes reguláveis ajustável (4 µL, 500 µL, 600 µL, 800 µL, 1 mL);
- Pipetador automático ou manual;
- Cronômetros;
- Agitador de tubos tipo vórtex (opcional);
- Agitador de tipo rocker; e
- Balança com capacidade de pesar 2,5 gramas.
Insumos
- O kit denominado NCPanaftosa – Prova Confirmatória – Bovino é composto pelo conjunto de reagentes necessários para realização do ensaio Imunoenzimático que permite a detecção in vitro de anticorpos contra as proteínas não-capsidiais (PNC) 3ABC, 3D, 2C, 3B, e 3A do Vírus da Febre Aftosa (VFA) no soro de bovídeos (bovinos e bubalinos) através de uma prova de EITB, utilizando como prova inicial o kit NCPanaftosa – Prova Triagem;
- Tiras de nitrocelulose previamente sensibilizadas com as proteínas 3A, 3B, 2C, 3D e 3ABC (NC);
- Solução de lavagem concentrada 10 X (BL);
- Lisado de Escherichia coli (EC);
- Soro Controle negativo (CN);
- Soro Controle positivo Padrão 1 (CP1);
- Soro Controle positivo Padrão 2 (CP2);
- Leite em pó desnatado (LP);
- Conjugado 100X Concentrado (CJ);
- Diluente de Substrato (DS);
- NBT - Nitro Blue Tetrazolium (para substrato cromógeno) (NB);
- BCIP - 4-5 Bromo 4-Chloro- 3-Indolyl Phosphate (para substrato cromógeno) (BC);
- Controle laboratório (CL); e
- Soro sabidamente positivo (controle interno).
Soluções
- No preparo das soluções deve ser utilizado somente os reagentes fornecidos pelo fabricante, ou aqueles por ele indicados;
- Conjugados, substratos e solução de parada deverão ser utilizados obedecendo-se as condições do fabricante;
- No preparo da solução de lavagem deve-se assegurar que não existem cristais precipitados na solução;
- Tampão de lavagem (BL) 1x em água destilada;
- Tampão de saturação, volume para quatro tiras:
- 0,5 g de leite em pó desnatado (fornecido no kit)
- 1,0 ml de tampão de lavagem 10X (fornecido no kit)
- 10,0 µL de e.coli (fornecido no kit)
- q.s.p. para 10,0 ml de água destilada ou deionizada
- Substrato – cromógeno (NBT/BCIP), volume para quatro tiras:
- 28,0 µL de NBT (fornecido no kit)
- 14,0 µL de BCIP (fornecido no kit)
- 4,0 ml de diluente do substrato (fornecido no kit).
Realização do ensaio
Preparo dos reagentes
- Aproximadamente uma hora antes de começar a prova retire da geladeira as tiras sensibilizadas, buffer de lavagem 10x e diluente de substrato para permitir que estabilizem a temperatura ambiente (20 ºC a 25 ºC);
- Prepare o buffer de lavagem 1x e o buffer de saturação, permitindo que também se estabilizem a temperatura ambiente;
- Retire os outros reagentes, soros padrão, E. coli, conjugado 100X, NBT, BCIP, na hora de usá-los;
- Prepare o protocolo de reação da prova, levando em consideração que devem ser reservadas quatro tiras de cada gel para os soros controle (CN, CP1, CP2 e CL). Os controles devem ser sempre repetidos em cada gel e para cada prova, já que os resultados devem ser sempre interpretados por comparação a reatividade do soro problema com o do controle CP1, processado no mesmo gel e na mesma prova;
- É recomendada a homogeneização dos reagentes antes de usá-los; e
- A diluição do conjugado e do substrato deve ser realizada entre 5 e 10 minutos antes do seu uso.
Saturação das tiras
- Coloque uma tira em cada uma das canaletas das bandejas usando pinça plástica. Adicione 800 µL de buffer de saturação em cada canaleta, verifique que as tiras tenham ficado bem submersas e com as respectivas numerações visíveis;
- Coloque as bandejas sobre o agitador e deixe incubando durante 30 minutos à temperatura ambiente; e
- A velocidade do agitador deve ser de 6 ciclos oscilatórios (ida e volta) /minuto, sendo a mesma mantida durante toda a prova.
Incubação das amostras
- Adicione aos 800 µL de buffer de saturação 4 microlitros (µL) da amostra ou soro controle (diluição final 1:200) de acordo com a ordem estabelecida no protocolo de prova;
- Para permitir que a reação se inicie simultaneamente em todas as canaletas, posicione o agitador durante a adição dos soros de tal forma que as bandejas fiquem inclinadas num ângulo de aproximadamente 30º. Posicione as tiras na parte superior da canaleta para que não tenham contato com o buffer na parte inferior, onde se faz a adição das amostras e dos soros controle; e
- Incube com agitação durante 60 minutos a temperatura ambiente. Verifique que as tiras tenham ficado bem submersas e com as respectivas numerações visíveis ao operador.
Lavagem
- Concluída a etapa de incubação elimine o buffer de saturação inclinando a bandeja, evitando que o líquido transborde de uma canaleta para outra;
- Emborque a bandeja e deixe secar muito bem sobre papel toalha;
- Lave abundantemente as canaletas e tiras com buffer de lavagem 1x usando uma pisseta;
- Descarte este buffer de lavagem e volte a lavar da mesma maneira pelo menos outras 2 vezes;
- Seque as bandejas com papel toalha;
- Adicione aproximadamente 1 mL de buffer de lavagem 1x por canaleta e deixe agitando durante 5 minutos. Repetir esta etapa mais duas vezes; e
- Após a última lavagem seque bem as bandejas batendo sobre o papel toalha.
Incubação do conjugado
- Dilua o conjugado e aplique 600 µL por canaleta, posicionando as bandejas de acordo como indicado em “Incubação das amostras” e verifique novamente que as tiras fiquem bem submersas e o lado numerado das tiras esteja visível;
- Incube com agitação durante 60 minutos à temperatura ambiente; e
- Ao final proceda da lavagem das tiras conforme descrito.
Incubação do substrato cromógeno
- Prepare o substrato cromógeno e aplique 500 µL por canaleta posicionando as bandejas de acordo com o indicado em “Incubação de amostras”;
- Verifique que as tiras fiquem bem submersas e o lado numerado das tiras esteja para cima, visível ao operador;
- Incube com agitação até que a tira do CP1 desenvolva cinco bandas visíveis (aproximadamente 15 minutos);
- Após, descarte ou aspire o substrato – cromógeno e lave as tiras abundantemente com água destilada;
- Por último seque bem as bandejas batendo sobre as mesmas emborcadas sobre papel toalha;
- Deixe as tiras secar por aproximadamente duas horas à temperatura ambiente dentro das bandejas ou então com ajuda de uma pinça coloque-as sobre papel de filtro. Alternativamente pode-se colocar as tiras em estufa a 56°C durante aproximadamente 30 minutos dentro das bandejas; e
- Uma vez secas é recomendado colar com fita adesiva transparente em um formulário específico, posicionando-as de tal maneira que as bandas fiquem ordenadas para a análise da esquerda para a direita na seguinte disposição: 3A, 3B, 2C, 3D e 3ABC.
Critérios de aceitação do Ensaio
Para considerar uma prova válida e proceder à interpretação dos resultados, os soros controle devem satisfazer os seguintes critérios:
- Soro controle positivo (CL): deve apresentar reatividade intensa para os antígenos 3A, 3B, 3D e 3ABC podendo ter menor reatividade (intensidade) para o antígeno 2C. É acrescentado ao ensaio como Controle do Laboratório (CL), que não é fornecido no KIT.
- Soro controle positivo (CP2): Deve apresentar superior à do CP1 para os cinco (5) antígenos com bandas bem visíveis.
- Soro controle limite (CP1): Deve apresentar fraca reatividade para os cinco (5) antígenos tal que torne as bandas apenas visíveis.
- Soro controle negativo (CN): Não deve apresentar banda de reação para nenhuma das cinco proteínas.
Interpretação do resultado
Comparar a intensidade da reação do(s) soro(s) testado(s) com a do soro controle limite (CP1). De acordo com o número de proteínas reagentes e sua intensidade de cor, o resultado pode ser
- Resultado reativo:
Soro reativo que apresenta reatividade igual ou maior que a do soro controle limite (CP1) para as proteínas 3A, 3B, 3D e 3ABC, sendo que a proteína 2C pode ou não aparecer reativa na amostra de teste.
- Resultado negativo:
- Ausência total de reatividade para as cinco proteínas;
- Reatividade com intensidade menor da banda correspondente do CP1 para cada uma das cinco proteínas; e
- Reatividade igual ou maior a da banda correspondente do CP1 para um máximo de duas proteínas.
- Resultado indeterminado:
- Presença de bandas de reação para três proteínas com intensidade igual ou maior àquela das bandas correspondentes do CP1; ou
- Presença de bandas de reação para quatro proteínas, sendo uma delas necessariamente 2C, com intensidade igual ou maior àquela das bandas correspondentes do CP1; e
- Em casos de resultados reagentes e indeterminados digitalizar o formulário de controle para consultas futuras.
- Repetição do ensaio:
Será realizada nos seguintes casos:
- Quando a prova for invalidada pelos controles, ou quando as tiras se apresentarem manchadas, de forma que prejudique a leitura. Neste caso, deverá ser repetida toda a prova; e
- Quando houver discordância entre as leituras dos dois analistas em algum soro. Neste caso deverá ser repetido somente o soro em questão em triplicata.
Emissão dos resultados
Os resultados deverão ser emitidos e expresso como REATIVO, NÃO REATIVO e indeterminado
Descarte de Amostras e Resíduos
- Antes da realização do descarte de amostras e produtos de ensaio deverão ser observados os prazos mínimos estabelecidos. Retenção de Itens de Ensaio
- Todo material utilizado na realização do ensaio deve ser imerso em cuba com solução de ácido cítrico 0,2%, hipoclorito de sódio 0,5% ou solução para descontaminação similar, por no mínimo de 1 hora;
- Após este período, todo o material utilizado na realização do ensaio deve ser submetido ao processo de autoclavação apropriado e validado. A efetividade de esterilização deve estar comprovada em procedimentos próprios do laboratório;
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo processo de descarte.
Retenção de itens de ensaio
Soro sanguíneo
Poderão ser descartados 60 dias após a emissão do relatório de ensaio, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte.
¶
¶ E. Teste de Virusneutralização (VN)
Materiais
- Luvas para procedimentos;
- Pipetas de vidro graduadas ou descartáveis;
- Provetas graduadas;
- Béqueres;
- Erlenmeyers;
- Frascos de vidro tipo penicilina com tampa;
- Ponteiras descartáveis;
- Descartador de ponteiras;
- Reservatórios para soluções (cubetas);
- Papel absorvente;
- Microplacas para cultivo celular em poliestireno cristal com 96 cavidades de fundo chato;
- Caneta para identificação de vidraria; e
- Cubas para descarte de materiais resistente à autoclavação.
Equipamentos e instrumentos
- Autoclave;
- Cabine de segurança biológica classe II B1 (requisito mínimo);
- Geladeira;
- Freezer;
- Estufa com atmosfera de CO2;
- Estufa;
- Banho seco ou que empregam água;
- Termômetros;
- Micropipetas mono e multicanais de volumes reguláveis;
- Pipetador automático ou manual;
- Agitador de tubos;
- Microscópio invertido;
- Balança analítica; e
- Centrífuga refrigerada.
Insumos
- Suspensão celular de linhagem sensível (BHK-21);
- Meio MEM (Meio Essencial Mínimo, reconstituído de acordo com o fabricante);
- Soro fetal bovino (SFB) livre de pestivírus (BVDV) e micoplasma;
- Solução de antibióticos e antifúngicos;
- Amostra controle reagente e não reagente para os vírus da Febre Aftosa; e
- Cepas do vírus da Febre Aftosa.
Soluções
- Meio MEM com adição de antimicrobianos;
- Solução de salina 0,15 mol/L %;
- Ácido cítrico 0,2 %;
- Solução salina 0,85 % fosfatada tamponada (PBS) pH 7,2-7,4; e
- Solução de antibióticos e antifúngicos.
Realização do ensaio
Método quantitativo
- Observação: avaliar a toxidez para apenas um sorotipo;
- Adicionar 91,3 μL de MEM na linha A (controle de toxidez) e linha B;
- Adicionar 50 μL de MEM nas demais linhas da placa;
- Distribuir as amostras (exemplo, soros 1 a 4) e controles como descrito no QUADRO 1 abaixo. Cada amostra deve ser adicionada em uma coluna;
- Adicionar 8,7 μL de soro (por poço) nas linhas A e B;
- Transferir 50 μL da mistura MEM / soro da linha B para C, e assim sucessivamente até a linha H. Ao final descartar 50 μL;
- Preparar as colunas referentes aos controles conforme descrito para os soros em teste;
- Para amostras que já tiveram a toxidez avaliada (para o sorotipo A) proceder como descrito abaixo para o sorotipo O:
- Adicionar 91,3 μL de MEM na linha A;
- Adicionar 50 μL de MEM nas demais linhas da placa;
- Distribuir as amostras (exemplo, soros 1 a 4) e controles como descrito no QUADRO 2 abaixo. Cada amostra deve ser adicionada em duas colunas;
- Adicionar 8,7 μL de soro (por poço) na linha A;
- Transferir 50 μL da mistura MEM / soro da linha A para B, e assim sucessivamente até a linha H. Ao final descartar 50 μL; e
- Transferir 50 μL da mistura MEM / soro da linha A para B, e assim sucessivamente até a linha H. Ao final descartar 50 μL.
QUADRO 1 - Distribuição das amostras pelo método quantitativo com avaliação de toxidez – sorotipo A
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | Log | TX | |
| A | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | CC | CC | CC | ||
| B | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | CC | CC | CC | 1,4 | 1/23 |
| C | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | CC | CC | CC | 1,7 | 1/46 |
| D | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | CC | CC | CC | 2,0 | 1/92 |
| E | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | CC | CC | CC | 2,3 | 1/184 |
| F | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | CC | CC | CC | 2,6 | 1/368 |
| G | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | CC | CC | CC | 2,9 | 1/736 |
| H | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | CC | CC | CC | >=3,2 | 1/1.472 |
| RT | ||||||||||||||
QUADRO 2 - Distribuição das amostras pelo método quantitativo sem avaliação de toxidez – sorotipo A
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | Log | TX | |
| A | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | CC | CC | CC | 1,4 | 1/23 |
| B | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | CC | CC | CC | 1,7 | 1/46 |
| C | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | CC | CC | CC | 2,0 | 1/92 |
| D | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | CC | CC | CC | 2,3 | 1/184 |
| E | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | CC | CC | CC | 2,6 | 1/368 |
| F | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | CC | CC | CC | 2,9 | 1/736 |
| G | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | CC | CC | CC | 3,2 | 1/1.472 |
| H | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | CC | CC | CC | >=3,5 | 1/2.944 |
| RT | ||||||||||||||
Controles
- Utilizar uma coluna para o soro controle negativo (CN) e uma coluna para o soro controle positivo (CP).
- Adicionar o MEM e os soros controle em cada uma das colunas conforme descrito para as amostras teste.
- Para o controle de retrotitulação viral (RT), adicionar 50 μL de MEM nas três colunas destinadas à retrotitulação;
- Para o controle de células (CC), adicionar 100 μL de MEM. Reservar, pelo menos, uma coluna como controle de células. Nessa coluna não deve ser adicionado vírus ou soro.
¶ Diluição de trabalho (DT) do vírus, incubação e adição da suspensão celular
1. Utilizar um vírus de título conhecido titulado. A partir do título, obter a diluição de trabalho (DT) diminuindo-se 102 do título. Exemplo: vírus com título de 106 deve ser diluído a 104 (ou seja, 10.000 vezes). Preparar diluições em base 10 do vírus (10-1, 10-2, 10-3, etc.) até o obter a diluição de trabalho desejada, utilizando para o cálculo a fórmula Ci.Vi = Cf.Vf, em que:
Ci = concentração inicial 10-1;
Vi = volume inicial (volume de vírus a ser utilizado);
Cf = concentração final = DT; e
Vf = volume final (volume necessário de vírus, para uma placa utilizar 5 mL);
Exemplo:
Vírus com título de 104,5. DT = 102,5 = 1/316. Para 4 placas. Foram feitas duas diluições em base 10 (10-1 e 10-2)
Ci.Vi = Cf.Vf;
1/100.Vi = 1/316.20
Vi = 20.100/316 = 6,3 mL da diluição 1/100 (10-2) e 13,7 mL de MEM
2. A partir da diluição de trabalho, preparar diluições 1/10 (10-1), 1/100 (10-2) e 1/1.000 (10-3) utilizando MEM;
3. Adicionar 50 μL da suspensão viral diluída (1/10, 1/100 e 1/1.000) em cada um dos poços das colunas destinadas à retrotitulação (uma coluna por diluição), começando pela suspensão mais diluída, desta maneira pode-se utilizar o mesmo reservatório e as mesmas ponteiras;
4. Adicionar 50 μL da DT em todos os poços da placa, exceto nos destinados ao controle de toxidez, controle de células e retrotitulação;
5. Incubar as placas em estufa a 37 ºC durante uma hora;
6. Distribuir 50 μL de suspensão celular a 300.000 células/mL em todos os poços da placa, inclusive em todos os controles;
7. Incubar as placas por 48 a 72 horas a 37 ºC;
8. Realizar a leitura em microscópio invertido e promover registros:
P - Para indicar presença de efeito citopático (ECP) (Fig. 1B)
N - Para indicar ausência de ECP (Fig. 1A)
TX - Para indicar toxidez do soro; e
C - Para indicar contaminação.
FIGURA 1 – Monocamada celular de células BHK-21 sem ECP (1A) e com presença de ECP(1B) para Vírus da Febre Aftosa.
Vaccine Matching
- Ou avaliação da combinação antigênica determina a eficiência da vacina contra o vírus circulante, a partir da verificação da correspondência do vírus utilizado na produção da vacina e um vírus isolado no campo. Serão utilizados soros de animais vacinados, as etapas da obtenção do título desses soros são as mesmas descritas nos itens 6.1, 6.2 e 6.3, exceto pelo número de repetições das amostras avaliadas e consequentemente cálculo do título. São realizadas no mínimo quatro repetições de cada amostra. Os soros pós-vacinação devem ser derivados de pelo menos cinco animais 21-30 dias após a vacinação primária e/ou 21-30 dias após vacinação de reforço; e
- Os testes de combinação de vacinas baseados em valores de EPP são amplamente realizados na América do Sul pelo PANAFTOSA. Os títulos de anticorpos dos soros de animais vacinados obtidos utilizando o isolado de campo, são correlacionados nas tabelas que foram solicitadas ao PANAFTOSA. Valores de EPP médio de 75% conferem proteção aos animais vacinados.
Critérios de aceitação da Prova
- Avaliar os resultados dos controles para considerar o ensaio válido;
- O soro controle positivo deve apresentar variação compatível com a carta controle com coeficiente de variação máximo de 30%;
- A quantidade de vírus deve estar entre 31,6 e 316 TCID50; e
- Controle de células apresentando tapete íntegro em todos os poços isentos de contaminação ou toxidez.
Interpretação dos resultados
- Deve-se considerar como título, o inverso da diluição em que foi observado 50 % de neutralização. Esses valores devem ser convertidos em log base 10;
- São considerados positivos os soros em que houve 50 % de neutralização a partir da diluição 1/46;
- Nas exceções abaixo, podem ser considerados válidos os seguintes resultados:
- Soros reagente (título maior ou igual a 1,7) em placas com mais de 316 TCID50;
- Soros não reagentes (título inferior a 1,7) em placas com menos de 31,6 TCID50;
- A amostra será considerada tóxica quando se observar a ausência de multiplicação celular, ou destruição das células por componentes do soro no poço de controle de toxidez. Geralmente é caracterizada pela sedimentação do cultivo semeado no fundo do poço.
- A amostra será considerada contaminada quando houve presença de contaminação bacteriana ou por fungos impedindo a interpretação do resultado
4. Para o cálculo do título de anticorpos do vaccine matching aplicar a fórmula a seguir:
- Número de cavidades protegidas x 0,25 (peso de cada cavidade por diluição, neste caso 0,25 pois foram realizadas quatro repetições) – 0,5 (constante título 50%) x 0,3 (log de 2 - intervalo da diluição base 2) + 1,4 (log da menor diluição do soro que entrou na prova (neste caso, iniciou diluição 1:23 portanto log 23 = 1,4); e
- Determinar o AntiLog do resultado para saber o título de anticorpos.
Exemplo:
Número de cavidades protegidas = 15
15 x 0,25 = 3,75 – 0,5 = 3,25 x 0,3 = 0,975 + 1,4 = 2,4
AntiLog 2,4 = 251,2
Portanto o título de anticorpos expresso em número aritmético será 251,2 ou expresso em log10 2,4.
A relação entre o título obtido com o isolado de campo e o vírus vacinal é então expressa como um valor "r" como:
r1 = (Média do título aritmético recíproco do soro de referência contra o vírus de campo) / (Média do título aritmético recíproco do soro de referência contra o vírus da vacina)
5. Na interpretação dos resultados dos testes de reatividade cruzada, geralmente é aceito que, no caso da Virusneutralização, valores de r1 maiores que 0,3 indicam que o isolado de campo é suficientemente semelhante ao vírus da vacina. Assim sendo, o uso de uma vacina com base nessa amostra de vírus, provavelmente irá conferir proteção contra desafio, com o isolado de campo.
Emissão dos resultados
Os resultados deverão ser emitidos e expresso como REAGENTE, NÃO REAGENTE. Caso a amostra seja considerada reagente, deve ser descrito a valor do título final, que é expresso como o logaritmo da diluição em que houve 100% de Virusneutralização.
Descarte de Amostras e Resíduos
- Antes da realização do descarte de amostras e produtos de ensaio deverão ser observados os prazos mínimos estabelecidos. Retenção de Itens de Ensaio
- Todo material utilizado na realização do ensaio deve ser imerso em cuba com solução de ácido cítrico 0,2%, hipoclorito de sódio 0,5% ou solução para descontaminação similar, por no mínimo de 1 hora;
- Após este período, todo o material utilizado na realização do ensaio deve ser submetido ao processo de autoclavação apropriado e validado. A efetividade de esterilização deve estar comprovada em procedimentos próprios do laboratório; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo processo de descarte.
Retenção de itens de ensaio
Soro sanguíneo
- Poderão ser descartados 60 dias após a emissão do relatório de ensaio, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte; e
- Amostras positivas de qualquer origem devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo elas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
¶ F. Isolamento viral Febre Aftosa
Materiais
- Luvas para procedimentos;
- Pipetas de vidro graduadas ou descartáveis;
- Provetas graduadas;
- Béqueres;
- Erlenmeyers;
- Frascos de vidro tipo penicilina com tampa;
- Tubo de centrífuga;
- Ponteiras descartáveis;
- Descartador de ponteiras;
- Reservatórios para soluções (cubetas);
- Papel absorvente;
- Microplacas para cultivo celular em poliestireno com 24 cavidades de fundo chato;
- Microplacas para cultivo celular em poliestireno com 96 cavidades de fundo chato;
- Caneta para identificação de vidraria;
- Cubas para descarte de materiais resistente à autoclavação;
- Areia estéril;
- Filtro para seringa (0,45 µm);
- Gral e Pistilo;
- Tesoura cirúrgica e bisturi; e
- Seringa descartável.
Equipamentos e instrumentos
- Autoclave;
- Cabine de segurança biológica classe II A (requisito mínimo);
- Geladeira;
- Freezer;
- Ultrafreezer;
- Estufa com atmosfera de CO2;
- Estufa;
- Banho que empregam água;
- Termômetros;
- Micropipetas mono e multicanais de volumes reguláveis;
- Pipetador automático ou manual;
- Agitador de tubos tipo vortex;
- Microscópio invertido.
- Cronômetro
- Balança dois pratos;
- Centrífuga refrigerada com rotor para tubos de 50 mL; e
- Homogeneizador (Omni-mixer).
Insumos
- Suspensão celular de linhagem sensível (ZZR, BHK 21, IB-RS2);
- Meio MEM (Meio Essencial Mínimo, reconstituído de acordo com o fabricante);
- Soro fetal bovino (SFB), livre de pestivirus (BVDV) e micoplasma;
- Solução de antibióticos e antifúngicos;
- Cepas do vírus da Febre Aftosa;
- Clorofórmio; e
- Tri-cloro-tri-fluoretano (TTE).
Soluções
- Meio MEM adicionado de 2% de soro fetal bovino para BHK 21 e 5% para as demais linhagens, e tradado com solução de antibióticos e antifúngicos;
- Solução de salina 0,15 mol/L %;
- Ácido cítrico 0,2 %; e
- Solução de antibióticos e antifúngicos.
Realização do ensaio
Processamento do epitélio e crostas
- Picotar o epitélio com auxílio de tesoura;
- Um fragmento de epitélio deve ser colocado no gral e macerado com 1 a 2 mL de MEM, ou em microtubo com esfera para uso no macerador. Estocar o restante conservando o frasco de origem em freezer. Este deve ser identificado pelo número da requisição;
- Para encaminhamento para a biologia molecular um fragmento de aproximadamente 100 mg deve ser adicionado a um microtubo contendo 1,0 mL de Trizol ou em cartucho para extração de ácidos nucleicos;
- No caso do recebimento de amostras de epitélio de mais de um animal da propriedade pode ser realizado um pool respeitando as proporções de tecido e MEM;
- Adicionar 1 a 2 mL de MEM e, opcionalmente areia estéril, e macerar com auxílio de pistilo até o material ficar com aspecto de pasta RETIRAR;
- Adicionar o volume de MEM suficiente para que a suspensão tenha uma proporção aproximada de 1/5;
- Transferir a suspensão do gral para um tubo de centrífuga previamente identificado;
- Centrifugar a 2000 g sob refrigeração (2 ºC a 8 ºC) por 2 minutos; e
- Filtrar o sobrenadante e acondicionar em tubo identificado. Manter em freezer.
Processamento de LEF
- Amostras de LEF serão submetidas ao isolamento de vírus apenas em caso de positividade na RT-qPCR;
- Identificar o copo do homogeneizador e um tubo de centrífuga de 50 mL; e
- Retirar uma alíquota de 400 microlitros e acrescentar 1,0 mL de trizol que será destinada aos testes moleculares.
Processamento com clorofórmio
- Colocar 8 mL de clorofórmio no copo do homogeneizador, transferir 10 mL de amostra e emulsificar a amostra em banho de gelo durante 1 a 2 minutos a 10.000 rpm dentro da cabine de segurança biológica;
- Para verificar se houve homogeneização completa da amostra, observar o aspecto “cremoso”, sem separação de fases, entre o clorofórmio e a amostra;
- Caso tenha ocorrido separação, adicionar um volume de 0,5 mL de soro equino e emulsificar novamente. Repetir o processo quantas vezes forem necessárias até a amostra apresentar o aspecto desejado;
- Após a homogeneização, transferir a amostra do copo para um tubo de centrífuga previamente identificado;
- Centrifugar sob refrigeração (10°C) a 2.000 rpm durante 30 minutos;
- Avaliar se houve separação do sobrenadante e a formação de um sedimento gelatinoso (que comprova a adequada emulsificação da amostra);
- Retirar uma alíquota de 400 µL e acrescentar 1,2 mL de Trizol que será destinada ao diagnóstico molecular;
- Aspirar o sobrenadante e armazenar em um tubo sob refrigeração (2º a 8ºC) até o momento da inoculação. Caso este procedimento não ocorra no mesmo dia conservar o material congelado até o dia da inoculação celular; e
- Após o término do processo, realizar a descontaminação da CSB com álcool iodado e ligar a lâmpada germicida por 10 minutos.
Processamento com TTE
- Medir o volume da amostra utilizando o tubo de centrífuga graduado;
- Transferir para o copo do Omni-Mixer;
- Adicionar TTE ao copo na proporção de 80% do volume da amostra;
- Manter as amostras refrigeradas até a homogeneização;
- Emulsificar a amostra em banho de gelo durante 1 a 2 minutos a 10.000 rpm dentro da CSB;
- Para verificar se houve homogeneização completa da amostra, observar o aspecto “cremoso”, sem separação de fases entre o TTE e a amostra;
- Caso tenha ocorrido separação adicionar um volume de 0,5 mL de soro equino e emulsificar novamente no homogeneizador. Repetir o processo quantas vezes forem necessárias até a amostra apresentar o aspecto desejado;
- Após a homogeneização transferir a amostra do copo para um tubo de centrífuga previamente identificado;
- Centrifugar sob refrigeração (10°C) a 2.000 rpm durante 30 minutos;
- Avaliar se houve separação do sobrenadante e a formação de um sedimento gelatinoso (que comprova a adequada emulsificação da amostra); e
- Retirar uma alíquota de 400 µL e acrescentar 1,2 mL de Trizol que será destinada à biologia molecular.
Suabes
Homogeneizar os tubos, filtrar conforme descrito no item “processamento de epitélio e crostas”.
Execução do Isolamento
- Os procedimentos podem ser realizados com células em suspensão ou em monocamada;
- No caso do uso de células em suspensão, apenas acrescentar o inóculo e incubar as células em estufa;
- Para a microplaca de 24 poços utilizar 0,5 mL de células por poço e para a garrafa de 25 cm2 utilizar 5 mL de células;
- Inocular 100 µL de inóculo para microplacas de 24 poços ou 0,5 mL para garrafas de 25 cm2;
- Incubar a microplaca ou garrafa por 48 a 72 horas em estufa de CO2;
- Ao final do período registrar os resultados; e
- Deve ser observada presença/ausência de efeito citopático (ECP) ou contaminação.
Segunda passagem
- Amostras em que foi observada contaminação na primeira passagem não devem ser submetidas à segunda passagem;
- Congelar as microplacas ou garrafas;
- Descongelar;
- Visualizar ao microscópio óptico o descolamento da monocamada celular. Em caso de necessidade repetir o processo de congelamento/descongelamento e/ou realizar a raspagem com o auxílio de uma ponteira;
- Congelar a garrafa ou microplaca com o restante do material da 1ª. passagem. Certificar que a placa está identificada com o número da requisição e a passagem da inoculação;
- Incubar a microplaca ou garrafa por 48 a 72 horas em estufa de CO2;
- Ao final do período registrar os resultados; e
- Deve ser observada presença ou ausência de efeito citopático
,ou mesmo de contaminação
Processamento das suspensões das passagens em células para diagnóstico confirmatório
- Em caso de se observar ECP na linhagem BHK, na ausência de resultado DETECTADO para os demais agentes testados nos métodos moleculares, é necessário submeter o material da segunda passagem para a RT-qPCR para Febre Aftosa;
- Em caso de dúvida quanto ao resultado do isolamento de vírus em células realizar a confirmação final pelo uso do RT-qPCR para Febre Aftosa;
- Para a RT-qPCR, congelar e descongelar a garrafa ou microplaca, retirar uma alíquota de 400 µL da suspensão e acrescentar 1,0 mL de Trizol;
- Em caso de resultado DETECTADO na PCR para Febre Aftosa executar o ELISA para tipificação (item 3.8) ou método molecular; e
- Em caso de resultado DETECTADO nos ensaios moleculares para qualquer agente, exceto Febre Aftosa, inocular o material em células sensíveis ao agente detectado. Confirmar com o isolamento viral por meio da realização de novo diagnóstico molecular.
Critérios de aceitação das provas
- As provas de identificação do agente serão consideradas válidas quando os cultivos celulares sabidamente infectados (controles DETECTADOS) apresentam efeito citopático caracterizado pelo destacamento do cultivo celular e formação de células sinciciais e ausências de ECP nos cultivos que não foram infectados (controles NÃO DETECTADOS ou de células);
- Na presença de ECP deverá ser realizada a confirmação do isolamento por método imunológico conforme descrito no item “ELISA SW para tipificação de antígenos do vírus da Febre Aftosa” ou por método molecular; e
- Controle de células apresentando tapete íntegro em todos os poços isentos de contaminação ou toxidez.
Interpretação dos resultados
- O material será considerado NÃO DETECTADO quando não apresentar ECP após as duas passagens em cultivo de células (Fig. 2A);
- O material será considerado DETECTADO quando apresentar ECP (Fig. 2B) durante as passagens em cultivo celular, nesse caso sendo necessária realização de testes de tipificação (ELISA ou RT-PCR) para confirmação do isolado viral;
- A amostra será considerada tóxica quando se observar a ausência de multiplicação celular, ou destruição das células por componentes do soro no poço de controle de toxidez. Geralmente é caracterizada pela sedimentação do cultivo semeado no fundo do poço; e
- A amostra será considerada contaminada quando houve presença de contaminação bacteriana ou por fungos impedindo a interpretação do resultado.
FIGURA 1 – Monocamada celular de células BHK-21 sem ECP (2A) e com presença de ECP(2B) para Vírus da Febre Aftosa.
Emissão dos resultados
Os resultados deverão ser emitidos e expresso como DETECTADO OU NÃO DETECTADO.
Descarte de Amostras e Resíduos
- Antes da realização do descarte de amostras e produtos de ensaio deverão ser observados os prazos mínimos estabelecidos;
- Todo material utilizado na realização do ensaio deve ser imerso em cuba com solução de ácido cítrico 0,2%, hipoclorito de sódio 0,5% ou solução para descontaminação similar, por no mínimo de 1 hora;
- Após este período, todo o material utilizado na realização do ensaio deve ser submetido ao processo de autoclavação apropriado e validado. A efetividade de esterilização deve estar comprovada em procedimentos próprios do laboratório; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo processo de descarte.
Retenção de itens de ensaio
Amostras de tecido e produtos de isolamento viral
Alíquotas das amostras positivas de qualquer origem devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo elas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
¶ G. ELISA SW para tipificação de antígenos do vírus da Febre Aftosa e Estomatite Vesicular
Materiais
- Luvas para procedimentos;
- Pipetas de vidro graduadas ou descartáveis;
- Provetas graduadas;
- Béqueres;
- Erlenmeyers;
- Ponteiras descartáveis;
- Descartador de ponteiras;
- Reservatórios para soluções (cubetas);
- Papel absorvente;
- Caneta para identificação de vidraria;
- Cubas para descarte de materiais resistente à autoclavação;
- Microplacas de fundo em “U”; e
- Microplacas NUNC MaxSorb.
Equipamentos e instrumentos
- Autoclave;
- Geladeira;
- Estufa;
- Micropipetas monocanal e multicanal de volumes reguláveis;
- Pipetador automático ou manual;
- Leitora de ELISA;
- Cronômetros;
- Agitador de tubos tipo vórtex (opcional);
- Agitador de microplacas; e
- Lavadora de microplacas (opcional).
Insumos
- Set de ensaio ELISA (SW), para a tipificação dos vírus da Febre Aftosa (VFA) e Estomatite Vesicular produzidos pelo Centro Panamericano de Febre Aftosa contendo soros capturas e detectores específicos, soros bloqueadores de bovino e coelho e antígenos.
- IgG de cabra anti-IgG de cobaio conjugado com peroxidase (Sigma nº catálogo A7289);
- Pastilhas de OPD (ortofenilldiamina) de 2 ou 10mg;
- Albumina Bovina Grau II;
- Albumina Bovina Grau V;
- Fosfato de sódio;
- Ácido cítrico;
- Carbonato de sódio grau P.A.;
- Bicarbonato de sódio grau P.A;
- Peróxido de hidrogênio a 30%
- Tween 20 (Sigma cat. Nº P-1379);
- Microplacas de fundo em “U”; e
- Microplacas NUNC MaxSorb.
Soluções
No preparo das soluções deve ser utilizado somente os reagentes fornecidos pelo fabricante, ou aqueles por ele indicados.
- Conjugados, substratos e solução de parada deverão ser utilizados obedecendo-se as condições do fabricante;
- No preparo da solução de lavagem deve-se assegurar que não existem cristais precipitados na solução;
- PBST (Tampão salina fosfatada pH 7,4 com 1% de ovoalbumina Grau II e 0,05% de Tween 20), preparado como descrito abaixo:
- PBS tween 20x fornecido no kit - 100 mL
- água destilada q;s.p. - 2 litros
- 20 g ovoalbumina grau II
- pH 7,4 a 7,6.
caso o set não forneça o PBS, formular:
- cloreto de potássio, 0,2 g;
- cloreto de sódio, 8,0 g;
- fosfato de potássio, 0,2 g;
- fosfato de sódio, 2,9 g;
- água destilada q.s.p. - 1 L;
- adicionar 0,5 ml de tween 20 em 1 L de PBS;
- 10 g de ovoalbumina grau II;
- filtrar com membrana 0,8 um.
- Solução salina fisiológica 0,85% pH 7,2 – 7,4;
- Tampão carbonato-bicarbonato pH 9,6;
- Peróxido de hidrogênio a 30%; e
- Solução de ácido sulfúrico 1,5 mol/L.
Realização do ensaio
Sensibilização das placas com anticorpos captura – microplacas NUNC MaxSorb
- Identificar as placas em ordem sequencial;
- Descongelar os soros captura à temperatura ambiente;
- Preparar as diluições de uso de cada soro captura em tampão carbonato-bicarbonato, conforme recomendações do fabricante. Homogeneizar em agitador magnético;
- Distribuir 100 µL dos soros capturas da seguinte maneira: colocar em cada poço da placa 100 µL de soro de captura diluído em tampão carbonato, distribuído como indicado a seguir: Soro de captura “O” (colunas 1 e 7), Soro de captura “A” (colunas 2 e 8), Soro de captura “C” (colunas 3 e 9), Soro de captura “NJ” (colunas 4 e 10), Soro de captura “IND” (colunas 5 e 11), e Soro de captura “negativo” (colunas 6 e 12);
- Empilhar as placas em grupos de 10, no máximo, e selar a placa superior;
- Incubar por 16 a 20 horas entre 4 ºC e 8 °C;
- Retirar da geladeira e mantê-las à temperatura ambiente por 1h;
- Descartar o conteúdo das placas e lavá-las com 300 µL de salina fisiológica com Tween 20 a 0,05 % por poço;
- Descartar o conteúdo das placas e batê-las sobre papel absorvente ou toalha;
- Adicionar 100 µL por poço de PBS com 1% de ovoalbumina Grau V;
- Incubar por 1h à temperatura ambiente;
- Descartar o conteúdo das placas e lavá-las uma vez com 200 µL de solução salina fisiológica por poço;
- Descartar o conteúdo das placas e batê-las sobre papel ou toalha absorvente; e
- As placas podem ser utilizadas imediatamente ou podem ser armazenadas. Para isto, cobri-las com filme plástico e armazená-las a – 20°C em posição invertida.
Preparo do tampão bloqueador (PBSTB)
- Descongelar o PBST à temperatura ambiente; e
- Adicionar 2 mL de soro de coelho e 2 mL de soro de bovino para 100 mL do tampão PBST e homogeneizar antes do uso.
Execução
- Descongelar as placas de fase sólida previamente sensibilizada 20 minutos na geladeira, 20 minutos à temperatura ambiente e 20 minutos na estufa a 37 º C ± 1 ºC (deixá-las sempre invertidas sobre papel toalha);
- Diluir os antígenos em PBSTB de acordo como recomendado pelo fabricante. Distribuir 50 µL dos antígenos, “O” na coluna 7G e 7H, “A” na coluna 8G e 8H, “C” na coluna 9G e 9H, “NJ” na coluna 10G e 10H, “IND” na coluna 11G e 11H, e “NEG” na coluna 12G e 12H;
- Distribuir 50 µL da amostra não diluída, nos poços: amostra 1, (A1 a A6 e B1 a B6), amostra 2, (C1 a C6 e D1 a D6), amostra 3, (E1 a E6 e F1 a F6), amostra 4, (G1 a G6 e H1 a H6), amostra 5, (A7 a A12 e B7 a B12), amostra 6, (C7 a C12 e D7 a D12) e amostra 7 (E7 a E12 e F7 a F12);
- Incubar por 30 ± 2 minutos, 37 °C ± 1 °C, sob agitação;
- Preparar a diluição dos soros detectores conforme recomendação do fabricante. Incubar a 37°C ± 1 °C até o momento do uso;
- Lavar a placa três vezes com salina fisiológica com Tween 20 a 0,05% (1 mL de Tween para 2 litros de salina) e em seguida secá-la em papel toalha;
- Distribuir 50 µL de cada soro detector nas respectivas colunas, de acordo com protocolo de sensibilização (ver item - Sensibilização das placas com anticorpos captura – microplacas NUNC MaxSorb);
- Incubar por 30 ± 2 minutos, 37 °C ± 1 °C, sob agitação. Preparar a diluição do conjugado e incubá-lo a 37 °C ± 1 °C até o momento do uso;
- Lavar a placa três vezes com 300 µL salina fisiológica com Tween 20 a 0,05% e secar a placa em papel toalha;
- Distribuir 50 µL do conjugado em todos os poços da placa;
- Incubar por 30 ± 2 minutos, 37 °C ± 1 °C, sob agitação;
- Preparar a solução de substrato-cromógeno nas seguintes proporções (quantidade suficiente para cinco placas), como descrito abaixo:
- - Fosfato de sódio 0,2 mol/L - 7,0 mL
- - Ácido cítrico 0,1 mol/L – 6,5 mL
- - Água destilada ou deonizada – 11,5 mL
- - Ortho-phenyldiamine (OPD) – 10,0 mg
- - 10,0 µL água oxigenada 30%
13. Lavar a placa três vezes com salina fisiológica com Tween 20 a 0,05% e secar a placa em papel toalha;
14. Adicionar o OPD ao tampão ácido e, em seguida, o peróxido de hidrogênio. Homogeneizar;
15. Distribuir 50 µL do substrato em todos os poços da placa;
16. Incubar a temperatura ambiente por 15 minutos, sob proteção da luz;
17. Adicionar 50 µL da solução de ácido sulfúrico 1,5 mol/L em todos os poços da placa; 18. Proceder à leitura das placas em leitor de ELISA com filtro de 492nm.
QUADRO 1 - Esquema de distribuição dos soros e controles
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | S1 | S1 | S1 | S1 | S1 | S1 | S5 | S5 | S4 | S4 | S4 | S4 |
| B | S1 | S1 | S1 | S1 | S1 | S1 | S5 | S5 | S4 | S4 | S4 | S4 |
| C | S2 | S2 | S2 | S2 | S2 | S2 | S6 | S6 | S6 | S6 | S6 | S6 |
| D | S2 | S2 | S2 | S2 | S2 | S2 | S6 | S6 | S6 | S6 | S6 | S6 |
| E | S3 | S3 | S3 | S3 | S3 | S3 | S7 | S7 | S6 | S6 | S6 | S6 |
| F | S3 | S3 | S3 | S3 | S3 | S3 | S7 | S7 |
S6
|
S6 | S6 | S6 |
| G | S4 | S4 | S4 | S4 | S4 | S4 | O | A | C | NJ | IND | NEG |
| H | S4 | S4 | S4 | S4 | S4 | S4 | O | A | C | NJ | IND | NEG |
Critérios de aceitação do Ensaio
- Calcular a média dos valores de densidade ótica (DO) para cada amostra testada/sorotipo, somando os dois poços correspondentes em cada coluna e dividindo por 2 (no caso do teste em duplicata);
- A DO do controle negativo deve ser < 0,1; e
- A DO dos controles de antígeno deve ser > 0,5.
Interpretação dos resultados
- Calcular a média dos valores de densidade ótica (DO) para cada amostra testada/sorotipo, somando os dois poços correspondentes em cada coluna e dividindo por 2 (no caso do teste em duplicata);
- Detectado, amostras com valor de DO > 0,3;
- Não detectado, amostras com DO < 0,2;
- Inconclusivas, amostras com valor de DO entre 0,2 e 0,3, e aquelas que todos os outros sorotipos apresentarem DO < 0,1; e
- Amostras concentradas podem apresentar valores de DO > 0,3 para mais de um sorotipo. Neste caso, essas amostras devem ser diluídas 1:5 ou 1:10 para confirmação do sorotipo.
Emissão dos resultados
Os resultados deverão ser emitidos e expresso como DETECTADO, NÃO DETECTADO, INCONCLUSIVO.
Descarte de Amostras e Resíduos
- Antes da realização do descarte de amostras e produtos de ensaio deverão ser observados os prazos mínimos estabelecidos;
- Todo material utilizado na realização do ensaio deve ser imerso em cuba com solução de ácido cítrico 0,2%, hipoclorito de sódio 0,5% ou solução para descontaminação similar, por no mínimo de 1 hora;
- Após este período, todo o material utilizado na realização do ensaio deve ser submetido ao processo de autoclavação apropriado e validado. A efetividade de esterilização deve estar comprovada em procedimentos próprios do laboratório; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo processo de descarte.
Retenção de itens de ensaio
Amostras positivas de qualquer origem devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo as mesmas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
¶ H. Técnica de PCR convencional com transcrição reversa RT-PCR para detecção do vírus da Febre Aftosa (VFA)
Materiais
- Luvas de procedimento nitrílicas ou de látex isentas de pó;
- Microtubos de volumes variados ou microplacas;
- Microplacas ou microtubos para leitura óptica de RT-qPCR;
- Tampas adesivas para microplacas para leitura óptica de RT-qPCR;
- Ponteiras com filtro, estéreis, livres de DNAses e RNAses;
- Estantes para microtubos; e
- Gaze ou papel toalha.
Equipamentos e instrumentos
- Autoclave;
- Cabine de segurança biológica com filtro HEPA classe II (requisito mínimo) ou estação de trabalho para PCR (Workstation PCR) com luz UV germicida;
- Geladeira;
- Freezer;
- Micropipetas mono e multicanais de volumes reguláveis;
- Pipetador automático ou manual;
- Termociclador;
- Balança de precisão;
- Centrífuga refrigerada com rotores para microtubos;
- Agitador de microtubos;
- Micro-ondas;
- Cuba e fonte para eletroforese;
- Microcomputador;
- Sistema de fotodocumentação; e
- Equipamento para extração automatizada de ácidos nucleicos (opcional).
Insumos
- Água livre de nucleases;
- Mix de dNTP;
- Oligonucleotídeos para RT-PCR (QUADRO 1);
- Kit de RT-PCR;
- Kit de extração de RNA (automática);
- Trizol (manual);
- Corante para ácidos nucleicos;
- Marcador de peso molecular;
- Tampão de carregamento (“loading buffer”);
- Gel de agarose; e
- Controle positivo para VFA (sempre utilizar RNA viral para averiguar eficiência da transcrição reversa).
QUADRO 1 - Sugestão de oligonucleotídeos para RT-PCR e RT-qPCR para detecção molecular do VFA
| Oligonucleotídeo | Tipo de PCR | Sequência | Referência |
| FMDV.3D.107.F | RT-qPCR | ACTGGGTTTTACAAACCTGTGA | Calahan, 2002 |
| FMDV.3D.107.R | GCGAGTCCTGCCACGGA | ||
| FMDV.3D.107.S | FAM-TCCTT TGCAC GCCGT GGGAC-BHQ1 | ||
| FMDV.5UTR.F | RT-qPCR | CACYT YAAGR TGACA YTGRT ACTGG TAC | Reid, 2001 |
| FMDV.5UTR.R | CAGAT YCCRA GTGWC ICITG TTA | ||
| FMDV.5UTR.S | FAM-CCTCG GGGTA CCTGA AGGGCATCC-Iowa Black | ||
| FMDV.3D.88.F | RT-qPCR | ACTGGGTTTTAWAAACCTGTGATG | Moniwa, 2007 |
| FMDV.3D.88.R | TCAACTTCTCCTGKATGGTCCCA | ||
| FMDV.3D.88.S | FAM-ATCCTCTCCTTTGCACGC-Iowa Black | ||
| FMDV.IRES.145.F | RT-qPCR | TAA CAW GGA CCC RCS GGG CC | Wernike, 2013 |
| FMDV.IRES.145.R | TGA AGG GCA TCC TTA GCC TG | ||
| FMDV.IRES.145.S | FAM - CAT GTG TGC AAY CCC AGC ACR G - BHQ | ||
| FMDV.UTR.328.F | RT-PCR | GCCTGGTCTTTCCAGGTCT | Reid, 2000 |
| FMDV.UTR.328.R | CCAGTCCCCTTCTCAGATC |
Soluções
- Solução de álcool 70º INPM; e
- Solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses.
Realização do ensaio
Extração de RNA
- A extração pode ser realizada de forma automatizada ou manual, através de kits de extração de RNA ou reagentes específicos para o tipo de material a ser analisado, seguindo as recomendações do fabricante;
- Não utilizar reagentes após a data de validade e não misturar reagentes de lotes diferentes; e
- Adicionar as seguintes amostras controle a cada procedimento de extração: controle negativo (água ou tecido bovino ou suíno).
Reação de amplificação de ácido nucleico (PCR)
- Realizar o ensaio em duas áreas separadas: uma para o preparo do mix de reação (sala de pré-PCR), isenta de material genético e amplicons, e outra para a transferência de RNA/cDNA
- Antes e após o preparo do mix de reação, descontaminar a cabine e os materiais a serem utilizados com solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses;
- e/ou álcool 70%; e
- As micropipetas utilizadas para o preparo do mix de reação e adição das amostras devem ser exclusivas para tais finalidades.
Preparo do mix de reação
- Preparar o mix de reação de acordo com protocolos validados e específicos para o agente pesquisado (VFA) em quantidade suficiente para o número de amostras a serem testadas, considerando algumas a mais;
- Adicionar o mix de reação a cada poço da microplaca (ou microtubos); e
- Devem ser incluídos nas análises:
- Controle positivo para VFA;
- Controle NÃO DETECTADO da extração;
- Branco (água livre de nucleases); e
- Controle DETECTADO e NÃO DETECTADO do kit utilizado (se houver).
Reação de RT -PCR
- Após o preparo do mix, adicionar o RNA nos poços da placa ou em microtubos identificados com a numeração da amostra a ser testada; e
- Realizar a RT-PCR conforme as especificações de temperatura do protocolo utilizado.
Eletroforese
- Preparar o gel de agarose em concentração adequada ao protocolo de PCR utilizado. Adicionar um corante para ácidos nucleicos em proporção suficiente para visualização das bandas;
- Para a corrida das amostras, adicionar tampão de carregamento (loading buffer) ao produto de PCR;
- Aplicar marcador de peso molecular em um dos poços do gel;
- Realizar a corrida em cuba de eletroforese, utilizando o tempo e a voltagem adequados para o volume do gel e o protocolo de PCR utilizado; e
- Visualizar o gel sob luz ultravioleta, fotografar com o auxílio de um fotodocumentador e analisar o resultado.
Critérios de aceitação da prova
- As amostras de controle positivo para VFA devem apresentar bandas de tamanhos correspondentes aos amplicons do protocolo utilizado; e
- As amostras de controle negativo (controle negativo da extração e branco) não devem apresentar bandas de amplificação.
Interpretação dos resultados
- Comparar os resultados das amostras testadas ao das amostras controle, a fim de classificá-las como positivas ou negativas;
- A leitura das bandas deve ser clara e livre de amplicons inespecíficos para o teste ser considerado satisfatório; e
- Qualquer amostra questionável deverá ser retestada.
Emissão dos resultados
- Os resultados deverão ser emitidos e expresso como “DETECTADO” ou “NÃO DETECTADO”; e
- Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
Descarte das amostras e Resíduos
- Após um período mínimo de 90 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas por dois analistas antes do descarte;
- Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
¶ I. Técnica de PCR em tempo real com transcrição reversa - RT-qPCR para VFA
Materiais
- Luvas de procedimento nitrílica ou de látex isentas de pó;
- Microtubos de volumes variados ou microplacas;
- Microplacas ou microtubos para leitura óptica de RT-qPCR;
- Tampas adesivas para microplacas para leitura óptica de RT-qPCR;
- Ponteiras com filtro, estéreis, livres de DNAses e RNAses;
- Estantes para microtubos; e
- Gaze ou papel toalha.
Equipamentos e instrumentos
- Autoclave;
- Cabine de segurança biológica com filtro HEPA classe II (requisito mínimo) ou estação de trabalho para PCR (Workstation PCR) com luz UV germicida;
- Geladeira;
- Freezer;
- Micropipetas mono e multicanais de volumes reguláveis;
- Termociclador para PCR em tempo real;
- Centrífuga refrigerada com rotores para microtubos;
- Agitador de microtubos;
- Microcomputador; e
- Equipamento para extração automatizada de ácidos nucleicos (opcional).
Insumos
- Água livre de nucleases;
- Oligonucleotídeos para RT-qPCR (QUADRO 1);
- Controle positivo para FA (sempre utilizar RNA viral para averiguar eficiência da transcrição reversa);
- Kit de RT-qPCR;
- Kit de extração de RNA (automática);
- Trizol (manual); e
- Recomenda-se o uso de reações de passo único (one step) para síntese e amplificação de cDNA no mesmo tubo.
QUADRO 1 - Sugestão de oligonucleotídeos para RT-PCR e RT-qPCR para detecção molecular do VFA
| Oligonucleotídeo | Tipo de PCR | Sequência | Referência |
| FMDV.3D.107.F | RT-qPCR | ACTGGGTTTTACAAACCTGTGA | Calahan, 2002 |
| FMDV.3D.107.R | GCGAGTCCTGCCACGGA | ||
| FMDV.3D.107.S | FAM-TCCTT TGCAC GCCGT GGGAC-BHQ1 | ||
| FMDV.5UTR.F | RT-qPCR | CACYT YAAGR TGACA YTGRT ACTGG TAC | Reid, 2001 |
| FMDV.5UTR.R | CAGAT YCCRA GTGWC ICITG TTA | ||
| FMDV.5UTR.S | FAM-CCTCG GGGTA CCTGA AGGGCATCC-Iowa Black | ||
| FMDV.3D.88.F | RT-qPCR | ACTGGGTTTTAWAAACCTGTGATG | Moniwa, 2007 |
| FMDV.3D.88.R | TCAACTTCTCCTGKATGGTCCCA | ||
| FMDV.3D.88.S | FAM-ATCCTCTCCTTTGCACGC-Iowa Black | ||
| FMDV.IRES.145.F | RT-qPCR | TAA CAW GGA CCC RCS GGG CC | Wernike, 2013 |
| FMDV.IRES.145.R | TGA AGG GCA TCC TTA GCC TG | ||
| FMDV.IRES.145.S | FAM - CAT GTG TGC AAY CCC AGC ACR G - BHQ | ||
| FMDV.UTR.328.F | RT-PCR | GCCTGGTCTTTCCAGGTCT | Reid, 2000 |
| FMDV.UTR.328.R | CCAGTCCCCTTCTCAGATC |
Soluções
- Solução de álcool 70º INPM; e
- Solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses.
Realização do ensaio
Extração de RNA
- A extração pode ser realizada de forma automatizada ou manual, através de kits de extração de RNA ou reagentes específicos para o tipo de material a ser analisado, seguindo as recomendações do fabricante;
- Não utilizar reagentes após a data de validade e não misturar reagentes de lotes diferentes; e
- Adicionar as seguintes amostras controle a cada procedimento de extração: controle negativo (água ou tecido bovino ou suíno).
Reação de amplificação de ácido nucleico por RT-qPCR
- Realizar o ensaio em duas áreas separadas: uma para o preparo do mix de reação (sala de pré-PCR) isenta de material genético e amplicons, e outra para a transferência de RNA para placa ou microtubos (sala de PCR);
- Antes e após o preparo do mix de reação, descontaminar a cabine e os materiais a serem utilizados com solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses e/ou álcool 70º INPM; e
- As micropipetas utilizadas para o preparo do mix de reação e adição das amostras devem ser exclusivas para tais finalidades.
Preparo do mix de reação
- Preparar o mix de reação de acordo com protocolos validados e específicos para o agente pesquisado (VFA) em quantidade suficiente para o número de amostras a serem testadas, considerando algumas a mais;
- Após o preparo do mix, adicionar o RNA nos poços da placa ou em microtubos para leitura óptica;
- A adição de RNA e das amostras controle deve ser realizada em uma área distinta do preparo do mix (sala de PCR); e
- Devem ser incluídos nas análises:
- Controle positivo para VFA;
- Controle negativo da extração;
- Branco (água livre de nucleases); e
- Controle positivo e negativo do kit utilizado (se houver).
Reação de RT-qPCR
- Selar a placa com adesivo óptico ou fechar a tampa dos microtubos. Verificar se há bolhas no fundo do poço e/ou gotículas na parede dos poços da placa ou tubo. Caso isto ocorra, centrifugar brevemente para reduzir as bolhas e para que o conteúdo se posicione na parte inferior da placa ou tubo;
- Iniciar e entrar com os dados no software do termociclador (identificação das amostras e seleção dos fluoróforos), conforme especificações do fabricante;
- Inserir a placa ou os tubos no termociclador, salvar o arquivo e iniciar a corrida; e
- Ao finalizar, salvar os dados e interpretar os resultados.
Critérios de aceitação da prova
- Para a validação do ensaio, o controle positivo deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório; e
- O controle negativo deve ter Cq indeterminado ou maior que o limite do kit. O gráfico do controle negativo deve apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
Interpretação dos resultados
- Ao analisar os resultados da corrida, o operador deve avaliar os seguintes componentes: controle positivo, controle negativo, controle da extração, background de fluorescência e gráficos de amplificação de cada amostra individualmente. Após a validação do ensaio, interpretar os resultados conforme especificações do fabricante;
- O limiar de Cq a ser considerado positivo deve ser avaliado conforme definido na verificação desempenho da técnica ou conforme consta a literatura;
- Qualquer amostra questionável deverá ser retestada; e
- Amostras positivas devem ser submetidas a sequenciamento para genotipagem viral com primers para a região VP1.
Emissão dos resultados
- Os resultados deverão ser emitidos e expresso como “DETECTADO” ou “NÃO DETECTADO”; e
- Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
Descarte das amostras e Resíduos
- Após um período mínimo de 90 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
- Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
¶ 4.2. ESTOMATITE VESICULAR - EV
4.2.1. Amostras
São consideradas amostras para o diagnóstico da Febre Aftosa:
Detecção da Resposta Imune
- Soro sanguíneo
Identificação do Agente
- Epitélio;
- Líquido de vesículas;
- Suabe de vesículas rompidas
4.2.2. Recebimento das Amostras
4.2.2.1. Para atendimento aos Programas e Controle Oficiais do MAPA os Laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
4.2.2.2. Deverão ser obedecidos aos critérios estabelecidos no capítulo de verificação de conformidade de amostras.
4.2.2.3. As amostras deverão ser encaminhadas ao laboratório, individualmente separadas por matriz, e obedecendo à critérios de biossegurança.
4.2.3. Técnicas de Diagnóstico
4.2.3.1. Somente poderão ser utilizados insumos de diagnóstico que tenham registro no MAPA, segundo legislação em vigor;
4.2.3.2 Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados;
4.2.3.3. O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos
- Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente
- Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 e 25ºC.
- Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados;
- O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios;
- Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada;
- Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório;
Nota: A utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitido quando:
I. A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos.
II. As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes.
III. O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
¶ A. Teste de Virusneutralização
Materiais
- Luvas para procedimentos;
- Pipetas de vidro graduadas ou descartáveis;
- Provetas graduadas
- Béqueres;
- Erlenmeyers;
- Frascos de vidro tipo penicilina com tampa;
- Ponteiras descartáveis;
- Descartador de ponteiras;
- Reservatórios para soluções (cubetas);
- Papel absorvente;
- Microplacas para cultivo celular em poliestireno cristal com 96 cavidades de fundo chato;
- Caneta para identificação de vidraria; e
- Cubas para descarte de materiais resistente à autoclavação.
Equipamentos e instrumentos
- Autoclave;
- Cabine de segurança biológica classe II B1 (requisito mínimo);
- Geladeira;
- Freezer;
- Estufa com atmosfera de CO2;
- Estufa;
- Banho seco ou que empregam água;
- Termômetros;
- Micropipetas mono e multicanais de volumes reguláveis;
- Pipetador automático ou manual;
- Agitador de tubos;
- Microscópio invertido;
- Balança analítica; e
- Centrífuga refrigerada.
Insumos
- Suspensão celular de linhagem sensível;
- Meio MEM (Meio Essencial Mínimo, reconstituído de acordo com o fabricante);
- Soro fetal bovino (SFB) livre de pestivirus (BVDV) e micoplasma;
- Solução de antibióticos e antifúngicos; e
- Vírus da Estomatite Vesicular.
Soluções
- Meio MEM com piruvato com 5% de soro fetal bovino e antimicrobianos;
- Solução de salina 0,15 mol/L %;
- Ácido cítrico 0,2 %;
- Solução salina 0,85 % fosfatada tamponada (PBS) pH 7,2-7,4; e
- Solução de antibióticos e antifúngicos.
Realização do ensaio
Método de Triagem
- Inativar as amostras em banho Maria ou banho seco a 56 ºC ± 2 ºC durante 30 minutos;
- Apenas os soros em teste e controle são diluídos na placa;
- Adicionar 50,0 µL de MEM em toda a placa (QUADRO 1);
- Adicionar 50,0 µL de soro nas linhas A (soro 1 a 12) e E (soro 13 a 24);
- Para as amostras adicionadas na linha A (1 a 12), homogeneizar e transferir 50,0 µL da linha A para B, e da B para C, e da C para D e ao final descartar 50,0 µL;
- Para as amostras adicionadas na linha E (13 a 24) homogeneizar e transferir 50 µL para a F, de F para G, e de G para linha H e ao final descartar 50 µL;
- Distribuir os controles, controle celular e a retrotitulação de acordo com apresentado no Método quantitativo (QUADRO 2); e
- Soros reagentes na triagem com título igual ou maior do que 32 podem ser avaliados para se chegar ao título final pelo método de quantificação.
Método quantitativo
- Apenas os soros em teste e controle são diluídos na placa;
- Para amostras que não foram avaliadas quanto à toxidez proceder como descrito abaixo;
- Adicionar 87,5 µL de MEM na linha A1 até A4, (controle de toxidez, deve ser realizado apenas nos soros em análise, não é realizado nos soros controle, retrotitulação e controle de células);
- Adicionar 75 µL de MEM nas B1 a B4 da placa;
- Adicionar 50 µL de MEM nas C1 a C4 até e H1 a H4 da placa;;
- Distribuir as amostras (exemplo, soros 1, 2, 3 e 4) e controles como descrito no QUADRO 2;
- Adicionar 12,5 µL de soros testados (por poço) na linha A e 25 µL de soro (por poço) na linha B;
- Homogeneizar e transferir 50 µL da linha B para C, e assim sucessivamente até a linha H. Ao final descartar 50 µL;
- Para o controle de células (CC), adicionar 100 µL de MEM. Reservar pelo menos uma coluna como controle de células (CC). Nessa coluna não deve ser adicionado vírus ou soro;
- Retirar um criotubo do vírus da Estomatite Vesicular do ultrafreezer, o qual já deverá ter sido titulado pelo método de Reed-Muenchen. Este método será também empregado na titulação da diluição de trabalho do vírus (retrotitulação);
- Diluir o vírus de acordo com o título para que no ensaio sejam utilizados aproximadamente 1000 TCID50/50 µL (DT- diluição de trabalho);
- Adicionar 50 µL da diluição trabalho do vírus aos poços, com exceção do controle de toxidez dos soros, da coluna de controle de células e da retrotitulação;
- Incubar as microplacas a 37 º C ± 1 ºC, em estufa com 5% de atmosfera de CO2 por um período de 1 hora;
- Adicionar a todos os poços 100 µL de suspensão celular contendo 300 x 105 células/mL com 5 % SFB iniciando-se pela coluna referente ao controle de células;
- Incubar as microplacas a 37 º C ± 1 ºC, em estufa com 5% de atmosfera de CO2 por 48 a 72 horas; e
- Após o término do período de incubação realizar a leitura da microplaca em microscópio de luz com imagem invertida.
Retrotitulação
- A retrotitulação deve ser feita em uma das placas do ensaio. O QUADRO 2 apresenta o modelo de distribuição das diluições obtidas a partir da diluição de trabalho;
- Preparar três diluições do vírus em base 10 a partir da diluição de trabalho (DT) realizar diluições em base 10 (10-1 10-2 , 10-3 , 10-4 );
- Adicionar 50 µL de MEM em quatro colunas de uma microplaca, conforme indicado no QUADRO 1;
- Adicionar 50 µL de cada uma das diluições do vírus em uma coluna, começando pelo vírus mais diluído, de forma que possam ser utilizadas as mesmas ponteiras e o mesmo reservatório para todas as diluições do vírus;
- Após o término do período de incubação realizar a leitura da microplaca em microscópio de luz com imagem invertida; e
- Cálculo do título deve ser feito pelo método de Reed-Muenchen com base na presença ou ausência de crescimento viral nas colunas inoculadas com as diluições do vírus.
QUADRO 1 - Distribuição das amostras pelo método de Triagem
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | ||
| A | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 1/4 |
| B | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 1/8 |
| C | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 1/16 |
| D | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 1/32 |
| E | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 1/4 |
| F | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 1/8 |
| G | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 1/16 |
| H | 13 | 14 | 15 | 16 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 | 1/32 |
QUADRO 2 - Distribuição das amostras pelo Método Quantitativo
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |||
| A | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | -4 | CC | CC | TX | Log |
| B | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | -4 | CC | CC | 1/8 | 0,9 |
| C | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | -4 | CC | CC | 1/16 | 1,2 |
| D | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | -4 | CC | CC | 1/32 | 1,5 |
| E | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | -4 | CC | CC | 1/64 | 1,8 |
| F | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | -4 | CC | CC | 1/128 | 2,1 |
| G | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | -4 | CC | CC | 1/256 | 2,4 |
| H | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | -4 | CC | CC | 1/512 | 2,7 |
| RT | ||||||||||||||
Critérios de aceitação da Prova
- A prova estará válida quando a retrotitulação do vírus de prova na diluição de trabalho apresentar as doses infectantes dentro do intervalo de 750 a 1270 TCID50/50 μL;
- O soro reagente deve apresentar título superior a 32;
- O soro não reagente deve apresentar título inferior a 32; e
- Controle de células apresentando tapete íntegro em todos os poços isentos de contaminação ou toxidez.
Interpretação dos resultados
- Soro REAGENTE, com 50 % de neutralização traduzida por ausência de efeito citopático (ECP) (Fig. 1B), nas diluições a partir de 1:32 (título 1,5);
- Soro não REAGENTE, com ausência de neutralização traduzida por presença de efeito citopático (ECP) (Fig. 1A), nas diluições a inferiores a 1:32 (título 1,5);
- A amostra será considerada tóxica quando se observar a ausência de multiplicação celular, ou destruição das células por componentes do soro no poço de controle de toxidez. Geralmente é caracterizada pela sedimentação do cultivo semeado no fundo do poço; e
- A amostra será considerada contaminada quando houve presença de contaminação bacteriana ou por fungos impedindo a interpretação do resultado.
FIGURA 1 – Cultivo de células VERO sem ECP (1B) e com a presença de ECP (1A) causado pelo vírus da Estomatite vesicular.
Emissão dos resultados
Os resultados deverão ser emitidos e expresso como “REAGENTE” ou “NÃO REAGENTE”. Caso a amostra seja considerada reagente, deve ser descrito a valor do título final, que é expresso como o logaritmo da diluição em que houve 100% de virusneutralização.
Descarte de Amostras e Resíduos
- Antes da realização do descarte de amostras e produtos de ensaio deverão ser observados os prazos mínimos estabelecidos. Retenção de Itens de Ensaio;
- Todo material utilizado na realização do ensaio deve ser imerso em cuba com solução de ácido cítrico 0,2%, hipoclorito de sódio 0,5% ou solução para descontaminação similar, por no mínimo de 1 hora;
- Após este período, todo o material utilizado na realização do ensaio deve ser submetido ao processo de autoclavação apropriado e validado. A efetividade de esterilização deve estar comprovada em procedimentos próprios do laboratório; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo processo de descarte.
Retenção de itens de ensaio
Amostras de soro poderão ser descartados 60 dias após a emissão do relatório de ensaio, registrando-se nos formulários próprios e conferidos antes do descarte.
¶ B. Isolamento viral
Materiais
- Luvas para procedimentos;
- Pipetas de vidro graduadas ou descartáveis;
- Provetas graduadas;
- Béqueres;
- Erlenmeyers;
- Placas de Petri;
- Frascos de vidro tipo penicilina com tampa;
- Tubo de centrífuga;
- Tubos de ensaio;
- Ponteiras descartáveis;
- Descartador de ponteiras;
- Reservatórios para soluções (cubetas);
- Papel absorvente;
- Microplacas para cultivo celular em poliestireno com 24 cavidades de fundo chato;
- Microplacas para cultivo celular em poliestireno com 96 cavidades de fundo chato;
- Caneta para identificação de vidraria;
- Cubas para descarte de materiais resistente à autoclavação;
- Areia estéril;
- Filtro para seringa (0,45 µm);
- Gral e Pistilo;
- Tesoura cirúrgica e bisturi; e
- Seringa descartável.
Equipamentos e instrumentos
- Autoclave;
- Cabine de segurança biológica classe II A (requisito mínimo);
- Geladeira;
- Freezer;
- Estufa com atmosfera de CO2;
- Estufa;
- Banho seco ou que empregam água;
- Termômetros;
- Micropipetas mono e multicanais de volumes reguláveis;
- Pipetador automático ou manual;
- Agitador de tubos;
- Microscópio invertido;
- Cronômetro;
- Balança analítica; e
- Centrífuga refrigerada.
Insumos
- Suspensão celular de linhagem sensível (VERO, IBRS-2 ou BHK-21);
- Meio MEM (Meio Essencial Mínimo, reconstituído de acordo com o fabricante);
- Soro fetal bovino (SFB), livre de pestivirus (BVDV) e micoplasma;
- Solução de antibióticos e antifúngicos; e
- Cepas do vírus da Estomatite Vesicular.
Soluções
- Meio MEM com 5% de soro fetal bovino e tratado com solução de antibióticos e antifúngicos;
- Solução de salina 0,15 mol/L %;
- Ácido cítrico 0,2 %;
- Solução salina 0,85 % fosfatada tamponada (PBS) pH 7,2-7,4; e
- Solução de antibióticos e antifúngicos.
Realização do ensaio
Preparo das amostras
Processamento do epitélio e crostas
- Picotar o epitélio com auxílio de tesoura;
- Um fragmento de epitélio deve ser colocado no gral e macerado com 1 a 2 mL de MEM, ou em microtubo com esfera para uso no macerador. Estocar o restante conservando o frasco de origem em freezer. Este deve ser identificado pelo número da requisição;
- Para encaminhamento para a biologia molecular um fragmento de aproximadamente 100 mg deve ser adicionado a um microtubo contendo 1,0 mL de Trizol ou em cartucho para extração de ácidos nucleicos;
- No caso do recebimento de amostras de epitélio de mais de um animal da propriedade pode ser realizado um pool respeitando as proporções de tecido e MEM;
- Adicionar 1 a 2 mL de MEM e, opcionalmente areia estéril, e macerar com auxílio de pistilo até o material ficar com aspecto de pasta RETIRAR;
- Adicionar o volume de MEM suficiente para que a suspensão tenha uma proporção aproximada de 1/5;
- Transferir a suspensão do gral para um tubo de centrífuga previamente identificado;
- Centrifugar a 2000 g sob refrigeração (2 ºC a 8 ºC) por 2 minutos; e
- Filtrar o sobrenadante e acondicionar em tubo identificado. Manter em freezer.
Passagens em células (suspensão celular)
- Adicionar 100 µL do inóculo de macerado de tecidos em um poço da microplaca de 24 poços. Caso seja utilizada uma garrafa de 25 cm2 utilizar 500 µL de inóculo de macerado de tecidos;
- Acrescentar suspensão celular com 10 % de soro fetal bovino na concentração de 300.000 células/mL;
- 500 µL de suspenção celular por poço no caso de utilizar microplaca;
- 5 mL no caso de utilização de garrafas;
- Incubar a microplaca por 48 a 72 horas em estufa de CO2;
- Fazer a leitura e registrar os resultados. Os materiais em que for observada contaminação não deverão ser submetidos à segunda passagem;
- Realizar a segunda passagem após congelar e descongelar a microplaca ou a garrafa, inoculando o material da primeira passagem conforme itens 1 e 2; e
- Realizar a leitura dos cultivos em 24 a 72 horas em microscópio óptico. Amostras que apresentarem características de efeito citopático deverão ser encaminhadas para a confirmação por biologia molecular.
Critérios de aceitação das provas
- As provas de identificação do agente serão consideradas válidas quando os cultivos celulares sabidamente infectados (controles positivos) apresentam efeito citopático caracterizado pelo destacamento do cultivo celular e formação de células sinciciais e ausências de ECP nos cultivos que não foram infectados (controles negativos ou de células);
- Na presença de ECP deverá ser realizada a confirmação do isolamento por método imunológico conforme descrito no item “ELISA SW para tipificação de antígenos do vírus da Estomatite Vesicular” ou por método molecular; e
- Controle de células apresentando tapete íntegro em todos os poços isentos de contaminação ou toxidez.
Interpretação dos resultados
- O material será considerado NÃO DETECTADO quando não apresentar ECP após as duas passagens em cultivo de células de no mínimo 48 horas (Fig.2B)
- O material será considerado DETECTADO quando apresentar ECP durante as passagens em cultivo celular (Fig. 2A),nesse caso sendo necessária realização de testes de tipificação (ELISA ou RT-PCR) para confirmação do isolado viral. No caso de detecção deve ser incluído no campo de resultado o nome da espécie do vírus detectado;
- A amostra será considerada tóxica quando se observar a ausência de multiplicação celular, ou destruição das células por componentes do soro no poço de controle de toxidez. Geralmente é caracterizada pela sedimentação do cultivo semeado no fundo do poço; e
- A amostra será considerada contaminada quando houve presença de contaminação bacteriana ou por fungos impedindo a interpretação do resultado.
FIGURA 2 – Cultivo de células VERO sem ECP (2B) e com a presença de ECP (2A) causado pelo vírus da Estomatite vesicular.
Emissão dos resultados
Os resultados deverão ser emitidos e expresso como DETECTADO ou NÃO DETECTADO.
Descarte de Amostras e Resíduos
- Antes da realização do descarte de amostras e produtos de ensaio deverão ser observados os prazos mínimos estabelecidos;
- Todo material utilizado na realização do ensaio deve ser imerso em cuba com solução de ácido cítrico 0,2%, hipoclorito de sódio 0,5% ou solução para descontaminação simular, por no mínimo de 1 hora;
- Após este período, todo o material utilizado na realização do ensaio deve ser submetido ao processo de autoclavação apropriado e validado. A efetividade de esterilização deve estar comprovada em procedimentos próprios do laboratório; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo processo de descarte.
Retenção de itens de ensaio
Amostras positivas de qualquer origem devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo as mesmas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
¶ C. ELISA SW para tipificação de antígenos do vírus da Estomatite Vesicular
Materiais
- Luvas para procedimentos;
- Pipetas de vidro graduadas ou descartáveis;
- Provetas graduadas;
- Béqueres;
- Erlenmeyers;
- Ponteiras descartáveis;
- Descartador de ponteiras;
- Reservatórios para soluções (cubetas);
- Papel absorvente;
- Caneta para identificação de vidraria;
- Cubas para descarte de materiais resistente à autoclavação;
- Microplacas de fundo em “U”; e
- Microplacas NUNC MaxSorb.
Equipamentos e instrumentos
- Autoclave;
- Geladeira;
- Estufa;
- Micropipetas monocanal e multicanal de volumes reguláveis;
- Pipetador automático ou manual;
- Leitora de ELISA;
- Cronômetros;
- Agitador de tubos tipo vórtex (opcional);
- Agitador de microplacas; e
- Lavadora de microplacas (opcional).
Insumos
- Set de ensaio ELISA de tipificação para proteínas estruturais dos vírus da Febre Aftosa (VFA) e Estomatite Vesicular produzidos pelo Centro Panamericano de Febre Aftosa contendo soros capturas e detectores específicos, soros bloqueadores de bovino e coelho e antígenos;
- IgG de cabra anti-IgG de cobaio conjugado com peroxidase (Sigma nº catálogo A7289);
- Pastilhas de OPD (ortofenilldiamina) de 2 ou 10mg;
- Albumina Bovina Grau II;
- Albumina Bovina Grau V;
- Fosfato de sódio;
- Ácido cítrico;
- Carbonato de sódio grau P.A.;
- Bicarbonato de sódio grau P.A;
- Peróxido de hidrogênio a 30%;
- Tween 20 (Sigma cat. Nº P-1379);
- Microplacas de fundo em “U”;
- Microplacas NUNC MaxSorb.
Soluções
- No preparo das soluções deve ser utilizado somente os reagentes fornecidos pelo fabricante, ou aqueles por ele indicados;
- Conjugados, substratos e solução de parada deverão ser utilizados obedecendo-se as condições do fabricante;
- No preparo da solução de lavagem deve-se assegurar que não existem cristais precipitados na solução;
- PBST (Tampão salina fosfatada pH 7,4 com 1% de ovoalbumina Grau II e 0,05% de Tween 20), preparado como descrito abaixo:
- PBS tween 20x fornecido no kit - 100 mL
- água destilada q;s.p. - 2 litros
- 20 g ovoalbumina grau II
- pH 7,4 a 7,6.
caso o set não forneça o PBS, formular:
- cloreto de potássio, 0,2 g;
- cloreto de sódio, 8,0 g;
- fosfato de potássio, 0,2 g;
- fosfato de sódio, 2,9 g;
- água destilada q.s.p. - 1 L;
- adicionar 0,5 ml de tween 20 em 1 L de PBS;
- 10 g de ovoalbumina grau II;
- filtrar com membrana 0,8 um.
- Solução salina fisiológica 0,85% pH 7,2 – 7,4;
- Tampão carbonato-bicarbonato pH 9,6;
- Peróxido de hidrogênio a 30%; e
- Solução de ácido sulfúrico 1,5 mol/L.
Realização do ensaio
Sensibilização das placas com anticorpos captura – microplacas NUNC MaxSorb
- Identificar as placas em ordem sequencial;
- Descongelar os soros captura à temperatura ambiente;
- Preparar as diluições de uso de cada soro captura em tampão carbonato-bicarbonato, conforme recomendações do fabricante. Homogeneizar em agitador magnético;
- Distribuir 100 µL dos soros capturas da seguinte maneira: Colocar em cada poço da placa 100 µL de soro de captura diluído em tampão carbonato, distribuído como indicado a seguir: Soro de captura “O” (colunas 1 e 7), Soro de captura “A” (colunas 2 e 8), Soro de captura “C” (colunas 3 e 9), Soro de captura “NJ” (colunas 4 e 10), Soro de captura “IND” (colunas 5 e 11), e Soro de captura “negativo” (colunas 6 e 12);
- Empilhar as placas em grupos de 10, no máximo, e selar a placa superior;
- Incubar por 16 a 20 horas entre 4 ºC e 8 °C;
- Retirar da geladeira e mantê-las à temperatura ambiente por 1h;
- Descartar o conteúdo das placas e lavá-las uma vez com 2 dos soros00 µL de solução salina fisiológica por poço;
- Descartar o conteúdo das placas e batê-las sobre papel absorvente ou toalha;
- Adicionar 100 µL por poço de PBS com 1% de ovoalbumina Grau V;
- Incubar por 1h à temperatura ambiente;
- Descartar o conteúdo das placas e lavá-las uma vez com 200 µL de solução salina fisiológica por poço;
- Descartar o conteúdo das placas e batê-las sobre papel ou toalha absorvente; e
- As placas podem ser utilizadas imediatamente ou podem ser armazenadas. Para isto, cobri-las com filme plástico e armazená-las a – 20°C em posição invertida.
Preparo do tampão bloqueador (PBSTB)
- Descongelar o PBST à temperatura ambiente; e
- Adicionar 2 mL de soro de coelho e 2 mL de soro de bovino para 100 mL do tampão PBST e homogeneizar antes do uso.
Execução
- Descongelar as placas de fase sólida previamente sensibilizada 20 minutos na geladeira, 20 minutos à temperatura ambiente e 20 minutos na estufa a 37 º C ± 1 ºC (deixá-las sempre invertidas sobre papel toalha);
- Diluir os antígenos em PBSTB de acordo como recomendado pelo fabricante. Distribuir 50 µL dos antígenos, “O” na coluna 7G e 7H, “A” na coluna 8G e 8H, “C” na coluna 9G e 9H, “NJ” na coluna 10G e 10H, “IND” na coluna 11G e 11H, e “NEG” na coluna 12G e 12H;
- Distribuir 50 µL da amostra não diluída, nos poços: amostra 1, (A1 a A6 e B1 a B6), amostra 2, (C1 a C6 e D1 a D6), amostra 3, (E1 a E6 e F1 a F6), amostra 4, (G1 a G6 e H1 a H6), amostra 5, (A7 a A12 e B7 a B12), amostra 6 , (C7 a C12 e D7 a D12) e amostra 7 (E7 a E12 e F7 a F12);
- Incubar por 30 ± 2 minutos, 37 °C ± 1 °C, sob agitação;
- Preparar a diluição dos soros detectores conforme recomendação do fabricante. Incubar a 37°C ± 1 °C até o momento do uso;
- Lavar a placa três vezes com salina fisiológica com Tween 20 a 0,05% (1 mL de Tween para 2 litros de salina) e em seguida secá-la em papel toalha;
- Distribuir 50 µL de cada soro detector nas respectivas colunas, de acordo com protocolo de sensibilização (ver item - Sensibilização das placas com anticorpos captura – microplacas NUNC MaxSorb);
- Incubar por 30 ± 2 minutos, 37 °C ± 1 °C, sob agitação. Preparar a dµLuição do conjugado e incubá-lo a 37 °C ± 1 °C até o momento do uso;
- Lavar a placa três vezes com 300 µL salina fisiológica com Tween 20 a 0,05% e secar a placa em papel toalha;
- Distribuir 50 µL do conjugado em todos os poços da placa;
- Incubar por 30 ± 2 minutos, 37 °C ± 1 °C, sob agitação;
- Preparar a solução de substrato-cromógeno nas seguintes proporções (quantidade suficiente para cinco placas), como descrito abaixo:
- - Fosfato de sódio 0,2 mol/L - 7,0 mL
- - Ácido cítrico 0,1 mol/L – 6,5 mL
- - Água destilada ou deonizada – 11,5 mL
- - Ortho-phenyldiamine (OPD) – 10,0 mg
- - 10,0 µL água oxigenada 30%
13. Lavar a placa três vezes com 300 µL salina fisiológica com Tween 20 a 0,05% e secar a placa em papel toalha;
14. Adicionar o OPD ao tampão ácido e, em seguida, o peróxido de hidrogênio. Homogeneizar;
15. Distribuir 50 µL do substrato em todos os poços da placa;
16. Incubar a temperatura ambiente por 15 minutos, sob proteção da luz;
17. Adicionar 50 µL da solução de ácido sulfúrico 1,5 mol/L em todos os poços da placa;
18. Proceder à leitura das placas em leitor de ELISA com filtro de 492nm.
QUADRO 1 Esquema de distribuição dos soros e controles
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| A | S1 | S1 | S1 | S1 | S1 | S1 | S5 | S5 | S4 | S4 | S4 | S4 |
| B | S1 | S1 | S1 | S1 | S1 | S1 | S5 | S5 | S4 | S4 | S4 | S4 |
| C | S2 | S2 | S2 | S2 | S2 | S2 | S6 | S6 | S6 | S6 | S6 | S6 |
| D | S2 | S2 | S2 | S2 | S2 | S2 | S6 | S6 | S6 | S6 | S6 | S6 |
| E | S3 | S3 | S3 | S3 | S3 | S3 | S7 | S7 | S6 | S6 | S6 | S6 |
| F | S3 | S3 | S3 | S3 | S3 | S3 | S7 | S7 | S6 | S6 | S6 | S6 |
| G | S4 | S4 | S4 | S4 | S4 | S4 | O | A | C | NJ | IND | NEG |
| H | S4 | S4 | S4 | S4 | S4 | S4 | O | A | C | NJ | IND | NEG |
Critérios de aceitação do Ensaio
- Calcular a média dos valores de densidade ótica (DO) para cada amostra testada/sorotipo, somando os dois poços correspondentes em cada coluna e dividindo por 2 (no caso do teste em duplicata);
- A DO do controle negativo deve ser < 0,1; e
- A DO dos controles de antígeno deve ser > 0,5.
Interpretação dos resultados
- Calcular a média dos valores de densidade ótica (DO) para cada amostra testada/sorotipo, somando os dois poços correspondentes em cada coluna e dividindo por 2 (no caso do teste em duplicata);
- Detectado, amostras com valor de DO > 0,3;
- Não detectado, amostras com DO < 0,2;
- Inconclusivas, amostras com valor de DO entre 0,2 e 0,3, e aquelas que todos os outros sorotipos apresentarem DO < 0,1; e
- Amostras concentradas podem apresentar valores de DO > 0,3 para mais de um sorotipo. Neste caso, essas amostras devem ser diluídas 1:5 ou 1:10 para confirmação do sorotipo.
Emissão dos resultados
Os resultados deverão ser emitidos e expresso como DETECTADO, NÃO DETECTADO, INCONCLUSIVO.
Descarte de Amostras e Resíduos
- Antes da realização do descarte de amostras e produtos de ensaio deverão ser observados os prazos mínimos estabelecidos;
- Todo material utilizado na realização do ensaio deve ser imerso em cuba com solução de ácido cítrico 0,2%, hipoclorito de sódio 0,5% ou solução para descontaminação similar, por no mínimo de 1 hora;
- Após este período, todo o material utilizado na realização do ensaio deve ser submetido ao processo de autoclavação apropriado e validado. A efetividade de esterilização deve estar comprovada em procedimentos próprios do laboratório; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo processo de descarte.
Retenção de itens de ensaio
Amostras positivas de qualquer origem devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo as mesmas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
¶ D. Técnica de PCR convencional para detecção do vírus da Estomatite Vesicular (VEV)
Materiais
- Luvas de procedimento nitrílica ou de látex isentas de pó;
- Pipetas graduadas;
- Microtubos de volumes variados ou microplacas;
- Ponteiras com filtro, estéreis, livres de DNAses e RNAses;
- Estantes para microtubos; e
- Gaze ou papel toalha.
Equipamentos e instrumentos
- Autoclave;
- Cabine de segurança biológica com filtro HEPA classe II (requisito mínimo) ou estação de trabalho para PCR (Workstation PCR) com luz UV germicida;
- Geladeira;
- Freezer;
- Micropipetas mono e multicanais de volumes reguláveis;
- Pipetador automático ou manual;
- Termociclador;
- Balança de precisão;
- Centrífuga refrigerada com rotores para microtubos;
- Agitador de microtubos;
- Micro-ondas;
- Cuba e fonte para eletroforese;
- Microcomputador;
- Sistema de fotodocumentação; e
- Equipamento para extração automatizada de ácidos nucleicos (opcional).
Insumos
- Água livre de nucleases;
- Mix de dNTP;
- Oligonucleotídeos para RT-PCR (QUADRO 3);
- Kit de RT-PCR;
- Kit de extração de RNA (automática);
- Trizol (manual);
- Corante para ácidos nucleicos;
- Marcador de peso molecular;
- Tampão de carregamento (“loading buffer”);
- Gel de agarose; e
- Controle positivo para VEV (sempre utilizar RNA viral para averiguar eficiência da transcrição reversa).
Soluções
- Solução de álcool 70º INPM; e
- Solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses.
Realização do ensaio
Extração de RNA
- A extração pode ser realizada de forma automatizada ou manual, através de kits de extração de RNA ou reagentes específicos para o tipo de material a ser analisado, seguindo as recomendações do fabricante;
- Não utilizar reagentes após a data de validade e não misturar reagentes de lotes diferentes; e
- Adicionar as seguintes amostras controle a cada procedimento de extração: controle negativo (água ou tecido bovino ou suíno).
Reação de amplificação de ácido nucleico (PCR)
- Realizar o ensaio em duas áreas separadas: uma para o preparo do mix de reação (sala de pré-PCR), isenta de material genético e amplicons, e outra para a transferência de RNA para placa ou microtubos (sala de PCR);
- Antes e após o preparo do mix de reação, descontaminar a cabine e os materiais a serem utilizados com solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses e/ou álcool 70º INPM; e
- As micropipetas utilizadas para o preparo do mix de reação e adição das amostras devem ser exclusivas para tais finalidades.
Preparo do mix de reação
- Preparar o mix de reação de acordo com protocolos validados e específicos para o agente pesquisado (VEV) em quantidade suficiente para o número de amostras a serem testadas, considerando algumas a mais; De acordo com o kit e bula do fabricante fazer a amplificação em uma ou duas etapas;
- Adicionar o mix de reação a cada poço da microplaca (ou microtubos); e
- Devem ser incluídos nas análises:
- Controle positivo para VEV;
- Controle NÃO DETECTADO da extração;
- Branco (água livre de nucleases); e
- Controle DETECTADO e NÃO DETECTADO do kit utilizado (se houver).
Reação de PCR
- Após o preparo do mix, adicionar o RNA nos poços da placa ou em microtubos identificados com a numeração da amostra a ser testada; e
- Realizar a amplificação em termociclador certificado, conforme as especificações de temperatura do protocolo utilizado.
Eletroforese
- Preparar o gel de agarose em concentração adequada ao protocolo de PCR utilizado. Adicionar um corante para ácidos nucleicos em proporção suficiente para visualização das bandas;
- Para a corrida das amostras, adicionar tampão de carregamento (loading buffer) ao produto de PCR;
- Aplicar marcador de peso molecular em um dos poços do gel;
- Realizar a corrida em cuba de eletroforese, utilizando o tempo e a voltagem adequados para o volume do gel e o protocolo de PCR utilizado; e
- Visualizar o gel sob luz ultravioleta, fotografar com o auxílio de um fotodocumentador e analisar o resultado.
Critérios de aceitação da prova
- As amostras de controle positivo para VEV devem apresentar bandas de tamanhos correspondentes aos amplicons do protocolo utilizado; e
- As amostras de controle negativo (controle negativo da extração e branco) não devem apresentar bandas de amplificação.
Interpretação dos resultados
- Comparar os resultados das amostras testadas ao das amostras controle, a fim de classificá-las como positivas ou negativas;
- A leitura das bandas deve ser clara e livre de amplicons inespecíficos para o teste ser considerado satisfatório; e
- Qualquer amostra questionável deverá ser retestada.
Emissão dos resultados
- Os resultados deverão ser emitidos e expresso como “DETECTADO” ou “NÃO DETECTADO”; e
- Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
Descarte das amostras e Resíduos
- Após um período mínimo de 90 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas por dois analistas antes do descarte;
- Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
Retenção dos Itens de Ensaio
- Após um período mínimo de 60 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas por dois analistas antes do descarte;
- Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
¶ E. Técnica de RT-qPCR para VEV
Materiais
- Luvas de procedimento nitrílica ou de látex isentas de pó;
- Microtubos de volumes variados ou microplacas;
- Microplacas ou microtubos para leitura óptica de RT-qPCR;
- Tampas adesivas para microplacas para leitura óptica de RT-qPCR;
- Ponteiras com filtro, estéreis, livres de DNAses e RNAses;
- Estantes para microtubos; e
- Gaze ou papel toalha.
Equipamentos e instrumentos
- Autoclave;
- Cabine de segurança biológica com filtro HEPA classe II (requisito mínimo) ou estação de trabalho para PCR (Workstation PCR) com luz UV germicida;
- Geladeira;
- Freezer;
- Micropipetas mono e multicanais de volumes reguláveis;
- Termociclador para PCR em tempo real;
- Centrífuga refrigerada com rotores para microtubos;
- Agitador de microtubos;
- Microcomputador; e
- Equipamento para extração automatizada de ácidos nucleicos (opcional).
Insumos
- Água livre de nucleases;
- Oligonucleotídeos para RT-qPCR (QUADRO 3);
- Controle positivo para VEV (sempre utilizar RNA viral para averiguar eficiência da transcrição reversa);
- Kit de RT-qPCR;
- Kit de extração de RNA (automática);
- Trizol (manual);
- Recomenda-se o uso de reações de passo único (one step) para síntese e amplificação de cDNA no mesmo tubo.
QUADRO 3: Sugestão de oligonucleotídeos para RT-PCR e RT-qPCR para detecção molecular de VEV
|
Oligonucleotídeo |
Tipo de PCR |
Sequência |
Referência |
|
VSNJV.P-102 |
RT-PCR |
5'gagaggataaatatctcc3' |
Centro Panamericano de Febre Aftosa |
|
VSNJV.P-744 |
5'gggcatactgaagaata3' |
||
|
VSIV.P-179 |
RT-PCR |
5'gcagatgattctgacac3' |
Centro Panamericano de Febre Aftosa |
|
VSIV.P-793 |
5'gactctcgcctgattgta3' |
||
|
VSAV.PPP.722.F |
RT-PCR |
ggggccattcaagagataga |
LFDA |
|
VSAV.PPP.722.R |
tgatatctcactctggcctgattat |
||
|
COCV.PPP.666.F |
RT-PCR |
tggagtcactgaacaaggtga |
LFDA |
|
COCV.PPP.666.R |
aaagctcctccagggtgact |
||
|
VSIV-2.GP.81.F |
RT-qPCR |
cgttgctgtgattgtyca |
LFDA |
|
VSIV-2.GP.81.R |
gggaactgggagtcaatc |
||
|
VSIV-2.GP.81.S |
FAM-ctc+Atc+Cac+Caa+Cacat -NFQ |
||
|
VSIV-3.GP.95.F |
RT-qPCR |
gggtwaacatccgtgcta |
de Oliveira (2018) |
|
VSIV-3.GP.95.R |
gtcacaagtggtgatcca |
||
|
VSIV-3.GP.95.S |
FAM- ac+Atc+Cat+Cca+Tcagc- NFQ |
||
|
VSAV.LP.78.F |
RT-qPCR |
gtccatcaacccattgttcc |
de Oliveira (2018) |
|
VSAV.LP.78.R |
atcaatccatctgcgactcc |
||
|
VSAV.LP.78.S |
FAM-cgcgattcttaagtgagttcaaatcagga-NFQ |
||
|
VSAV.GP.87.F |
RT-qPCR |
gagtgtggatcaacccag |
de Oliveira (2018) |
| VSAV.GP.87.R | ctgtggcttgaacratca | ||
| VSAV.GP.87.S | FAM-ctgc+ggttatg+cc+tcca-Iowa Black |
Soluções
- Solução de álcool 70º INPM; e
- Solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses.
Realização do ensaio
Extração de RNA
- A extração pode ser realizada de forma automatizada ou manual, através de kits de extração de RNA ou reagentes específicos para o tipo de material a ser analisado, seguindo as recomendações do fabricante;
- Não utilizar reagentes após a data de validade e não misturar reagentes de lotes diferentes; e
- Adicionar as seguintes amostras controle a cada procedimento de extração: controle negativo (água ou tecido bovino ou suíno).
Reação de amplificação de ácido nucleico por qPCR
- Realizar o ensaio em duas áreas separadas: uma para o preparo do mix de reação (sala de pré-PCR) isenta de material genético e amplicons, e outra para a transferência de DNA para placa ou microtubos (sala de PCR);
- Antes e após o preparo do mix de reação, descontaminar a cabine e os materiais a serem utilizados com solução descontaminante (para DNA, RNA, proteínas e nucleases) e/ou álcool 70º INPM; e
- As micropipetas utilizadas para o preparo do mix de reação e adição das amostras devem ser exclusivas para tais finalidades.
Preparo do mix de reação
- Preparar o mix de reação de acordo com protocolos validados e específicos para o agente pesquisado (VEV) em quantidade suficiente para o número de amostras a serem testadas, considerando algumas a mais;
- Após o preparo do mix, adicionar o RNA nos poços da placa ou em microtubos para leitura óptica;
- A adição de DNA e das amostras controle deve ser realizada em uma área distinta do preparo do mix (sala de PCR);
- Devem ser incluídos nas análises:
- Controle positivo para VEV;
- Controle negativo da extração;
- Branco (água livre de nucleases); e
- Controle positivo e negativo do kit utilizado (se houver).
Reação de qPCR
- Selar a placa com adesivo óptico ou fechar a tampa dos microtubos. Verificar se há bolhas no fundo do poço e/ou gotículas na parede dos poços da placa ou tubo. Caso isto ocorra, centrifugar brevemente para reduzir as bolhas e para que o conteúdo se posicione na parte inferior da placa ou tubo;
- Iniciar e entrar com os dados no software do termociclador (identificação das amostras e seleção dos fluoróforos), conforme especificações do fabricante;
- Inserir a placa ou os tubos no termociclador, salvar o arquivo e iniciar a corrida; e
- Ao finalizar, salvar os dados e interpretar os resultados.
Critérios de aceitação da prova
- Para a validação do ensaio, o controle positivo deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório; e
- O controle não negativo deve ter Cq indeterminado ou maior que o limite do kit. O gráfico do controle negativo deve apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
Interpretação dos resultados
- Ao analisar os resultados da corrida, o operador deve avaliar os seguintes componentes: controle positivo, controle negativo, controle da extração, background de fluorescência e gráficos de amplificação de cada amostra individualmente. Após a validação do ensaio, interpretar os resultados conforme especificações do fabricante;
- O limiar de Cq a ser considerado positivo deve ser avaliado conforme definido na verificação desempenho da técnica ou conforme consta a literatura;
- Qualquer amostra questionável deverá ser retestada; e
- Amostras positivas podem ser submetidas a sequenciamento para genotipagem viral.
Emissão dos resultados
- Os resultados deverão ser emitidos e expresso como “DETECTADO” ou “NÃO DETECTADO”; e
- Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
Descarte das amostras e Resíduos
- Após um período mínimo de 60 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
- Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
¶ 5. Base legal e documentos de referência
¶ Febre Aftosa
- Callahan JD, Brown F, Osorio FA, Sur JH, Kramer E, Long GW, Lubroth J, Ellis SJ, Shoulars KS, Gaffney KL, Rock DL, Nelson WM. Use of a portable real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay for rapid detection of foot-and-mouth disease virus. J Am Vet Med Assoc. 2002 Jun 1;220(11):1636-42
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¶ Estomatite Vesicular
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¶ 6. Disposições Gerais
As sugestões para aprimoramento ou possíveis correções deste documento devem ser direcionadas ao Departamento responsável, para alinhamento das melhores práticas de mercado, legislação vigente e/ou regulamentações, que não tenham sido contempladas na versão vigente.
¶ 7. Histórico de revisões
| Versão | Conteúdo alterado | Data | Motivo |
|---|---|---|---|
| 1 | -//- | 13.01.2025 | Elaboração do documento |