¶ Folha de rosto
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Ano 2025
Elaboração, distribuição, informações:
Ministério da Agricultura e Pecuária
Secretaria de Defesa Agropecuária - SDA
Departamento de Serviços Técnicos - DTEC
Esplanada dos Ministérios, Bloco D, Anexo, Ala B, 4º andar, sala 433
CEP: 70043-900, Brasília - DF
www.agricultura.gov.br
e- mail: cgal@agro.gov.br
Central de Relacionamento: 0800 704 1995
Equipe Técnica:
- Ana Cristina Gonçalves Pinto da Rocha
- Ana Carolina de Oliveira Nascimento
- Anapolino Macedo de Oliveira
- Aerlem Cynara Silva
- Ana Karina Cunha Callado
- Andrea Padilha de Alencar
- Anselmo Vasconcelos Rivetti Júnior
- Antônio Augusto Fonseca Júnior
- Cid Aristóteles de Siqueira Alencar
- Dilmara Reischak
- Fernanda Gomes Cardoso
- Isabela Ciarlini de Azevedo
- João Marcos Nacif da Costa
- Juliana Nabuco Pereira Otaka
- Luanda Bispo Santos do Nascimento Maués
- Luciana Amaral Pinto
- Luciana Rabello Ferreira
- Luciana Taborda Corrêa
- Marcelo Fernandes Camargos
- Marco Antônio de Carvalho Marques Serqueira
- Paulo Martins Soares Filho
- Patrícia Gomes de Souza
- Rene Ribeiro da Silva
- Sheila de Matos Xavier
- Silvio Orlan de Castro Chaves
- Soraya Cecilia Albieri Camillo
¶ Folha resumo
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Macroprocesso: Laboratórios |
Objetivo: Realizar a padronização, harmonização, atualização e a unificação dos procedimentos para execução de ensaios laboratoriais da área de Diagnóstico Animal |
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Processo: Análises Laboratoriais |
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Entrega: Segurança e saúde dos rebanhos animais |
Público alvo e demais interessados: Laboratórios oficiais ou credenciados do Ministério da Agricultura e Pecuária (Mapa) |
Versão do documento: 1 |
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Setor responsável e responsabilidades A Coordenação Geral de Laboratórios Agropecuários do Departamento de Serviços Técnicos é responsável pela elaboração, atualização e envio para aprovação deste manual, tendo responsabilidade quanto aos procedimentos descritos no documento. |
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¶ 1. Definições e conceitos
Não Aplicável
¶ 2. Responsabilidades
O presente manual possui vigência e prazo indeterminado e será revisado sempre que necessário, no mínimo anualmente, pela Coordenação Geral de Laboratórios Agropecuários do Departamento de Serviços Técnicos (CGAL/DTEC).
A gestão desse manual está sob a responsabilidade da CGAL/DTEC que prestará auxílio ao público alvo leitor dúvidas e/ou sugestões quanto à aplicação deste manual devem ser submetidas ao Departamento responsável.
A publicação e atualização das versões na plataforma oficial da SDA para acesso pelo público alvo será de responsabilidade da Secretaria representada pelo DTEC.
¶ 3. Objetivo
O objetivo do Manual é reunir os métodos analíticos a serem empregados na execução de ensaios laboratoriais da área de Diagnóstico Animal da Rede Nacional de Laboratórios Agropecuários (Rede LFDA e Laboratórios credenciados junto ao Ministério da Agricultura e Pecuária).
¶ 4. Procedimentos - Multiespécies
¶ 4.1. RAIVA
4.1.1. Amostras
São consideradas amostras para o diagnóstico da Raiva:
4.1.1.1. Isolamento e identificação do Agente
- Sistema Nervoso Central (SNC) de mamíferos domésticos e silvestres; e
- Quirópteros: Animal inteiro.
4.1.2. Recebimento das Amostras
4.1.2.1. Para atendimento aos Programas e Controles Oficiais do MAPA os Laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
4.1.2.2. Deverão ser obedecidos os critérios estabelecidos no capítulo de verificação de conformidade de amostras.
4.1.3. Técnicas de Diagnóstico
4.1.3.1 Somente poderão ser utilizados insumos de diagnóstico que tenham registro no MAPA, segundo legislação em vigor;
4.1.3.2. Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados;
4.1.3.3. O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo as temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos:
a) Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização em temperatura ambiente;
b) Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18ºC e 25ºC.
4.1.3.4. Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios de interpretação dos resultados;
4.1.3.5 .O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios;
4.1.3.6. Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada;
4.1.3.7. Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório;
Nota: A utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitido quando:
I. A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos.
II. As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes.
III. O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
4.1.3.8. Todo procedimento que envolva manipulação de amostra e/ou suspensões de tecido deve ser realizado no interior de cabine de segurança biológica (CSB);
4.1.3.9. É obrigatória a utilização de EPIs durante todos os procedimentos descritos: luvas, máscara, touca, óculos, jaleco de mangas compridas, sapato fechado; e
4.1.3.10. Todos os colaboradores que executam atividades no laboratório de Diagnóstico de Raiva devem ser submetidos ao tratamento profilático de pré exposição: vacinação antirrábica e titulação de anticorpos neutralizantes e, se necessário, reforço vacinal. Somente títulos iguais ou acima de 0,5 UI/mL de anticorpos neutralizantes são satisfatórios. A sorologia deve ser repetida semestralmente para os profissionais que manipulam o vírus, amostras suspeitas e materiais com resíduos e, anualmente, para aqueles com menor risco de exposição, como colaboradores de serviços gerais.
¶ A. Teste de Imunofluorescência direta (IFD)
Materiais
- Câmara úmida;
- Caneta de tinta indelével;
- Caixa Porta Lâminas;
- Cuba de Coplin;
- Descartador de ponteiras;
- Estantes para tubos;
- Lâmina para microscopia de extremidade fosca ou própria para IFD;
- Lamínulas;
- Papel de filtro;
- Pinças e tesouras de inox;
- Pipetas de vidro graduadas ou descartáveis;
- Ponteiras descartáveis;
- Recipiente para descarte de material;
- Reservatórios para soluções (cubetas); e
- Vidrarias.
Equipamentos e instrumentos
- Autoclave;
- Balança analítica;
- Cabine de segurança biológica classe II;
- Cronômetro;
- Destilador de água ou Deionizador;
- Estufa 37°C;
- Freezer - 20°C;
- Freezer -70°C;
- Medidor de pH;
- Micropipeta monocanal de volume regulável ou pipeta pasteur descartável;
- Microscópio de fluorescência;
- Pipetador automático ou manual; e
- Refrigerador.
Insumos
- Acetona PA;
- Conjugado antirrábico marcado com Isotiocianato de fluoresceína (FITC); e
- Glicerina PA.
Soluções
- Acetona a 80%;
- Ácido Cítrico 0,2% ou Hipoclorito de Sódio 0,5%;
- Solução de álcool 70º GL
- Conjugado de trabalho;
- Glicerina a 50%;
- Solução Salina a 0,85%; e
- Solução Salina Tamponada com Fosfatos (PBS).
Realização do ensaio
Nota: Indica-se o uso de lâminas com superfície serigrafadas com pelo menos duas divisões, permitindo a determinação da superfície de coloração e a conservação do conjugado. Os instrumentos de marcação que entram em contacto com o tecido (por exemplo, lápis de cera ou caneta, esmalte etc.) não devem ser utilizados para indicar regiões coradas das lâminas, porque este processo pode transferir tecido infectado entre lâminas.
- Preencher o formulário de acompanhamento do ensaio. Identificar as lâminas de microscópio: duas lâminas de controle (um positivo e um negativo) e outras lâminas para testes das regiões cerebrais apropriadas. Preparar, no mínimo, 03 lâminas para cada amostra a ser testada a partir de fragmentos de regiões anatômicas diferentes; fazer duas impressões do mesmo fragmento;
- Para herbívoros e animais silvestres realizar preferencialmente impressões de fragmentos de hipocampo, cerebelo e córtex cerebral. Para equídeos, incluir medula espinhal e para quirópteros utilizar tecido cerebral e glândulas salivares, quando possível;
- Dentro da Cabine de segurança biológica, classe II , prepare a impressão do tecido cerebral (controles e amostras) na lâmina para microscópio;
- Retire o excesso de tecido da lâmina pressionando contra papel absorvente;
- Trabalhe com uma amostra de cada vez e processe o controle positivo por último ou prepare essas lâminas Controles antecipadamente e armazenar a -20°C durante 01 mês ou a -70°C durante 6 meses;
- Deixe as lâminas secarem; em temperatura ambiente em torno de 30 minutos;
- coloque todas as lâminas em uma cuba de Coplin contendo acetona fria (–20 ° C) por pelo menos 20 minutos; (mantida permanentemente no congelador);
- Remova as lâminas da cuba de Coplin e deixe secar em temperatura ambiente;
- Prepare o conjugado antirrábico usando o diluente indicado pelo fabricante;
- Adicione o conjugado na diluição de trabalho (titulado previamente) nas impressões de controle positivo e negativo e amostras de teste, em quantidade suficiente para cobrir a totalidade das impressões. Certifique-se que o reagente cobriu toda a impressão;
- Coloque as lâminas em câmara úmida e em seguida incubar em estufa 37 ºC ± 1 ºC por 45 minutos;
- Remover as lâminas e lavar com PBS pH 7,4 em dois enxágues de 5 minutos cada, em uma cuba de Coplin. Após, lavar em água destilada;
- Deixe as lâminas secarem;
- Instilar uma gota de Glicerina 50% sobre cada impressão e cobrir com uma lamínula;
- Realizar a leitura imediatamente, utilizando microscópio de fluorescência e iniciando pelos controles positivos e negativos. A impressão é observada para a fluorescência específica da raiva em uma ampliação de 200 X ou maior. A fluorescência específica é denotada por fluorescência verde "maçã" brilhante geralmente na área perinuclear das células, ou neurônios. Grânulos opacos verde ou vermelho/verde auto-fluorescente não devem ser contados como antígeno positivo. Examine cuidadosamente as amostras de tecido, se necessário, continue retornando ao controle positivo para comparação; e
- Se necessário, um segundo operador deve examinar todos os slides e os diagnósticos de ambos os operadores devem ser os mesmos.
Critérios de aceitação das provas
As provas de IFD serão consideradas válidas quando as impressões sabidamente infectadas (controles positivos) apresentam fluorescência específica e as sabidamente negativas (controle negativo) não apresentam fluorescência.
Interpretação dos resultados
- POSITIVO - presença de fluorescência específica nas impressões FIGURA 1; e
- NEGATIVO – ausência de fluorescência específica nas impressões FIGURA 2.
FIGURA 1 - Positivo
FIGURA 2 - Negativo
Emissão dos resultados
- Os resultados deverão ser emitidos e expressos como POSITIVO OU NEGATIVO.
- O resultado para IFD somente será emitido imediatamente caso seja positivo.
- As amostras com resultado diferente de positivo, poderão ser analisadas com os testes de RT-PCR e/ou dRIT, persistindo o resultado, deverão ser submetidas ao ensaio de inoculação em célula ou Inoculação em camundongo (ensaios complementares).
- O resultado da IFD diferente de positivo deve ser emitido em conjunto com os dos ensaios complementares
Descarte de Amostras e Resíduos
- As amostras devem ser registradas em formulários próprios e conferidas antes do descarte. Serão submetidas ao processo de autoclavação com temperatura de 121°C durante 30 minutos para então serem descartadas;
- Todo material, não autoclavável, utilizado na realização do ensaio, que não for autoclavável, deve ser imerso completamente em cuba com solução de ácido cítrico 0,2% ou de hipoclorito de Sódio 0,5% durante no mínimo 60 minutos. Após esse período, conforme o material, pode ser descartado ou reutilizado após devida higienização; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo processo de descarte.
Retenção de Itens de Ensaio
- As amostras, podem ser descartadas após um período mínimo de 6 meses após a emissão do relatório de ensaio, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte; e
- Durante o período de armazenamento as amostras devem ser armazenadas congeladas em temperatura de no máximo -65°C.
¶ B. Teste imunohistoquímico rápido direto (dRIT)
Materiais
- Câmara úmida;
- Caneta de tinta indelével;
- Caixa Porta Lâminas;
- Cuba Coplin ou outro recipiente adequado;
- Descartador de ponteiras;
- Estantes para tubos;
- Lâmina para microscopia de extremidade fosca;
- Lamínula;
- Papel de filtro;
- Pinças, tesouras e bisturis;
- Pipetas de vidro graduadas ou descartáveis;
- Ponteiras descartáveis;
- Recipiente para descarte de material;
- Reservatórios para soluções (cubetas);
- Vidrarias; e
- Seringas e filtros de seringa (0.45 µm).
Equipamentos e instrumentos
- Autoclave;
- Cabine de segurança biológica classe II;
- Centrífuga refrigerada com copos de segurança;
- Cronômetro;
- Destilador de água ou Deionizador;
- Geladeira;
- Freezer -70°C;
- Medidor de pH;
- Micropipeta monocanal de volume regulável ou pipeta pasteur descartável;
- Microscópio óptico com ocular de 10x e lente objetiva de 20x ou 40x; e
- Pipetador automático ou manual.
Insumos
- Anticorpo antirrábico primário conjugado com biotina: antinucleoproteína policlonal ou coquetel de anticorpos monoclonais biotinilados anti-lyssavírus;
- Estreptavidina-peroxidase; e
- Glicerina PA.
Soluções
- Formalina, 10% tamponada;
- Solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4;
- Peróxido de hidrogênio, 3%;
- Substrato de 3-amino-9-etilcarbazol (AEC);
- N,N-dimetilformamida, solvente para AEC;
- Tampão acetato, 0,1M, pH 5,2;
- Formulação de hematoxilina de Gill diluída ~1:2 em água destilada, como contra-corante para AEC;
- Meio de montagem aquoso para lâminas/lamínulas;
- Polietilenoglicol (TWEEN 80); e
- Água deionizada ou destilada.
Realização do ensaio
- Preencher o formulário de acompanhamento do ensaio;
- Identificar as lâminas de microscópio;
- Fazer impressões de tecidos suspeitos do SNC (incluindo tronco cerebral). Sempre inclua controles padrão positivos e negativos;
- Secar as lâminas ao ar por aproximadamente 5 minutos em temperatura ambiente;
- Mergulhe as lâminas em formalina tamponada a 10% à temperatura ambiente durante 10 minutos num frasco Coplin;
- Enxágue as lâminas várias vezes para remover qualquer excesso de fixador no tampão de lavagem (PBS mais 1% de Tween 80 – TPBS);
- Mergulhe as lâminas em água oxigenada a 3% por 10 minutos;
- Remova o excesso de peróxido de hidrogênio enxaguando as lâminas em TPBS;
- Transfira as lâminas para outro enxágue em TPBS. Trabalhe com uma lâmina de cada vez (deixe as lâminas restantes imersas no TPBS), remova a lâmina, retire o excesso de tampão inclusive o das bordas da lâmina ao redor da impressão do tecido;
- Adicione o conjugado com biotina (anticorpo primário, por exemplo, anticorpos poli ou monoclonais anti-nucleoproteína biotinilados) suficiente para cobrir a impressão. Incubar por 10 minutos em “câmara úmida”.
- Após a incubação, retire o excesso de conjugado. Mergulhe as lâminas com TPBS. Retire o excesso de TPBS e remova o tampão das bordas da lâmina ao redor da impressão;
- Trate cada lâmina com complexo estreptavidina-peroxidase, adicionando quantidade suficiente deste reagente à lâmina para cobrir a impressão;
- Incubar na câmara úmida em temperatura ambiente por 10 minutos;
- Após a incubação, retirar o excesso. Alternativamente, uma versão indireta do dRIT pode ser utilizada usando anticorpos primários não conjugados, seguido por uma incubação adicional de anticorpos secundários (por exemplo, anti-camundongo, anti-coelho, anti-cabra, etc.), conjugados a biotina. Quando utilizado com painéis de anticorpos monoclonais, também é possível a caracterização de variantes antigênicas. Os conjugados para o dRIT podem ser obtidos nos laboratórios de referência da OMS/OMSA ou podem ser produzidos pelos usuários.
- Enxágue as lâminas com TPBS. Retire o excesso de tampão, inclusive o excesso das bordas da lâmina ao redor da impressão.;
- Incubar as lâminas com substrato aminoetilcarbazol (AEC). Outros cromógenos adequados podem ser usados;
Para preparar a solução estoque AEC:
- Dissolver um comprimido de 20 mg de 3-amino 9-etil carbazol em 5 mL de N,N, dimetilformamida em um frasco de vidro; e
- A solução estoque AEC deve ser armazenada a 4°C por aproximadamente 1–2 meses.
Para preparar a diluição de trabalho AEC:
- Em um frasco colocar 7 mL de tampão acetato a um tubo;
- Adicionar 0,5 mL de solução estoque AEC (acima);
- Adicionar 75 µL de peróxido de hidrogênio a 3%;
- Filtrar o volume em filtro com membrana de 0,45 μm (Depois de preparada, esta mistura só é estável por 2–3 horas, portanto deve ser preparada imediatamente antes do uso);
- Adicionar quantidade suficiente deste reagente à lâmina para cobrir a impressão;
- Incubar em câmara úmida em temperatura ambiente por 10 minutos;
- Retirar o excesso de substrato. (O produto resultante da reação pela AEC é suscetível à deterioração sob luz excessiva e perderá intensidade. Recomenda-se o armazenamento de lâminas coradas no escuro).
17. Enxáguar as lâminas em água destilada;
18. Realizar a contracoloração com hematoxilina por 2 minutos;
19. Proceder 2 enxagues com água deionizada/destilada;
20. Transferir as lâminas para água destilada fresca. (Trabalhando com uma lâmina de cada vez, retire o excesso de água deionizada/destilada, retire o excesso das bordas da lâmina ao redor da impressão);
21. Aplicar o meio de montagem solúvel em água e a lamínula. (Não deixe as lâminas secarem ao ar antes de aplicar a lamínula. (Se várias lâminas estiverem coradas, elas poderão permanecer no enxágue com água deionizada/destilada antes da aplicação da lamínula).
22. Visualizar as lâminas por microscopia óptica, usando uma objetiva de 20× para escanear o campo completamente e uma objetiva de 40× para inspeção de maior potência.
Critérios de aceitação das provas
As provas de dRIT, usando AEC e contracoloração de hematoxilina, serão consideradas válidas quando as impressões sabidamente infectadas (controles positivos) com antígenos do Lyssavirus aparecem inclusões intracitoplasmáticas avermelhadas contra um fundo neuronal azul, e as sabidamente negativas (controle negativo) não apresentam essas inclusões.
Interpretação dos resultados
- POSITIVO - presença de inclusões intracitoplasmáticas avermelhadas contra um fundo neuronal azul, nas impressões. FIGURA 3 e FIGURA 4; e
- NEGATIVO - ausência de inclusões intracitoplasmáticas avermelhadas contra um fundo neuronal azul, nas impressões. FIGURA 5.
FIGURA 3 - Amostra de SNC positiva para Lyssavirus, método dRIT (400 X)
FIGURA 4 - Amostra de SNC positiva para Lyssavirus, método dRIT (600 X)
FIGURA 5 - Amostra de SNC negativa para Lyssavirus, método dRIT (400 X)
Emissão dos resultados
- Os resultados deverão ser emitidos e expressos como POSITIVO OU NEGATIVO;
- O resultado para dRIT somente será emitido imediatamente caso seja positivo;
- As amostras com resultado diferente de positivo poderão ser analisadas com os testes de RT-PCR e/ou IFD, persistindo o resultado, deverão ser submetidas ao ensaio de Inoculação em célula ou Inoculação em camundongo (ensaios complementares); e
- O resultado da dRIT diferente de positivo deve ser emitido em conjunto com os dos ensaios complementares.
Descarte de Amostras e Resíduos
- As amostras devem ser registradas em formulários próprios e conferidas antes do descarte. Serão submetidas ao processo de autoclavação com temperatura de 121°C durante 30 minutos para então serem descartadas;
- Todo material, não autoclavável, utilizado na realização do ensaio, que não for autoclavável, deve ser imerso completamente em cuba com solução de ácido cítrico 0,2% ou de hipoclorito de Sódio 0,5% durante no mínimo 60 minutos. Após esse período, conforme o material, pode ser descartado ou reutilizado após devida higienização; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo processo de descarte.
Retenção de Itens de Ensaio
- As amostras, podem ser descartadas após um período mínimo de 6 meses após a emissão do relatório de ensaio, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte; e
- Durante o período de armazenamento as amostras devem ser armazenadas congeladas em temperatura de no máximo -65°C.
¶ C. Isolamento e identificação do agente por inoculação em cultivo celular
Materiais
- Luvas para procedimentos;
- Pipetas de vidro graduadas ou descartáveis;
- Provetas graduadas;
- Béqueres;
- Erlenmeyers;
- Placas de Petri;
- Tubo de centrífuga;
- Tubos de ensaio;
- Ponteiras descartáveis;
- Descartador de ponteiras;
- Reservatórios para soluções (cubetas);
- Papel absorvente;
- Microplacas para cultivo celular em poliestireno com 96 cavidades de fundo chato;
- Caneta para identificação de vidraria;
- Cubas para descarte de materiais resistente à autoclavação;
- Gral e Pistilo; e
- Tesoura cirúrgica e bisturi.
Equipamentos e instrumentos
- Cabine de segurança biológica, classe II;
- Geladeira;
- Freezer;
- Estufa com atmosfera de CO2;
- Termômetros;
- Micropipetas mono e multicanais de volumes reguláveis;
- Pipetador automático ou manual;
- Agitador de tubos;
- Microscópio óptico invertido;
- Autoclave;
- Microscópio invertido de fluorescência ;
- Cronômetro;
- Balança analítica; e
- Centrífuga refrigerada.
Insumos
- Anticorpo antirrábico monoclonal ou policlonal marcado com fluoresceína (conjugado);
- Acetona, grau para análise (P.A);
- Suspensão celular de linhagem sensível - Células de neuroblastoma, N2a, CCL-131 da American Type Culture Collection (ATCC);
- Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), reconstituído de acordo com o fabricante;
- Soro fetal bovino (SFB), livre de pestivirus (BVDV) e micoplasma;
- Papel filtro;
- antibiótico comercial (Penicilina +Streptomicina); e
- Solução Salina Tamponada com Fosfatos (PBS).
Soluções
- Solução salina fosfatada tamponada 0,1 M pH 7,4;
- Ácido cítrico 0,2 % ou Hipoclorito de Sódio 0,5%; e
- Solução de álcool 70º GL.
Realização do ensaio
- Preparar uma suspensão de tecidos a 20% (p/v) utilizando uma solução de salina fosfatada tamponada 0,1M pH 7,4 com antibiótico comercial (Penicilina +Streptomicina) na proporção de 1 mL de antibiótico por litro de salina, adicionado de 20 mL de soro fetal bovino;
- Colocar a suspensão na geladeira por 60 minutos;
- Centrifugar por 30 minutos a 3.000 x G. Se não for usar imediatamente, colete o sobrenadante e congele. Essa suspensão é composta por um pool de cornos de amon, córtex cerebral, medula oblonga, cerebelo etc. e é usada para inocular cultura de células;
- Adicionar 100 µl de cada amostra e dos controles positivo e negativo em quatro poços de uma placa de 96 poços;
- Adicionar em cada poço, 200μL de uma suspensão celular de N2a, na concentração de 2 × 105 células/mL e incubar as microplacas a 37 º C ± 1 ºC, em estufa com 5% de atmosfera de CO2;
- Após 24 horas de incubação, o sobrenadante de cada poço é removido e 200 µl de meio fresco é adicionado a cada poço;
- Ao final de 72 horas de incubação, o sobrenadante é removido com micropipeta e mantido para realizar uma passagem em cultivo celular, se necessário, para aumentar a sensibilidade da prova. Geralmente três passagens consecutivas devem ser feitas para confirmar um resultado negativo;
- As células são fixadas com acetona 80% fria, com 200 µl por poço, durante 30 minutos. Secar as placas;
- Prepare o conjugado antirrábico conforme indicado pelo fabricante;
- Adicione 50 µl do conjugado na diluição de trabalho (titulação prévia) aos poços da placa. Incubar a 37°C por 60 minutos; e
- Lavar a placa três vezes com PBS pH 7,4. Após lavar por três vezes com água destilada, deixar secar e adicionar 50 µl de glicerina a 10%. Ler em microscópio de imunofluorescência.
Nota: A citotoxicidade é um fator comumente relatado que limita a robustez do teste. As técnicas propostas para reduzir a citotoxicidade incluem a adição de agentes de permeabilidade celular (por exemplo, DEAE-dextrano), redução do tempo de incubação antes da troca do meio e diluição das amostras, etc. Essas variações devem ser totalmente validadas antes do uso.
Critérios de aceitação das provas
As provas de isolamento serão consideradas válidas quando:
- Os cultivos celulares sabidamente infectados (controles positivos) apresentarem fluorescência específica e ausência de fluorescência específica nos controles negativos; e
- Ausência de reação de toxidez nos cultivos inoculados.
Interpretação dos resultados
- POSITIVO – presença de reações fluorescentes específicas no cultivo de células inoculadas (FIGURA 6); e
- NEGATIVO – ausência de reações fluorescentes específicas no cultivo de células inoculadas (FIGURA 7).
FIGURA 6 - Positivo
FIGURA 7 - Negativo
Emissão dos resultados
Os resultados deverão ser emitidos em documento denominado “Relatório de Ensaio” e expresso como POSITIVO ou NEGATIVO.
Descarte de Amostras e Resíduos
- As amostras devem ser registradas em formulários próprios e conferidas antes do descarte. Serão submetidas ao processo de autoclavação com temperatura de 121°C durante 30 minutos para então serem descartadas;
- Todo material, não autoclavável, utilizado na realização do ensaio, que não for autoclavável, deve ser imerso completamente em cuba com solução de ácido cítrico 0,2% ou de hipoclorito de sódio 0,5% durante no mínimo 60 minutos. Após esse período, conforme o material, pode ser descartado ou reutilizado após devida higienização; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo processo de descarte.
Retenção de Itens de Ensaio
- As amostras, podem ser descartadas após um período mínimo de 6 meses após a emissão do relatório de ensaio, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte; e
- Durante o período de armazenamento as amostras devem ser armazenadas congeladas em temperatura de no máximo -65°C.
¶ D. Isolamento do agente por Inoculação intracerebral em camundongos e identificação por IFD – Prova Biológica
Materiais
- Luvas para procedimentos;
- Pipetas de vidro graduadas ou descartáveis;
- Provetas graduadas;
- Placas de Petri;
- Tubo de centrífuga;
- Tubos de ensaio;
- Caneta para identificação de vidraria;
- Cubas para descarte de materiais resistente à autoclavação;
- Gral e Pistilo; e
- Tesoura cirúrgica e bisturi.
Equipamentos e instrumentos
- Cabine de segurança biológica, classe II;
- Geladeira;
- Freezer;
- Autoclave;
- Pipetador automático ou manual;
- Cronômetro;
- Balança analítica; e
- Centrífuga refrigerada.
Insumos
- Antibiótico comercial (Penicilina +Streptomicina); e
- Soro fetal bovino (SFB), livre de pestivirus (BVDV) e micoplasma.
Soluções
- Ácido cítrico 0,2 % ou Hipoclorito de Sódio 0,5%; e
- Solução de álcool 70º GL.
Realização do ensaio
- Preparar uma suspensão de tecidos a 20% (p/v) utilizando uma solução de salina fosfatada tamponada 0,1M pH 7,4 com antibiótico comercial (Penicilina +Streptomicina) na proporção de 1 mL de antibiótico por litro de salina, adicionado de 20 mL de soro fetal bovino;
- Colocar a suspensão na geladeira por 60 minutos.
- Centrifugar por 30 minutos a 3.000 x G. Se não for usar imediatamente, colete o sobrenadante e congele;
- Essa suspensão é composta por um pool de cornos de amon, córtex cerebral, medula oblonga, cerebelo;
- Oito a dez camundongos de 3 a 4 semanas de idade pesando entre 12 e 14 g, ou uma ninhada de camundongos recém-nascidos de 2 dias, são inoculados intracerebralmente com a suspensão de tecidos;
- Inocular o volume de 0,01 mL para camundongos recém-nascidos e 0,03 mL para camundongos adultos;
- Os camundongos são observados diariamente durante 28 dias;
- Cada camundongo morto ou com sintomas, é examinado para raiva usando o teste imunofluorescência direta - IFD. Para resultados mais rápidos em camundongos recém-nascidos, é possível verificar um camundongo nos dias 5, 7, 9 e 11 pós-inoculação. Quaisquer mortes ocorridas durante os primeiros 4 dias são consideradas inespecíficas (devido a estresse/infecção bacteriana etc.); e
- Nos animais mortos após o quinto dia, coletar o cérebro e proceder a IFD.
Critérios de aceitação do ensaio
O ensaio de isolamento em camundongos será considerado válido quando os animais sobreviverem, após o quarto dia de inoculação.
Interpretação dos resultados
- POSITIVO - presença de fluorescência específica nas impressões FIGURA 8; e
- NEGATIVO – ausência de fluorescência específica nas impressões FIGURA 9.
FIGURA 8 - Positivo
FIGURA 9 - Negativo
Emissão dos resultados
Os resultados deverão ser emitidos e expressos como POSITIVO ou NEGATIVO.
Descarte de Amostras e Resíduos
- As amostras devem ser registradas em formulários próprios e conferidas antes do descarte. Serão submetidas ao processo de autoclavação com temperatura de 121°C durante 30 minutos para então serem descartadas;
- Todo material não autoclavável utilizado na realização do ensaio deve ser imerso completamente em cuba com solução de ácido cítrico 0,2% ou de hipoclorito de sódio 0,5% durante no mínimo 60 minutos. Após esse período, conforme o material, pode ser descartado ou reutilizado após devida higienização; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo processo de descarte.
Retenção de Itens de Ensaio
- As amostras, podem ser descartadas após um período mínimo de 6 meses após a emissão do relatório de ensaio, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte; e
- Durante o período de armazenamento as amostras devem ser armazenadas congeladas em temperatura de no máximo -65°C.
¶ E. RT-PCR hemi-nested panlyssavirus convencional (hnRT-PCR)
Materiais
- Luvas de procedimento nitrílica ou de látex isentas de pó;
- Pipetas graduadas;
- Microtubos de volumes variados ou microplacas;
- Ponteiras com filtro, estéreis, livres de DNAses e RNAses;
- Estantes para microtubos; e
- Gaze ou papel toalha.
Equipamentos e Instrumentos
- Cabine de segurança biológica com filtro HEPA classe II ou estação de trabalho para PCR) (Workstation PCR) com luz UV germicida;
- Geladeira;
- Freezer;
- Cubas e fonte de eletroforese;
- Micropipetas mono e multicanais de volumes reguláveis;
- Centrífuga refrigerada com rotores para microtubos;
- Agitador de microtubos;
- Equipamento para extração automatizada de ácidos nucleicos (opcional);
- Pipetador automático ou manual;
- Autoclave;
- Termociclador;
- Balança de precisão;
- Micro-ondas;
- Microcomputador;
- Sistema de fotodocumentação; e
- Equipamento para extração automatizada de ácidos nucleicos (opcional).
Insumos
- Água livre de nucleases;
- Mix de dNTP;
- Oligonucleotídeos para RT-PCR;
- Kit de RT-PCR;
- Kit de extração de RNA (automática);
- Trizol (manual);
- Corante para ácidos nucleicos;
- Marcador de peso molecular;
- Tampão de carregamento (“loading buffer”);
- Gel de agarose; e
- Controle positivo, controle negativo e branco.
Soluções
- Solução de álcool 70º GL; e
- Solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses.
Realização do Ensaio
Extração de RNA
- A extração pode ser realizada de forma automatizada ou manual, através de kits de extração de RNA ou reagentes específicos para o tipo de material a ser analisado, seguindo as recomendações do fabricante;
- Não utilizar reagente após a data de validade e não misturar reagentes de lotes diferentes; e
- Adicionar amostras controles a cada procedimento de extração: amostras de tecido como controle positivo, controle negativo e branco (água).
Reação RT-PCR: primeira etapa
- Realizar o ensaio em duas áreas separadas: uma para o preparo do mix de reação (sala de pré-PCR), isenta de material genético e amplicons, e outra para a transferência de amostras extraídas para placa ou microtubos (sala de PCR);
- Antes e após o preparo do mix de reação, descontaminar a cabine e os materiais a serem utilizados com solução descontaminante (para DNA, RNA, proteínas e nucleases) e/ou álcool 70º GL;
- As micropipetas utilizadas para o preparo do mix de reação e adição das amostras devem ser exclusivas para tais finalidades;
- A mistura de enzimas deve ser mantida no gelo. Os demais reagentes podem ser descongelados à temperatura ambiente;
- Incluir os controles positivo, negativo e branco;
- Preparar o mix de reação de acordo com protocolos validados e específicos para o agente pesquisado (TABELA 1) em quantidade suficiente para o número de amostras a serem testadas, com pelo menos volume sobrando para uma reação a mais; e
- Onde nenhum amplicon é gerado na primeira reação, deve ser realizada uma segunda reação. É possível uma amplificação de segundo ciclo opcional para aumentar a sensibilidade e/ou confirmar a especificidade do primeiro produto de PCR.
Reação RT-PCR: segunda etapa
- Uma segunda amplificação (hemi-nested PCR) é feita para aumentar a sensibilidade e / ou para confirmar a especificidade do produto da primeira rodada de PCR;
- Limpar a bancada com um desinfetante apropriado antes de usar ou preparar a estação de trabalho de PCR;
- A mistura de enzimas deve ser mantida no gelo. Os demais reagentes podem ser descongelados à temperatura ambiente;
- Um controle negativo adicional deve ser incluído em cada segunda reação de PCR para confirmar que o master mix não está contaminado; e
- Preparar o mix de reação de acordo com protocolos validados e específicos para o agente pesquisado (vírus da raiva) em quantidade suficiente para o número de amostras a serem testadas, pelo menos com volume sobrando para uma reação a mais.
Eletroforese
- Preparar o gel de agarose em concentração adequada ao protocolo de PCR utilizado (1,5% a 2%). Adicionar um corante para ácidos nucleicos em proporção suficiente para visualização das bandas;
- Para a corrida das amostras, adicionar tampão de carregamento (loading buffer) ao produto de PCR;
- Aplicar marcador de peso molecular em um dos poços do gel;
- Realizar a corrida em cuba de eletroforese, utilizando o tempo e a voltagem adequados para o volume do gel e o protocolo de PCR utilizado; e
- Visualizar o gel sob luz ultravioleta, fotografar com o auxílio de um fotodocumentador e analisar o resultado.
Critérios de Aceitação do Ensaio
- As amostras de controle positivo para raiva devem apresentar bandas de tamanhos correspondentes aos amplicons do protocolo utilizado; e
- As amostras de controle negativo (controle negativo da extração e branco) não devem apresentar bandas de amplificação.
Interpretação dos Resultados
- Comparar os resultados das amostras testadas ao das amostras controle, a fim de classificá-las como positivas ou negativas;
- A leitura das bandas deve ser clara e livre de amplicons inespecíficos para o teste ser considerado satisfatório; e
- Qualquer amostra questionável deverá ser retestada.
Emissão dos Resultados
- Os resultados deverão ser emitidos em documento denominado “Relatório de Ensaio” e expressos como “DETECTADO” ou “NÃO DETECTADO”;
- O resultado para RT-PCR somente será emitido imediatamente caso seja detectado;
- As amostras com resultado diferente de detectado poderão ser analisadas com os testes de IFD e/ou dRIT, persistindo o resultado, deverão ser submetidas ao ensaio de Inoculação em célula ou Inoculação em camundongo (ensaios complementares); e
- Após a conclusão dos ensaios complementares deve ser emitido o resultado contendo todos os ensaios realizados.
Descarte de Amostras e Resíduos
- As amostras devem ser registradas em formulários próprios e conferidas antes do descarte. Serão submetidas ao processo de autoclavação com temperatura de 121°C durante 30 minutos para então serem descartadas;
- Todo material não autoclavável utilizado na realização do ensaio, que não for autoclavável, deve ser imerso completamente em cuba com solução de ácido cítrico 0,2% ou de hipoclorito de sódio 0,5% durante no mínimo 60 minutos. Após esse período, conforme o material, pode ser descartado ou reutilizado após devida higienização; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo processo de descarte.
Retenção de Itens de Ensaio
- Após um período mínimo 6 meses da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas por dois analistas antes do descarte;
- Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
¶ F. PCR em tempo real com transcrição reversa RT-qPCR
Materiais
- Luvas de procedimento nitrílica ou de látex isentas de pó;
- Microtubos de volumes variados ou microplacas;
- Microplacas ou microtubos para leitura óptica de RT-qPCR;
- Tampas adesivas para microplacas para leitura óptica de RT-qPCR;
- Ponteiras com filtro, estéreis, livres de DNAses e RNAses;
- Estantes para microtubos; e
- Gaze ou papel toalha.
Equipamentos e instrumentos
- Cabine de segurança biológica com filtro HEPA classe II;
- Estação de trabalho para PCR (Workstation PCR) com luz UV germicida;
- Geladeira;
- Freezer;
- Micropipetas mono e multicanais de volumes reguláveis;
- Termociclador para PCR em tempo real;
- Centrífuga refrigerada com rotores para microtubos;
- Agitador de microtubos;
- Autoclave;
- Microcomputador; e
- Equipamento para extração automatizada de ácidos nucleicos (opcional).
Insumos
- Água livre de nucleases;
- Oligonucleotídeos para RT-qPCR;
- Controle positivo, negativo para raiva e branco;
- Kit de RT-qPCR;
- Kit de extração de RNA (automática);
- Trizol (manual); e
- Recomenda-se o uso de reações de passo único (one step) para síntese e amplificação de cDNA no mesmo tubo.
Soluções
- Solução de álcool 70º GL; e
- Solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs/DNAs/amplicons/resíduos de proteínas de superfície; entre as quais DNAses/RNAses.
Realização do ensaio
Extração de RNA
- A extração pode ser realizada de forma automatizada ou manual, através de kits de extração de RNA ou reagentes específicos para o tipo de material a ser analisado, seguindo as recomendações do fabricante;
- Não utilizar reagente após a data de validade e não misturar reagentes de lotes diferentes; e
- Adicionar as seguintes amostras controle a cada procedimento de extração: controle negativo (água).
Reação de Amplificação de Ácido Nucleico por RT-qPCR
- Realizar o ensaio em duas áreas separadas: uma para o preparo do mix de reação (sala de pré-PCR) isenta de material genético e amplicons, e outra para a transferência de DNA para placa ou microtubos (sala de PCR);
- Antes e após o preparo do mix de reação, descontaminar a cabine e os materiais a serem utilizados com solução descontaminante (para DNA, RNA, proteínas e nucleases) e/ou álcool 70º GL; e
- As micropipetas utilizadas para o preparo do mix de reação e adição das amostras devem ser exclusivas para tais finalidades.
Preparo do Mix de Reação
- Preparar o mix de reação de acordo com protocolos validados e específicos para o agente pesquisado (vírus da raiva) em quantidade suficiente para o número de amostras a serem testadas, e no mínimo para mais uma reação;
- Após o preparo do mix, adicionar o RNA e os controles nos poços da placa ou em microtubos para leitura óptica; e deve ser realizada em uma área distinta do preparo do mix (sala de PCR);
- Devem ser incluídos nas análises:
- Controle positivo para raiva;
- Controle negativo da extração;
- Branco (água livre de nucleases);
- Controle positivo e negativo do kit utilizado (se houver);
- Um teste interno de beta-actina.
Reação de RT-qPCR
- Selar a placa com adesivo óptico ou fechar a tampa dos microtubos. Verificar se há bolhas no fundo do poço e/ou gotículas na parede dos poços da placa ou tubo. Caso isto ocorra, centrifugar brevemente para reduzir as bolhas e para que o conteúdo se posicione na parte inferior da placa ou tubo;
- Iniciar e entrar com os dados no software do termociclador (identificação das amostras e seleção dos fluoróforos), conforme especificações do fabricante;
- Inserir a placa ou os tubos no termociclador, salvar o arquivo e iniciar a corrida; e
- Ao finalizar, salvar os dados e interpretar os resultados.
Critérios de Aceitação da Prova
- Para a validação do ensaio, o controle positivo deve apresentar uma curva sigmoide (forma de S) e um Cq satisfatório; e
- O controle negativo deve ter Cq indeterminado ou maior que o limite do kit. O gráfico do controle negativo deve apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
Interpretação dos Resultados
- Ao analisar os resultados da corrida, o operador deve avaliar os seguintes componentes: controle positivo, controle negativo, controle da extração, background de fluorescência e gráficos de amplificação de cada amostra individualmente. Após a validação do ensaio, interpretar os resultados conforme especificações do fabricante;
- O limiar de Cq a ser considerado positivo deve ser avaliado conforme definido na verificação desempenho da técnica ou conforme consta a literatura; e
- Qualquer amostra questionável deverá ser retestada.
Emissão dos Resultados
- Os resultados deverão ser emitidos e expresso como “DETECTADO” ou “NÃO DETECTADO”;
- O resultado para RT-PCR somente será emitido imediatamente caso seja detectado;
- As amostras com resultado diferente de detectado poderão ser analisadas com os testes de IFD e/ou dRIT, persistindo o resultado, deverão ser submetidas ao ensaio de Inoculação em célula ou Inoculação em camundongo (ensaios complementares); e
- Após a conclusão dos ensaios complementares deve ser emitido o resultado contendo todos os ensaios realizados.
Descarte das amostras e Resíduos
- As amostras devem ser registradas em formulários próprios e conferidas antes do descarte. Serão submetidas ao processo de autoclavação com temperatura de 121°C durante 30 minutos para então serem descartadas;
- Todo material utilizado na realização do ensaio, que não for autoclavável, deve ser imerso completamente em cuba com solução de ácido cítrico 0,2% ou de hipoclorito de sódio 0,5% durante no mínimo 60 minutos. Após esse período, conforme o material, pode ser descartado ou reutilizado após devida higienização; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo processo de descarte.
Retenção de itens de ensaio
- As amostras, podem ser descartadas após um período mínimo de 6 meses após a emissão do relatório de ensaio, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte; e
- Durante o período de armazenamento as amostras devem ser armazenadas congeladas em temperatura de no máximo -65°C.
QUADRO 1 - Sugestão de oligonucleotídeos para RT-PCR hemi-nested panlyssavirus convencional (não listamos no escopo – verificar com o fazer) e RT-PCR panlyssavirus em tempo real para detecção molecular do vírus da raiva
|
Oligonucleotídeo |
Tipo de PCR | Sequência | Referência |
|
JW12 |
hnRT-PCR |
5’atgtaacaccyctacaatg3’ | Heaton.,1997 |
|
JW6UNI |
hnRT-PCR |
5’cartvgcrcacatyttrtg3’ | Heaton, 1997 |
|
JW10UNI |
hnRT-PCR |
5’gtcatyarwgtrtgrtgytc3’ | Heaton, 1997 |
|
N165-146 |
hnRT-PCR |
5’gcagggtayttrtactcata3’ | Freuling, 2014 |
|
BatRat Beta-actin intronic |
RT-PCR |
5’cgatgaagatcaagatcattg3’ | Freuling., 2014 |
|
BatRat Beta-actin reverse |
RT-PCR |
5’aagcatttgcggtggac3’ | Freuling, 2014 |
¶ 4.2. DOENÇA DE AUJESZKY
4.2.1. Amostras
São consideradas amostras para o diagnóstico da Doença de Aujeszky:
4.2.1.1. Detecção da Resposta Imune
Soro sanguíneo
4.2.1.2. Identificação do Agente
Cérebro;
Pulmão;
Tonsilas Palatinas;
Linfonodos;
Gânglio Trigêmeo (suínos com infecção latente); e
Medula espinhal (bovinos).
4.2.2. Recebimento das Amostras
4.2.2.1. Para atendimento aos Programas e Controles Oficiais do MAPA os Laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento; e
4.2.2.2. Deverão ser obedecidos aos critérios estabelecidos no capítulo de verificação de conformidade de amostras.
4.2.3. Técnicas de Diagnóstico
4.2.3.1. Somente poderão ser utilizados insumos de diagnóstico que tenham registro no MAPA, segundo legislação em vigor;
4.2.3.2. Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados;
4.2.3.3. O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumo:
a) Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente; e
b) Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 a 25ºC.
4.2.3.4 Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados;
4.2.3.5 O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios;
4.2.3.6. Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada;
4.2.3.7 Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório;
Nota: A utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitido quando:
I. A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos.
II. As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes.
III. O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
¶ A. Ensaio Imunoenzimático (ELISA)
Materiais
- Luvas para procedimentos;
- Pipetas de vidro graduadas ou descartáveis;
- Provetas graduadas;
- Béqueres;
- Erlenmeyers;
- Ponteiras descartáveis;
- Descartador de ponteiras;
- Reservatórios para soluções (cubetas);
- Papel absorvente;
- Selador ou tampa para placas de ELISA;
- Caneta para identificação de vidraria; e
- Cubas para descarte de materiais resistente à autoclavação.
Equipamentos e instrumentos
- Autoclave;
- Geladeira;
- Estufa;
- Termômetros;
- Micropipetas monocanal e multicanal de volumes reguláveis;
- Pipetador automático ou manual;
- Leitora de ELISA;
- Cronômetros;
- Agitador de tubos tipo vórtex (opcional);
- Agitador de microplacas (opcional); e
- Lavadora de microplacas (opcional).
Insumos
Kits de ELISA de detecção de anticorpos para o vírus da Doença de Aujeszky.
Soluções
- No preparo das soluções deve ser utilizado somente os reagentes fornecidos pelo fabricante, ou aqueles por ele indicados;
- Conjugados, substratos e solução de parada deverão ser utilizados obedecendo-se as condições do fabricante;
- No preparo da solução de lavagem deve-se assegurar que não existem cristais precipitados na solução; e
- Diluir a soluções utilizando água ultrapura ou destilada conforme instruções do fabricante e homogeneizar bem.
Realização do ensaio
- Para realização dos ensaios de ELISA devem ser consideradas as orientações do fabricante do kit de diagnóstico utilizado. Atentar para ocorrência de atualização na bula do kit, principalmente em mudanças de lote;
- A ordem de execução das etapas do ensaio, duração, volumes utilizados e temperatura de incubação variam de acordo com fabricante do kit utilizado;
- Homogeneizar gentilmente todos reagentes e amostras antes do uso;
- Utilizar ponteiras distintas para cada controle e amostra de soro;
- Homogeneizar as placas tocando-as na lateral ou utilizando um agitador de placas;
- Nas etapas de incubação, as placas devem ser seladas para se evitar evaporação;
- As placas devem ser lavadas com a solução indicada pelo kit. Após a última lavagem remover resíduos em um material absorvente (papel toalha ou toalha). Deixar as placas secas o mínimo de tempo possível entre a lavagem e adição do próximo reagente; e
- Decorridas todas as etapas do teste, realizar a leitura da absorbância na leitora de ELISA utilizando filtro com comprimento de onda indicado nas instruções do fabricante.
Critérios de aceitação do Ensaio
O resultado do ensaio será considerado válido somente se as DOs dos soros controles estiverem dentro dos limites aceitáveis e determinados pelo fabricante. Caso contrário, o ensaio deve ser repetido.
Interpretação dos resultados
- De acordo com as DOs obtidas consideram-se as amostras como reagentes ou não reagentes. As amostras reagentes devem ser encaminhadas para o Laboratório Federal de Defesa Agropecuário (LFDA) designado para realizar a confirmação por Virusneutralização; e
- Amostras com DO entre os dois pontos de corte estabelecidos serão consideradas inconclusivas e deverão ser novamente ensaiadas. Se no reensaio o inconclusivo persistir, a amostra deve ser encaminhada ao (LFDA) para confirmação por teste de Virusneutralização.
Emissão dos resultados
Os resultados deverão ser emitidos e expresso como REAGENTE, NÃO REAGENTE, ou de acordo com o preconizado com o fabricante do insumo (kit de diagnóstico).
Descarte de Amostras e Resíduos
- Antes da realização do descarte de amostras e produtos de ensaio deverão ser observados os prazos mínimos estabelecidos no item “Retenção de Itens de Ensaio”;
- Todo material utilizado na realização do ensaio deve ser imerso em cuba com solução de ácido cítrico 0,2%, hipoclorito de sódio 0,5% ou solução para descontaminação similar, por no mínimo de 1 hora;
- Após este período, todo o material utilizado na realização do ensaio deve ser submetido ao processo de autoclavação apropriado e validado. A efetividade de esterilização deve estar comprovada em procedimentos próprios do laboratório; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo processo de descarte.
Retenção de itens de ensaio
Soro sanguíneo
Poderão ser descartados 60 dias após a emissão do relatório de ensaio, registrando-se nos formulários próprios e conferidos antes do descarte; e
Amostras positivas de qualquer origem devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo elas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
¶ B. Teste de Virusneutralização - VN
Materiais
- Luvas para procedimentos;
- Pipetas de vidro graduadas ou descartáveis;
- Provetas graduadas;
- Béqueres;
- Erlenmeyers;
- Frascos de vidro tipo penicilina com tampa;
- Ponteiras descartáveis;
- Descartador de ponteiras;
- Reservatórios para soluções (cubetas);
- Papel absorvente;
- Microplacas para cultivo celular em poliestireno cristal com 96 cavidades de fundo chato;
- Caneta para identificação de vidraria; e
- Cubas para descarte de materiais resistente à autoclavação.
Equipamentos e instrumentos
- Autoclave;
- Cabine de segurança biológica classe II B1 (requisito mínimo);
- Geladeira;
- Freezer;
- Estufa com atmosfera de CO2;
- Estufa;
- Banho seco ou que empregam água;
- Termômetros;
- Micropipetas mono e multicanais de volumes reguláveis;
- Pipetador automático ou manual;
- Agitador de tubos;
- Microscópio óptico invertido;
- Balança analítica; e
- Centrífuga refrigerada.
Insumos
- Suspensão celular de linhagem sensível (PK-15, SK-6 ou MDBK);
- Meio MEM (Meio Essencial Mínimo, reconstituído de acordo com o fabricante);
- Soro fetal bovino (SFB) livre de pestivirus (BVDV) e micoplasma;
- Solução de antibióticos e antifúngicos;
- Anticorpo reagente e não reagente para os vírus da Doença de Aujeszky; e
- Vírus da Doença de Aujeszky – VDA.
Soluções
- Meio MEM com adição de antimicrobianos;
- Solução de salina 0,15 mol/L %;
- Ácido cítrico 0,2 %;
- Solução salina 0,85 % fosfatada tamponada (PBS) pH 7,2-7,4; e
- Solução de antibióticos e antifúngicos.
Realização do ensaio
Método qualitativo
- Incubar as amostras de soro em banho seco ou que empregam água a 56 ºC por 30 minutos para inativação do complemento;
- Os soros deverão ser testados em triplicata;
- Utilizar microplacas para cultivo de células de 96 poços, com 12 colunas identificadas de 1 a 12, e 8 linhas identificadas com a letra A até H;
- Adicionar 50 µL de MEM por poço nas colunas 1, 5 e 9 (controle de toxidez, exemplo: 50 µL do soro1, no poço A1);
- Adicionar 50 µL do soro a ser testado em três poços adjacentes (ex. soro 1: A2, A3, A4). O mesmo procedimento deve ser feito com uma amostra de soro reagente e uma de soro não reagente, com fins de controle de prova;
- Manter pelo menos uma coluna da microplaca para controle de células.
- Retirar um criotubo do vírus da Doença de Aujeszky do ultrafreezer, o qual já deverá ter sido titulado pelo método de Reed-Muenchen. Este método será também empregado na titulação da diluição de trabalho do vírus (retrotitulação);
- Diluir o vírus de acordo com o título para que no ensaio sejam utilizados aproximadamente 100 TCID50/50 μL (DT- diluição de trabalho);
- Adicionar 50 μL da diluição trabalho do vírus aos poços, com exceção do controle de toxidez (colunas 1,5,9) e da coluna de controle de células. Homogeneizar batendo suavemente na lateral da placa;
- Incubar as microplacas em estufa com 5% de atmosfera de CO2, sob uma das três condições: a 37 º C ± 1 ºC por 1 hora, ou por 24 horas a 37 º C ± 1 ou sob refrigeração;
- Adicionar a todos os poços 100 μL de suspensão celular contendo 3,0 x 105 células/mL com 10% SFB iniciando-se pela coluna referente ao controle de células;
- Incubar as microplacas a 37 º C ± 1 ºC, em estufa com 5% de atmosfera de CO2 por 3 a 5 dias; e
- Após o término do período de incubação realizar a leitura da microplaca em microscópio de luz com imagem invertida.
Método quantitativo
- O método quantitativo poderá ser usado diretamente nos soros a serem avaliados ou em soros reagentes previamente testados no método qualitativo;
- Os soros deverão ser testados em duplicata utilizando-se microplacas para cultivo de células de 96 poços, com 12 colunas identificadas de 1 a 12, e 8 linhas identificadas com a letra A até H;
- Desde que os soros tenham a toxicidade avaliada no método qualitativo, não é necessário avaliar a toxicidade no método quantitativo;
- Caso seja necessário realizar o controle de toxidez adicionar 50 µL de MEM nas linhas A e de C a H. Em seguida, adicionar 50 µL de soro nos poços A1 e A2 (amostra 1) e 100 µL de soro nos poços B1 e B2 (amostra 1). Transferir 50 µL de soro da linha B para a linha C, homogeneizar com auxílio de micropipeta e transferir 50 µL dos soros para a linha D, e da D para a linha E e assim sucessivamente até a linha H (diluição final 1/128);
- Desde que os soros tenham a toxicidade avaliada no método qualitativo, não é necessário avaliar a toxicidade no método quantitativo. Deste modo, adicionar 50 µL de MEM nas linhas B a H;
- Em seguida, adicionar 100 µL do soro a ser testado nos poços A1 e A2 (amostra 1). O mesmo procedimento deve ser feito com uma amostra de soro reagente e uma de soro não reagente, com fins de controle de prova;
- Transferir 50 µL de soro da linha A para a linha B, homogeneizar com auxílio de micropipeta e transferir 50 µL dos soros para a linha C, e da C para a linha D e assim sucessivamente até a linha H (diluição final 1/256);
- Descartar 50 µL do material da linha H;
- Manter pelo menos uma coluna da microplaca para controle de células.
- Retirar um criotubo do vírus da Doença de Aujeszky do ultrafreezer, o qual já deverá ter sido titulado pelo método de Reed-Muenchen. Este método será também empregado na titulação da diluição de trabalho do vírus (retrotitulação);
- Diluir o vírus de acordo com o título para que no ensaio sejam utilizados aproximadamente 100 TCID50/50 μL (DT- diluição de trabalho);
- Adicionar 50 μL da diluição trabalho do vírus aos poços, com exceção do controle de toxidez (linha A) e da coluna de controle de células. Homogeneizar batendo suavemente na lateral da placa;
- Incubar as microplacas em estufa com 5% de atmosfera de CO2, sob uma das três condições: a 37 º C ± 1 ºC por 1 hora, ou por 24 horas a 37 º C ± 1 ou sob refrigeração;
- Adicionar a todos os poços 100 μL de suspensão celular contendo 3,0 x 105 células/mL com 10% SFB iniciando-se pela coluna referente ao controle de células;
- Incubar as microplacas a 37 º C ± 1 ºC, em estufa com 5% de atmosfera de CO2 por 3 a 5 dias; e
- Após o término do período de incubação realizar a leitura da microplaca em microscópio de luz com imagem invertida.
Retrotitulação
- Preparar três diluições do vírus em base 10 a partir da diluição de trabalho (10-1 10-2 e 10-3). Essas três diluições serão utilizadas para a titulação da diluição de trabalho (retrotitulação);
- Adicionar 50 μL de MEM em três colunas de uma microplaca;
- Adicionar 50 μL de cada uma das diluições do vírus em uma coluna, começando pelo vírus mais diluído, de forma que possam ser utilizadas as mesmas ponteiras e o mesmo reservatório para todas as diluições do vírus;
- Incubar as microplacas a 37 º C ± 1 ºC, em estufa com 5% de atmosfera de CO2 por 1 hora ou 24 horas sob refrigeração;
- Adicionar a todos os poços 100 μL de suspensão celular contendo 3 x 105 células/mL com 10% SFB iniciando-se pela coluna referente ao controle de células;
- Incubar as placas em estufa de CO com 5% de atmosfera de CO2 por 3 a 5 dias;
- Após o término do período de incubação realizar a leitura da microplaca em microscópio de luz com imagem invertida; e
- Cálculo do título deve ser feito pelo método de Reed-Muenchen com base na presença ou ausência de crescimento viral nas colunas inoculadas com as diluições do vírus.
Critérios de aceitação da prova
- A prova estará válida quando a retrotitulação do vírus de prova na diluição de trabalho apresentar as doses infectantes dentro da variação 10 2±0.5, que corresponde a 31 a 316 TCID50/50 μL;
- Quando a retrotitulação do vírus de prova na diluição de trabalho apresentar título inferior a 10 1,5 poderão ser validados os resultados das amostras não reagentes, e do mesmo, retrotitulação com título superior a 10 2,5 poderão ser validados as amostras reagentes;
- Será considerada válida a prova em que os soros controle se apresentarem dentro do comportamento esperado:
- Soro controle REAGENTE, com ausência de efeito citopático (ECP) nos três poços (FIGURA 1 A);
- Soro controle NÃO REAGENTE, com presença de ECP nos três poços (FIGURA 1B);
4. Controle de toxicidade: na presença de toxicidade as amostras devem ser reanalisadas por ELISA ou pelo método quantitativo;
5. Controle de células apresentando tapete íntegro e todos os poços isentos de contaminação ou toxidez; e
6. Se o resultado de um ou mais controles não atender aos critérios estabelecidos, os ensaios deverão ser repetidos.
7. Estando em conformidade, avaliar o resultado das amostras.
FIGURA 1 – Cultivo de células PK15 sem ECP (1A) e com a presença de ECP (1B) causado pelo vírus da Doença de Aujeszky.
Interpretação dos resultados
Método qualitativo – resultados apresentados em triplicata
- Amostras não reagentes: presença de ECP nos três poços;
- Amostras reagentes: ausência de ECP nos três poços. Devem ser confirmadas pelo método quantitativo;
- Amostras inconclusivas: presença de ECP em um ou dois poços. Devem ser avaliadas pelo método quantitativo;
- A amostra será considerada tóxica quando se observar a ausência de multiplicação celular, ou destruição das células por componentes do soro no poço de controle de toxidez. Geralmente é caracterizada pela sedimentação do cultivo semeado no fundo do poço. Na presença de toxicidade as amostras devem ser reanalisadas por ELISA ou pelo método quantitativo; e
- A amostra será considerada contaminada quando houve presença de contaminação bacteriana ou por fungos impedindo a interpretação do resultado.
Método quantitativo
- Amostras não reagentes: presença de ECP nos poços;
- Amostras reagentes: o título de um soro é expresso pelo denominador da mais alta diluição em que houve neutralização completa dos ECP do vírus em 50% dos poços. Se houver neutralização apenas na amostra não diluída solicitar nova colheita, pelo menos, oito dias após a primeira colheita. (QUADRO 1);
- A amostra será considerada tóxica quando se observar a ausência de multiplicação celular, ou destruição das células por componentes do soro no poço de controle de toxidez. Geralmente é caracterizada pela sedimentação do cultivo semeado no fundo do poço. Na presença de toxicidade as amostras devem ser reanalisadas por ELISA ou pelo método quantitativo; e
- A amostra será considerada contaminada quando houve presença de contaminação bacteriana ou por fungos impedindo a interpretação do resultado.
QUADRO 1 - Título neutralizante expresso pela recíproca da diluição mais alta do soro em que houve inibição da replicação viral em 50% dos poços.
|
Diluição |
Título |
Título logarítmico |
|
1/2 |
2 |
0,3 |
|
1/4 |
4 |
0,6 |
|
1/8 |
8 |
0,9 |
|
1/16 |
16 |
1,2 |
|
1/32 |
32 |
1,5 |
|
1/64 |
64 |
1,8 |
|
1/128 |
>=128 |
>=2,1 |
Emissão dos resultados
- Os resultados deverão ser emitidos e expressos como REAGENTE, NÃO REAGENTE; e
- Caso a amostra seja considerada reagente, deve ser descrito a valor do título final, que é expresso como o logaritmo da diluição em que houve 50 % de Virusneutralização.
Descarte de Amostras e Resíduos
- Antes da realização do descarte de amostras e produtos de ensaio deverão ser observados os prazos mínimos estabelecidos no item “Retenção de Itens de Ensaio”;
- Todo material utilizado na realização do ensaio deve ser imerso em cuba com solução de ácido cítrico 0,2%, hipoclorito de sódio 0,5% ou solução para descontaminação similar, por no mínimo de 1 hora;
- Após este período, todo o material utilizado na realização do ensaio deve ser submetido ao processo de autoclavação apropriado e validado. A efetividade de esterilização deve estar comprovada em procedimentos próprios do laboratório; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo processo de descarte.
Retenção de itens de ensaio
- Soro sanguíneo poderão ser descartados 60 dias após a emissão do relatório de ensaio, registrando-se nos formulários próprios e conferidos antes do descarte; e
- Amostras positivas de qualquer origem devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo elas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
¶ C. Isolamento viral
Materiais
- Luvas para procedimentos;
- Pipetas de vidro graduadas ou descartáveis;
- Provetas graduadas;
- Béqueres;
- Erlenmeyers;
- Placas de Petri;
- Frascos de vidro tipo penicilina com tampa;
- Tubo de centrífuga;
- Tubos de ensaio;
- Ponteiras descartáveis;
- Descartador de ponteiras;
- Reservatórios para soluções (cubetas);
- Papel absorvente;
- Microplacas para cultivo celular em poliestireno com 24 cavidades de fundo chato;
- Microplacas para cultivo celular em poliestireno com 96 cavidades de fundo chato;
- Caneta para identificação de vidraria;
- Cubas para descarte de materiais resistente à autoclavação;
- Areia estéril;
- Filtro para seringa (0,45 µm);
- Gral e Pistilo;
- Tesoura cirúrgica e bisturi; e
- Seringa descartável.
Equipamentos e instrumentos
- Autoclave;
- Cabine de segurança biológica classe II A (requisito mínimo);
- Geladeira;
- Freezer;
- Estufa com atmosfera de CO2;
- Estufa;
- Banho seco ou que empregam água;
- Termômetros;
- Micropipetas mono e multicanais de volumes reguláveis;
- Pipetador automático ou manual;
- Agitador de tubos;
- Microscópio invertido;
- Cronômetro;
- Balança analítica; e
- Centrífuga refrigerada.
Insumos
- Suspensão celular de linhagem sensível (PK-15 ou SK-6);
- Meio MEM (Meio Essencial Mínimo, reconstituído de acordo com o fabricante);
- Soro fetal bovino (SFB), livre de pestivirus (BVDV) e micoplasma;
- Solução de antibióticos e antifúngicos;
- Anticorpo hiperimune para o vírus da Doença de Aujeszky;
- Anticorpo anti-IgG de suíno marcada com isotiocianato de fluoresceína ou peroxidase;
- Cepas do vírus da Doença de Aujeszky;
- Ovoalbumina Grau V;
- Peróxido de hidrogênio 30 % (V/V); e
- Tween 80 ou Tween 20.
Soluções
- Meio MEM tradado com solução de antibióticos e antifúngicos;
- Ácido cítrico 0,2 %; e
- Solução de antibióticos e antifúngicos.
Realização do ensaio
Preparo das amostras
- Selecionar os órgãos e tecidos encaminhados do mesmo animal que serão submetidos à prova e utilizar aproximadamente 0,5 cm3 de cada tecido;
- Remover o excesso de tecido conjuntivo;
- Recortar e macerar os fragmentos de cada órgão preparando um pool para cada requisição, utilizando gral, pistilo e MEM tratado com solução antimicrobiana até que se forme uma pasta homogênea. Pode ser utilizada areia estéril como abrasivo se necessário. Alternativamente poderá ser utilizado o macerador de amostras;
- Completar o volume com MEM resultando em uma suspensão de 20 % (P/V);
- Centrifugar a 3000 rpm por 10 minutos;
- Colher o sobrenadante, filtrar e colocar em frasco devidamente identificado; descartar o precipitado;
- Adicionar 100 µL de solução antimicrobiana; e
- Encaminhar 400 µL de inóculo ou de fragmentos do tecido em cartucho para extração de ácidos nucléicos para diagnóstico molecular.
Passagens em células (suspensão celular)
- Adicionar 100 µL do inóculo de macerado de tecidos em um poço da microplaca de 24 poços. Caso seja utilizada uma garrafa de 25 cm2 utilizar 0,5 mL de inóculo de macerado de tecidos;
- Acrescentar 0,5 mL de suspensão celular com 10 % de soro fetal bovino na concentração de 300.000 células/mL;
- Incubar a microplaca por 48 a 72 horas em estufa de CO2;
- Fazer a leitura e registrar os resultados. Os materiais em que for observada contaminação não deverão ser submetidos à segunda passagem;
- Congelar a microplaca e descongelar;
- Inocular o material da primeira passagem em microplaca de 24 poços ou garrafa, conforme descrito para a primeira passagem;
- Para o controle de vírus utilizar uma amostra da cepa do VDA;
- Realizar a leitura dos cultivos por 72 horas em microscópio óptico; e
- Amostras que apresentarem características de efeito citopático deverão ser encaminhadas para a confirmação por biologia molecular.
Critérios de aceitação das provas
- As provas de identificação do agente serão consideradas válidas quando os cultivos celulares sabidamente infectados (controles DETECTADOs) apresentam efeito citopático caracterizado pelo destacamento do cultivo celular e formação de células sinciciais e ausências de ECP nos cultivos que não foram infectados (controles NÃO DETECTADOs ou de células);
- Na presença de ECP deverá ser realizada a confirmação do isolamento por método molecular; e
- Controle de células apresentando tapete íntegro em todos os poços isentos de contaminação ou toxidez.
Interpretação dos resultados
- DETECTADO - presença de Efeito Citopático (ECP) nos cultivos infectados pelo VDA, Fig. (1B);
- NÃO DETECTADO – ausência de Efeito Citopático (ECP) nos cultivos celulares Fig. (1A);
- A amostra será considerada tóxica quando se observar a ausência de multiplicação celular, ou destruição das células por componentes do soro no poço de controle de toxidez. Geralmente é caracterizada pela sedimentação do cultivo semeado no fundo do poço; e
- A amostra será considerada contaminada quando houve presença de contaminação bacteriana ou por fungos impedindo a interpretação do resultado.
FIGURA 1 – Cultivo de células PK15 sem ECP (1A) e com a presença de ECP (1B) causado pelo vírus da Doença de Aujeszky.
Emissão dos resultados
Os resultados deverão ser emitidos e expresso como “DETECTADO” ou “NÃO DETECTADO” no isolamento viral do vírus para Doença de Aujeszky.
Descarte de Amostras e Resíduos
- Antes da realização do descarte de amostras e produtos de ensaio deverão ser observados os prazos mínimos estabelecidos no item “Retenção de Itens de Ensaio”;
- Todo material utilizado na realização do ensaio deve ser imerso em cuba com solução de ácido cítrico 0,2%, hipoclorito de sódio 0,5% ou solução para descontaminação similar, por no mínimo de 1 hora;
- Após este período, todo o material utilizado na realização do ensaio deve ser submetido ao processo de autoclavação apropriado e validado. A efetividade de esterilização deve estar comprovada em procedimentos próprios do laboratório; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo processo de descarte.
Retenção de itens de ensaio
Soro sanguíneo
- Poderão ser descartados 60 dias após a emissão do relatório de ensaio, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte; e
- Amostras positivas de qualquer origem devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo elas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
¶ D. Técnica de PCR convencional - cPCR para detecção do Herpesvírus suíno 1 (SuHV-1)
Materiais
- Luvas de procedimento nitrílica ou de látex isentas de pó;
- Pipetas graduadas;
- Microtubos de volumes variados ou microplacas;
- Ponteiras com filtro, estéreis, livres de DNAses e RNAses;
- Estantes para microtubos; e
- Gaze ou papel toalha.
Equipamentos e instrumentos
- Cabine de segurança biológica com filtro HEPA classe II (requisito mínimo) ou estação de trabalho para PCR (Workstation PCR) com luz UV germicida;
- Geladeira;
- Freezer;
- Micropipetas mono e multicanais de volumes reguláveis;
- Pipetador automático ou manual;
- Termociclador;
- Balança de precisão;
- Centrífuga refrigerada com rotores para microtubos;
- Agitador de microtubos;
- Micro-ondas;
- Cuba e fonte para eletroforese;
- Microcomputador;
- Sistema de fotodocumentação; e
- Equipamento para extração automatizada de ácidos nucleicos (opcional).
Insumos
- Água livre de nucleases;
- Mix de dNTP;
- Oligonucleotídeos para PCR (QUADRO 2);
- Kit de PCR;
- Kit de extração de RNA (automática);
- Trizol (manual);
- Corante para ácidos nucleicos;
- Marcador de peso molecular;
- Tampão de carregamento (“loading buffer”);
- Gel de agarose;
- Controle DETECTADO para SuHV-1; e
- Sugestão de iniciadores apresentados no QUADRO 2.
QUADRO 2 - Sugestão de oligonucleotídeos para PCR para detecção molecular de SuHV-1
|
Oligonucleotídeo |
Tipo de PCR |
Sequência |
Referência |
|
SuHV-1.gE.493.F |
PCR |
ccgcgggccgtgttctttgt |
Huang, 2004 |
|
SuHV-1.gE.493.R |
cgtggccgttgtgggtcat
|
||
|
SuHV-1.gC. 788.F |
Sequenciamento |
gtttcctgattcacgcccacgc |
Goldberg, 2011 |
| SuHV-1.gC.788.R | gaagggctcaccgaagaggac |
Soluções
- Solução de álcool 70º INPM; e
- Solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses.
Realização do ensaio
Extração de DNA
- A extração pode ser realizada de forma automatizada ou manual, através de kits de extração de DNA ou reagentes específicos para o tipo de material a ser analisado, seguindo as recomendações do fabricante;
- Não utilizar reagentes após a data de validade e não misturar reagentes de lotes diferentes; e
- Adicionar as seguintes amostras controle a cada procedimento de extração: controle NÃO DETECTADO (água ou tecido bovino ou suíno).
Reação de amplificação de ácido nucleico (cPCR)
- Realizar o ensaio em duas áreas separadas: uma para o preparo do mix de reação (sala de pré-PCR) isenta de material genético e amplicons, e outra para a transferência de DNA para placa ou microtubos (sala de PCR);
- Antes e após o preparo do mix de reação, descontaminar a cabine e os materiais a serem utilizados com solução descontaminante (para DNA, RNA, proteínas e nucleases) e/ou álcool 70º INPM; e
- As micropipetas utilizadas para o preparo do mix de reação e adição das amostras devem ser exclusivas para tais finalidades.
Preparo do mix de reação
- Preparar o mix de reação de acordo com protocolos validados e específicos para o agente pesquisado (SuHV-1) em quantidade suficiente para o número de amostras a serem testadas, considerando algumas a mais;
- Adicionar o mix de reação a cada poço da microplaca (ou microtubos); e
- Devem ser incluídos nas análises:
- Controle DETECTADO para SuHV-1;
- Controle NÃO DETECTADO da extração; e
- Branco (água livre de nucleases).
Reação de cPCR
- Após o preparo do mix, adicionar o DNA nos poços da placa ou em microtubos identificados com a numeração da amostra a ser testada; e
- Realizar a amplificação em termociclador certificado, conforme as especificações de temperatura do protocolo utilizado.
Eletroforese
- Preparar o gel de agarose em concentração adequada ao protocolo de PCR utilizado. Adicionar um corante para ácidos nucleicos em proporção suficiente para visualização das bandas;
- Para a corrida das amostras, adicionar tampão de carregamento (loading buffer) ao produto de PCR;
- Aplicar marcador de peso molecular em um dos poços do gel;
- Realizar a corrida em cuba de eletroforese, utilizando o tempo e a voltagem adequados para o volume do gel e o protocolo de PCR utilizado; e
- Visualizar o gel sob luz ultravioleta, fotografar com o auxílio de um fotodocumentador e analisar o resultado.
Critérios de aceitação da prova
- As amostras de controle DETECTADO para SuHV-1 devem apresentar bandas de tamanhos correspondentes aos amplicons do protocolo utilizado; e
- As amostras de controle NÃO DETECTADO (controle NÃO DETECTADO da extração e branco) não devem apresentar bandas de amplificação.
Interpretação dos resultados
- Comparar os resultados das amostras testadas ao das amostras controle, a fim de classificá-las como positivas ou negativas;
- A leitura das bandas deve ser clara e livre de amplicons inespecíficos para o teste ser considerado satisfatório; e
- Qualquer amostra questionável deverá ser retestada.
Emissão dos resultados
- Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO” ou “NÃO DETECTADO”; e
- Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
Descarte das amostras e Resíduos
- Após um período mínimo de 90 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas;
- Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
¶ E. Técnica de PCR em tempo real com transcrição reversa (qPCR) para SuHV-1
Materiais
- Luvas de procedimento, nitrílica ou de látex isentas de pó;
- Microtubos de volumes variados ou microplacas;
- Microplacas ou microtubos para leitura óptica de qPCR;
- Tampas adesivas para microplacas para leitura óptica de qPCR;
- Ponteiras com filtro, estéreis, livres de DNAses e RNAses;
- Estantes para microtubos; e
- Gaze ou papel toalha.
Equipamentos e instrumentos
- Autoclave;
- Cabine de segurança biológica com filtro HEPA classe II (requisito mínimo) ou estação de trabalho para PCR (Workstation PCR) com luz UV germicida;
- Geladeira;
- Freezer;
- Micropipetas mono e multicanais de volumes reguláveis;
- Termociclador para PCR em tempo real;
- Centrífuga refrigerada com rotores para microtubos;
- Agitador de microtubos;
- Microcomputador; e
- Equipamento para extração automatizada de ácidos nucleicos (opcional).
Insumos
- Água livre de nucleases;
- Oligonucleotídeos para qPCR (QUADRO 3);
- Controle DETECTADO para SuHV-1 (sempre utilizar DNA viral para averiguar eficiência da transcrição reversa);
- Kit de qPCR; e
- Kit de extração de DNA.
QUADRO 3 - Sugestão de oligonucleotídeos para qPCR para detecção molecular de SuHV-1
| Oligonucleotídeo | Tipo de PCR | Sequência | Referência |
| SuHV-1.gB.92.F |
qPCR |
ctcctgccgcacctgaag |
Nonaka, 2017 |
| SuHV-1.gB.92.R | gtctggaagcggtagaagcc | ||
| SuHV-1.gB.92.P | FAM-cggaactcgctgacgcacca-NFQ | ||
| SuHV-1.gE.136.F |
qPCR |
gatgcagggctcgtacac |
Nonaka, 2017 |
| SuHV-1.gE.136.R | ggacacgttcgacctgatg | ||
| SuHV-1.gE.136.P | FAM-agcgtggcggtgaagttctcg-NFQ |
Soluções
- Solução de álcool 70º INPM; e
- Solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses.
Realização do ensaio
Extração de DNA
- A extração pode ser realizada de forma automatizada ou manual, através de kits de extração de DNA ou reagentes específicos para o tipo de material a ser analisado, seguindo as recomendações do fabricante;
- Não utilizar reagentes após a data de validade e não misturar reagentes de lotes diferentes; e
- Adicionar as seguintes amostras controle a cada procedimento de extração: controle NÃO DETECTADO (água ou tecido bovino ou suíno).
Reação de amplificação de ácido nucleico por qPCR
- Realizar o ensaio em duas áreas separadas: uma para o preparo do mix de reação (sala de pré-PCR) isenta de material genético e amplicons, e outra para a transferência de DNA para placa ou microtubos (sala de PCR);
- Antes e após o preparo do mix de reação, descontaminar a cabine e os materiais a serem utilizados com solução descontaminante (para DNA, RNA, proteínas e nucleases) e/ou álcool 70º INPM; e
- As micropipetas utilizadas para o preparo do mix de reação e adição das amostras devem ser exclusivas para tais finalidades.
Preparo do mix de reação
- Preparar o mix de reação de acordo com protocolos validados e específicos para o agente pesquisado (SuHV-1) em quantidade suficiente para o número de amostras a serem testadas, considerando algumas a mais;
- Após o preparo do mix, adicionar o DNA nos poços da placa ou em microtubos para leitura óptica;
- A adição de DNA e das amostras controle deve ser realizada em uma área distinta do preparo do mix (sala de PCR);
- Devem ser incluídos nas análises:
- Controle DETECTADO para SuHV-1;
- Controle NÃO DETECTADO da extração;
- Branco (água livre de nucleases); e
- Controle DETECTADO e NÃO DETECTADO do kit utilizado (se houver).
Reação de qPCR
- Selar a placa com adesivo óptico ou fechar a tampa dos microtubos. Verificar se há bolhas no fundo do poço e/ou gotículas na parede dos poços da placa ou tubo. Caso isto ocorra, centrifugar brevemente para reduzir as bolhas e para que o conteúdo se posicione na parte inferior da placa ou tubo;
- Iniciar e entrar com os dados no software do termociclador (identificação das amostras e seleção dos fluoróforos), conforme especificações do fabricante;
- Inserir a placa ou os tubos no termociclador, salvar o arquivo e iniciar a corrida; e
- Ao finalizar, salvar os dados e interpretar os resultados.
Critérios de aceitação da prova
- Para a validação do ensaio, o controle DETECTADO deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório; e
- O controle NÃO DETECTADO deve ter Cq indeterminado ou maior que o limite do kit. O gráfico do controle NÃO DETECTADO deve apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
Interpretação dos resultados
- Ao analisar os resultados da corrida, o operador deve avaliar os seguintes componentes: controle DETECTADO, controle NÃO DETECTADO, controle da extração, background de fluorescência e gráficos de amplificação de cada amostra individualmente. Após a validação do ensaio, interpretar os resultados conforme especificações do fabricante;
- O limiar de Cq a ser considerado DETECTADO deve ser avaliado conforme definido na verificação desempenho da técnica ou conforme consta a literatura;
- Amostra com resultado inconclusivo: aquelas com valor de Cq intermediário entre o valor para detectado e não detectado;
- Qualquer amostra questionável deverá ser retestada; e
- Amostras positivas devem ser submetidas a sequenciamento para genotipagem viral.
Emissão dos resultados
- Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”; e
- Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
Descarte das amostras e Resíduos
- Após um período mínimo de 90 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
- Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
¶ 4.3. LÍNGUA AZUL
4.3.1. Amostras
São consideradas amostras para o diagnóstico da Língua Azul:
4.3.1.1. Detecção da Resposta Imune
Soro sanguíneo
4.3.1.2. Identificação do Agente
- Sangue total;
- Baço;
- Fígado;
- Medula óssea;
- Linfonodos; e
- Sêmen (para fins de exportação).
4.3.2. Recebimento das Amostras
4.3.2.1. Para atendimento aos Programas e Controles Oficiais do MAPA os Laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
4.3.2.2. Deverão ser obedecidos aos critérios estabelecidos no capítulo de verificação de conformidade de amostras.
4.3.3. Técnicas de Diagnóstico
4.3.3.1. Somente poderão ser utilizados insumos de diagnóstico que tenham registro no MAPA, segundo legislação em vigor;
4.3.3.2. Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados;
4.3.3.3. O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumo:
a) Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente; e
b) Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 a 25ºC.
4.3.3.4 Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados;
4.3.3.5 O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios;
4.3.3.6. Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada;
4.3.3.7 Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório;
Nota: A utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitido quando:
I. A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos.
II. As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes.
III. O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
¶ A. Ensaio Imunoenzimático (ELISA)
Materiais
- Luvas para procedimentos;
- Pipetas de vidro graduadas ou descartáveis;
- Provetas graduadas;
- Béqueres;
- Erlenmeyers;
- Ponteiras descartáveis;
- Descartador de ponteiras;
- Reservatórios para soluções (cubetas);
- Papel absorvente;
- Selador ou tampa para placas de ELISA;
- Caneta para identificação de vidraria; e
- Cubas para descarte de materiais resistente à autoclavação.
Equipamentos e instrumentos
- Autoclave;
- Geladeira;
- Estufa;
- Termômetros
- Micropipetas monocanal e multicanal de volumes reguláveis;
- Pipetador automático ou manual;
- Leitora de ELISA;
- Cronômetros;
- Agitador de tubos tipo vórtex (opcional);
- Agitador de microplacas (opcional); e
- Lavadora de microplacas (opcional).
Insumos
Kits de ELISA de detecção de anticorpos para o vírus da Língua Azul.
Soluções
- No preparo das soluções deve ser utilizado somente os reagentes fornecidos pelo fabricante, ou aqueles por ele indicados;
- Conjugados, substratos e solução de parada deverão ser utilizados obedecendo-se as condições do fabricante;
- No preparo da solução de lavagem deve-se assegurar que não existem cristais precipitados na solução;
- Diluir a soluções utilizando água ultrapura ou destilada conforme instruções do fabricante e homogeneizar bem; e
- No preparo das soluções deve ser utilizado somente os reagentes fornecidos pelo fabricante, ou aqueles por ele indicados.
Realização do ensaio
- Para realização dos ensaios de ELISA devem ser consideradas as orientações do fabricante do kit de diagnóstico utilizado. Atentar para ocorrência de atualização na bula do kit, principalmente em mudanças de lote;
- A ordem de execução das etapas do ensaio, duração, volumes utilizados e temperatura de incubação variam de acordo com fabricante do kit utilizado;
- Homogeneizar gentilmente todos reagentes e amostras antes do uso;
- Utilizar ponteiras distintas para cada controle e amostra de soro;
- Homogeneizar as placas tocando-as na lateral ou utilizando um agitador de placas;
- Nas etapas de incubação, as placas devem ser seladas para se evitar evaporação;
- As placas devem ser lavadas com a solução indicada pelo kit. Após a última lavagem remover resíduos em um material absorvente (papel toalha ou toalha). Deixar as placas secas o mínimo de tempo possível entre a lavagem e adição do próximo reagente; e
- Decorridas todas as etapas do teste, realizar a leitura da absorbância na leitora de ELISA utilizando filtro com comprimento de onda indicado nas instruções do fabricante.
Critérios de aceitação do Ensaio
O resultado do ensaio será considerado válido somente se as DOs dos soros controles estiverem dentro dos limites aceitáveis e determinados pelo fabricante. Caso contrário, o ensaio deve ser repetido.
Interpretação dos resultados
- De acordo com as DOs obtidas consideram-se as amostras como reagentes ou não reagentes; e
- Amostras com DO entre os dois pontos de corte estabelecidos serão consideradas inconclusivas e deverão ser novamente ensaiadas.
Emissão dos resultados
- Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “REAGENTE”, “NÃO REAGENTE”, ou de acordo com o preconizado com o fabricante do insumo (kit de diagnóstico); e
- Caso após o novo ensaio o resultado permaneça “INCONCLUSIVO” este deve ser reportado no Relatório de Ensaio.
Descarte de Amostras e Resíduos
- Antes da realização do descarte de amostras e produtos de ensaio deverão ser observados os prazos mínimos estabelecidos. Retenção de Itens de Ensaio;
- Todo material utilizado na realização do ensaio deve ser imerso em cuba com solução de ácido cítrico 0,2%, hipoclorito de sódio 0,5% ou solução para descontaminação similar, por no mínimo de 1 hora;
- Após este período, todo o material utilizado na realização do ensaio deve ser submetido ao processo de autoclavação apropriado e validado. A efetividade de esterilização deve estar comprovada em procedimentos próprios do laboratório; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo processo de descarte.
Retenção de itens de ensaio
Soro sanguíneo
- Poderão ser descartados 60 dias após a emissão do relatório de ensaio, registrando-se nos formulários próprios e conferidos antes do descarte; e
- Amostras positivas de qualquer origem devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo elas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
¶ B. Técnica da imunodifusão em gel-ágar (IDGA) para pesquisa de anticorpos para o vírus da Língua Azul
Nota: O IDGA para Língua Azul pode apresentar reação cruzada com outros Orbivírus, portanto, não apresenta especificidade para língua azul, sendo possível detectar anticorpos para o vírus da doença Hemorrágica Epizóotica (EHD). Desta forma, se detectar animais reagentes no IDGA, estes deverão ser submetidos ao teste de ELISA para confirmação da língua azul.
Materiais
- Luvas para procedimentos;
- Pipetas de vidro graduadas ou descartáveis;
- Provetas graduadas;
- Béqueres;
- Erlenmeyers;
- Balão volumétrico;
- Ponteiras descartáveis;
- Placa de Petri de poliestireno de 90mm ou 30-40mm de diâmetro;
- Descartador de ponteiras;
- Caneta para identificação de vidraria; e
- Cubas para descarte de materiais resistente à autoclavação.
Equipamentos
- Autoclave;
- Geladeira;
- Freezer;
- Microondas;
- Micropipetas monocanal de volumes reguláveis;
- Pipetador automático ou manual;
- Balança analítica;
- Medidor de pH;
- Destilador ou deonizador de água;
- Centrifuga;
- Autoclave;
- Cortador de gel padrão: roseta com 7 perfurações;
- Câmara Úmida;
- Fonte de luz;
- Bomba de vácuo (opcional); e
- Bancada nivelada.
Insumos
- Antígeno do vírus da língua azul para prova de imunodifusão em ágar-gel - IDGA;
- Soro controle positivo para o vírus da língua azul; e
- Soros controle forte-positivo, fraco-positivo e negativo para o vírus da língua azul.
Soluções
Gel de ágar a 0,9% em solução salina 0,85%.
Realização do ensaio
Preparação das Lâminas ou Placas de Petri
- Identificar as lâminas ou placas de petri conforme o formulário de acompanhamento do ensaio utilizando caneta apropriada;
- Aquecer o Gel de ágar a 0,9%, em microondas, por tempo necessário até a completa fusão, evitando o borbulhamento e extravasamento;
- Distribuir o gel na lâmina ou placa de petri e deixá-lo solidificar em temperatura ambiente (20°C a 25°C) ou de refrigeração (2 a 8°C) durante 30 minutos;
- Perfurar o gel com auxílio do cortador padrão, posicionando as rosetas de forma equidistante;
- Remover o gel dos poços das rosetas; e
- Armazenar as lâminas ou placas de petri na câmara úmida se não forem utilizadas imediatamente, para evitar o ressecamento do gel.
Execução
- Homogeneizar as amostras antes do uso;
- Distribuir as amostras a serem testadas, alternadamente;
- Distribuir o soro controle positivo (SCP), alternadamente com as amostras testadas;
- Distribuir o antígeno (Ag) no poço central;
- Durante a distribuição evitar o extravasamento de material dos poços. Quando corretamente distribuídos, a superfície fica levemente côncava. Em caso de extravasamento, descartar a lâmina;
- Incubar em câmara úmida durante 48 horas;
- Registrar a temperatura, no momento inicial da incubação, com 24 horas e 48 horas;
- Realizar a leitura após 48 horas de incubação com auxílio de uma fonte de luz; e
- O resultado final somente será emitido após a leitura com 48 horas.
Critérios de aceitação
- As linhas de precipitação que indicam a interação antígeno-anticorpo devem se formar entre os poços em que foram adicionados os soros controle sabidamente positivos e o antígeno;
- Os soros controles devem apresentar linhas de precipitação dentro do esperado; e
- Caso as linhas estejam fracas para serem visualizadas, incubar por mais 24 horas e realizar a leitura novamente.
Interpretação dos resultados
- Amostra reagente: a linha de precipitação do soro controle se une com a formada pelo Ag e pela amostra, apresentando uma linha contínua, de identidade total;
- Amostra fraco reagente: a linha de precipitação de uma amostra com baixa concentração de anticorpos tende a se formar mais próxima à cavidade onde a amostra se encontra;
- Amostra não reagente: a linha de precipitação formada entre o Ag e o soro controle se dirige para a cavidade onde se encontra a amostra; e
- Amostra inespecífica: ocasionalmente se formam linhas de precipitação entre os soros e/ou entre soros e antígeno, que não têm identidade com a linha do soro controle positivo. Estas linhas cruzam a linha de precipitação formada entre o soro controle positivo e o antígeno. As presenças de reações inespecíficas podem ocorrer concomitantes com uma reação positiva entre o soro problema e o antígeno ou com uma reação negativa entre ambos. A linha não específica não forma uma linha contínua com as linhas do soro controle positivo (SCP).
Emissão dos resultados
- Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “REAGENTE” ou “NÃO REAGENTE”, ou conforme recomendado na bula do kit; e
- Soros positivos para
Descarte das amostras e resíduos
- Antes da realização do descarte de amostras e produtos de ensaio deverão ser observados os prazos mínimos estabelecidos. Retenção de Itens de Ensaio;
- Todo o material utilizado na realização do ensaio deve ser submetido ao processo de autoclavação apropriado. A efetividade da esterilização deve estar comprovada em procedimentos próprios do laboratório e devem ser utilizados controles físicos, químicos e biológicos para o monitoramento do processo;
- Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos; e
- O laboratório deve assegurar a biossegurança dos resíduos gerados, e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo o processo do descarte.
Retenção de itens de ensaio
Soro sanguíneo
Após um período mínimo de 60 dias da emissão do relatório de ensaio, as amostras não reagentes poderão ser descartadas, registrando-se em formulários próprios e conferidas antes do descarte.
¶ C. Técnica de PCR em tempo real com transcrição reversa RT-qPCR para o vírus da BTV
Materiais
- Luvas de procedimento nitrílicas ou de látex isentas de pó;
- Microtubos de volumes variados ou microplacas;
- Microplacas ou microtubos para leitura óptica de RT-qPCR;
- Tampas adesivas para microplacas para leitura óptica de RT-qPCR;
- Ponteiras com filtro, estéreis, livres de DNAses e RNAses;
- Estantes para microtubos; e
- Gaze ou papel toalha.
Equipamentos e instrumentos
- Autoclave;
- Cabine de segurança biológica com filtro HEPA classe II (requisito mínimo) ou estação de trabalho para PCR (Workstation PCR) com luz UV germicida;
- Geladeira;
- Freezer;
- Micropipetas mono e multicanais de volumes reguláveis;
- Termociclador para PCR em tempo real;
- Centrífuga refrigerada com rotores para microtubos;
- Agitador de microtubos;
- Microcomputador; e
- Equipamento para extração automatizada de ácidos nucleicos (opcional).
Insumos
- Água livre de nucleases;
- Oligonucleotídeos para RT-qPCR (QUADRO 2);
- Controle DETECTADO para o vírus da BTV (sempre utilizar RNA viral para averiguar eficiência da transcrição reversa);
- Kit de RT-qPCR;
- Kit de extração de RNA (automática);
- Trizol (manual); e
- Recomenda-se o uso de reações de passo único (one step) para síntese e amplificação de cDNA no mesmo tubo.
QUADRO 2 - Sugestão de oligonucleotídeos para RT-qPCR para detecção molecular do vírus da BTV
| Oligonucleotídeo | Tipo de PCR | Sequência | Referência |
| BTV.west.91F | RT-qPCR | GCTTTTGAGGTGTACGTGAAC | Shaw et al., 2007 |
| BTV.west.91R | TCTCCCTTGAAACTCTATAATTACG | ||
| BTV.East.97F | GCGTTCGAAGTTTACATCAAT | ||
| BTV.East.97R | CAGTCATCTCTCTAGACACTCTATAATTACG | ||
| BTV.west/east.S | FAM-CYG GAT CAA GTT CAC TCC AYG GC-Iowa Black | ||
| BTV.OIE.2014.F | RT-qPCR | TGG-AYA-AAG-CRA-TGT-CAA-A |
Hofmann et al., 2008
|
| BTV.OIE.2014.R | ACR-TCA-TCA-CGA-AAC-GCT-TC | ||
| BTV.OIE.2014.S | FAM-ARG-CTG-CAT-TCG-CAT-CGT-ACG- C- IowaBlack | ||
| BTV.S5.76.F | RT-qPCR | GGCAACYACCAAACATGGA | Toussaint et al., 2007 |
| BTV.S5.76..R | AAAGTYCTCGTGGCATTWGC | ||
| BTV.S5.76..P | FAM-CYCCACTGATRTTGTATTTTCTCAA-TAMRA |
Soluções
- Solução de Álcool 70%; e
- Solução descontaminante de DNA e RNAses.
Realização do ensaio
Extração de RNA
- A extração pode ser realizada de forma automatizada ou manual, através de kits de extração de RNA ou reagentes específicos para o tipo de material a ser analisado, seguindo as recomendações do fabricante;
- Não utilizar reagentes após a data de validade e não misturar reagentes de lotes diferentes; e
- Adicionar as seguintes amostras controle a cada procedimento de extração: controle NÃO DETECTADO (água ou tecido bovino ou suíno).
Reação de amplificação de ácido nucleico por RT-qPCR
- Realizar o ensaio em duas áreas separadas: uma para o preparo do mix de reação (sala de pré-PCR) isenta de material genético e amplicons, e outra para a transferência de DNA para placa ou microtubos (sala de PCR);
- Antes e após o preparo do mix de reação, descontaminar a cabine e os materiais a serem utilizados com solução descontaminante (para DNA, RNA, proteínas e nucleases) e/ou Álcool 70º INPM; e
- As micropipetas utilizadas para o preparo do mix de reação e adição das amostras devem ser exclusivas para tais finalidades.
Preparo do mix de reação
- Preparar o mix de reação de acordo com protocolos validados e específicos para o agente pesquisado (vírus da BTV) em quantidade suficiente para o número de amostras a serem testadas, considerando algumas a mais;
- Após o preparo do mix, adicionar o RNA nos poços da placa ou em microtubos para leitura óptica;
- A adição de RNA e das amostras controle deve ser realizada em uma área distinta do preparo do mix (sala de PCR);
- Devem ser incluídos nas análises:
- Controle DETECTADO para vírus da BTV;
- Controle NÃO DETECTADO da extração;
- Branco (água livre de nucleases); e
- Controle DETECTADO e NÃO DETECTADO do kit utilizado (se houver).
Reação de RT-qPCR
- Selar a placa com adesivo óptico ou fechar a tampa dos microtubos. Verificar se há bolhas no fundo do poço e/ou gotículas na parede dos poços da placa ou tubo. Caso isto ocorra, centrifugar brevemente para reduzir as bolhas e para que o conteúdo se posicione na parte inferior da placa ou tubo;
- Iniciar e entrar com os dados no software do termociclador (identificação das amostras e seleção dos fluoróforos), conforme especificações do fabricante;
- Inserir a placa ou os tubos no termociclador, salvar o arquivo e iniciar a corrida; e
- Ao finalizar, salvar os dados e interpretar os resultados.
Critérios de aceitação da prova
- Para a validação do ensaio, o controle DETECTADO deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório; e
- O controle NÃO DETECTADO deve ter Cq indeterminado ou maior que o limite do kit. O gráfico do controle NÃO DETECTADO deve apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
Interpretação dos resultados
- Ao analisar os resultados da corrida, o operador deve avaliar os seguintes componentes: controle DETECTADO, controle NÃO DETECTADO, controle da extração, background de fluorescência e gráficos de amplificação de cada amostra individualmente. Após a validação do ensaio, interpretar os resultados conforme especificações do fabricante;
- O limiar de Cq a ser considerado DETECTADO deve ser avaliado conforme definido na verificação desempenho da técnica ou conforme consta a literatura;
- Amostra com resultado inconclusivo é aquela com valor de Cq intermediário entre o valor para detectado e não detectado;
- Qualquer amostra inconclusiva deverá ser retestada; e
- Amostras positivas devem ser submetidas a sequenciamento para genotipagem viral.
Emissão dos resultados
- Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”; e
- Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
Descarte das amostras e Resíduos
- Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
- Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
¶ 5. Base legal e documentos de referência
¶ Raiva
- BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Manual Técnico de controle da raiva dos herbívoros – MAPA, 2009.
- BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Manual de procedimentos para diagnóstico das doenças do sistema nervoso central dos bovinos – MAPA, 2002.
- BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Manual Veterinário de coleta e envio de amostras – MAPA/OPAS, 2010.
- CLIQUET F., AUBERT M. & SAGNE L. (1998). Development of a fluorescent antibody virus neutralisation test (FAVN test) for the quantitation of rabies-neutralising antibody. J. Immunol. Methods, 212, 79–87.
- FREULING C.M., HOFFMANN B., FISCHER M., MCELHINNEY L.M., MARSTON D.A., FOOKS A.R. & MÜLLER T.F. (2014). Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction for the Demonstration of Lyssavirus Nucleic Acid. In: Current Laboratory Techniques in Rabies Diagnosis, Research, and Prevention, Volume 1, Rupprecht C. 1 Nagarajan T., eds. Academic Press, Elsevier, San Diego, USA.
- HEATON P.R., JOHNSTONE P., MCELHINNEY L.M., COWLEY R., O’SULLIVAN E. & WHITBY J.E. (1997). Heminested PCR assay for detection of six genotypes of rabies and rabies-related viruses. J. Clin. Microbiol., 35, 2762–2766.
- Rabies (infection with rabies virus and other lyssaviruses). CHAPTER 3.1.18. Version (NB: Version adopted in May 2023).Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 2024, versão online. versão online. Disponível em: hhttps://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/. Acesso em 22 de jul. 2024.
- ROBARDET E., PICARD-MEYER E., ANDRIEU S., SERVAT A. & CLIQUET F. (2011). International interlaboratory trials on rabies diagnosis: an overview of results and variation in reference diagnosis techniques (fluorescent antibody test, rabies tissue culture infection test, mouse inoculation test) and molecular biology techniques. J. Virol. Methods, 177, 15–25.
- RUDD R.J. & TRIMACHI C.V. (1989). Development and evaluation of an in vitro virus isolation procedure as a replacement for the mouse inoculation test in rabies diagnosis. J. Clin. Microbiol., 27, 2522–2528.
¶ Doença de Aujeszky
- Aujeszky’s disease (infection with Aujeszky’s disease virus). CHAPTER 3.1.2. Version (NB: Version adopted in May 2018).Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 2024, versão online. versão online. Disponível em: hhttps://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/. Acesso em 22 de jul. 2024.
- Goldberg TL, Weigel RM, Hahn EC, Scherba G. Comparative utility of restriction fragment length polymorphism analysis and gene sequencing to molecular epidemiological investigation of a viral outbreak. Epidemiol. Infect. 2001, 126, 415–424.
- Huang C, Hung JJ, Wu CY, Chien MS. Multiplex PCR for rapid detection of pseudorabies virus, porcine parvovirus and porcine circoviruses. Vet Microbiol. 2004 Jul 14;101(3):209-14.
- Nonaka CKV, Fonseca Junior AA, Guedes EO, D´Ambros, RM, Lima, GK, Camargos MF, Heinemann MB (2017). Different methods of real-time PCR for detection of pseudorabies virus. Ciência Rural, 47(3), e20160342.
- Reed LJ, Muench H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. Am J Hyg. 1938; 27:493–497
¶ Língua Azul
- Bluetongue (Infection with Bluetongue virus). CHAPTER 3.1.3. Version (NB: Version adopted in May 2021) Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 2024, versão online. versão online. Disponível em: hhttps://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/. Acesso em 22 de jul. 2024.
- Hofmann M, Griot C, Chaignat V, Peler L, Thuer B. Bluetongue disease reaches Switzerland. Schweiz. Arch. Tierheilk. 150:115-126, 2008.
- Shaw AE, Monaghan P, Alpar HO, Anthony S, Darpel KE, Batten CA, Guercio A, Alimena G, Vitale M, Bankowska K, Carpenter S, Jones H, Oura CA, King DP, Elliott H, Mellor PS, Mertens PP. Development and initial evaluation of a real-time RT-PCR assay to detect bluetongue virus genome segment 1. J Virol Methods. 2007 Nov;145(2):115-26. doi: 10.1016/j.jviromet.2007.05.014. Epub 2007 Jun 21. PMID: 17586061.
- Toussaint JF, Sailleau C, Breard E, Zientara S, De Clercq K. Bluetongue virus detection by two real-time RT-qPCRs targeting two different genomic segments. J Virol Methods. 2007 Mar;140(1-2):115-23. doi: 10.1016/j.jviromet.2006.11.007. Epub 2006 Dec 28. PMID: 17196266.
¶ 6. Disposições Gerais
As sugestões para aprimoramento ou possíveis correções deste documento devem ser direcionadas ao Departamento responsável, para alinhamento das melhores práticas de mercado, legislação vigente e/ou regulamentações, que não tenham sido contempladas na versão vigente.
¶ 7. Histórico de revisões
| Versão | Conteúdo alterado | Data | Motivo |
|---|---|---|---|
| 1 | - | 17.01.2025 | Elaboração do documento |
¶ 8. Anexos
¶ Anexo I - Soluções empregadas no ensaio de Raiva
Acetona 80%
- Reagentes: Acetona PA e Água desmineralizada;
- Preparo: Em um becker de 1000 mL, colocar 800mL de acetona PA e 200 mL água desmineralizada; misturar a solução com um bastão de vidro; e
- Armazenamento: 2°C a 8°C.
Glicerina 50%
- Reagentes: Glicerina e Solução Salina Tamponada Ph 7,6;
- Preparo: Diluir a Glicerina junto a Solução Salina Tamponada em partes iguais e misturar até a completa homogeinização; e
- Armazenamento: Temperatura Ambiente.
Glicerina tamponada 10%
- Reagentes: Glicerina PA e solução de salima tamponada;
- Preparo: Diluir 10 ml de Glicerina PA em 90 ml de Solução Salina Tamponada; e
- Armazenamento: Temperatura Ambiente.
Hipoclorito de Sódio 0,5%
- Reagentes: Hipoclorito e Água desmineralizada;
- Preparo: Diluir 5 mL de hipoclorito em 1000 mL de água desmineralizada (q.s.p); e
- Armazenamento: Temperatura Ambiente.
Solução Salina 0,85%
- Reagentes: NaCl e Água Destilada;
- Preparo: Adicionar 8,5 g de NaCl em 800 ml de água destilada. Diluir esta solução com um bastão magnético. Após a completa diluição completa-se o volume até 1000 ml com água destilada; e
- Armazenamento: 2 a 8ºC.
Solução Salina Tamponada Fosfatada pH 7,6
- Reagentes: Na2HPO4 12 H2O, NaH2PO4.H2O, NaCl e H2O destilada;
- Preparo: Para 1000 ml de SST dissolver os sais em uma parte de água destilada, adicionar os sais na quantidade de 2,65g de Na2HPO4 12 H2O, 0,36g NaH2PO4.H2O e 8,17gde NaCl e após dissolução, completar o volume final de 1000 ml no recipiente com água destilada; e
- Armazenamento: 2°C a 8°C