Elaboração, distribuição, informações: Ministério da Agricultura e Pecuária Secretaria de Defesa Agropecuária - SDA Departamento de Serviços Técnicos - DTEC Esplanada dos Ministérios, Bloco D, Anexo, Ala B, 4º andar, sala 433 CEP: 70043-900, Brasília - DF www.agricultura.gov.br e- mail: cgal@agro.gov.br Central de Relacionamento: 0800 704 1995
Realizar a padronização, harmonização, atualização e a unificação dos procedimentos para execução de ensaios laboratoriais da área de Diagnóstico Animal
Processo:
Análises Laboratoriais
Entrega:
Segurança e saúde dos rebanhos animais
Público alvo e demais interessados:
Laboratórios oficiais ou credenciados do Ministério da Agricultura e Pecuária (Mapa)
Versão do documento:
1
Setor responsável e responsabilidades
A Coordenação Geral de Laboratórios Agropecuários do Departamento de Serviços Técnicos é responsável pela elaboração, atualização e envio para aprovação deste manual, tendo responsabilidade quanto aos procedimentos descritos no documento.
O presente manual possui vigência e prazo indeterminado e será revisado sempre que necessário, no mínimo anualmente, pela Coordenação Geral de Laboratórios Agropecuários do Departamento de Serviços Técnicos (CGAL/DTEC).
A gestão desse manual está sob a responsabilidade da CGAL/DTEC que prestará auxílio ao público alvo leitor dúvidas e/ou sugestões quanto à aplicação deste manual devem ser submetidas ao Departamento responsável.
A publicação e atualização das versões na plataforma oficial da SDA para acesso pelo público alvo será de responsabilidade da Secretaria representada pelo DTEC.
O objetivo do Manual é reunir os métodos analíticos a serem empregados na execução de ensaios laboratoriais da área de Diagnóstico Animal da Rede Nacional de Laboratórios Agropecuários (Rede LFDA e Laboratórios credenciados junto ao Ministério da Agricultura e Pecuária).
São consideradas amostras para o diagnóstico da Brucelose:
4.1.1.1. Diagnóstico indireto
Soro sanguíneo
4.1.1.2 Identificação do agente
Linfonodos;
Leite;
Colostro;
Suabe vaginal;
Carúnculas uterinas;
Conteúdo estomacal fetal;
Suabe retal fetal;
Conteúdo seroso de bursites cervicais;
Baço;
Fígado;
Glândula mamária; e
Ligamento cervical (bolsa bursítica).
4.1.2. Recebimento das Amostras
4.1.2.1. Disposições Gerais
4.1.2.1.1. Para atendimento aos Programas e Controle Oficiais do MAPA os Laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento;
4.1.2.1.2. As amostras deverão ser encaminhadas ao laboratório, individualmente separadas por matriz, e obedecendo a critérios de biossegurança; e
4.1.2.1.3. A manipulação das amostras para isolamento de Brucella deverá ser realizada em nível de biossegurança 3.
4.1.3. Técnicas de Diagnóstico
4.1.3.1. Somente poderão ser utilizados insumos de diagnóstico que tenham registro no MAPA, segundo legislação em vigor;
4.1.3.2. Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados;
4.1.3.3. O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo as temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos;
a) Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente; e
b)Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 e 25ºC.
4.1.3.4. Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios de interpretação dos resultados;
4.1.3.5. O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios;
4.1.3.6. Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas críticas realizadas para cada amostra analisada;
4.1.3.7. Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório;
Nota: A utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitido quando:
I. A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos.
II. As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes.
III. O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
Reservatórios para soluções (cubas para descarte de soluções ou equivalentes); e
Caneta para identificação de vidraria.
Equipamentos e instrumentos
Geladeira;
Termômetros;
Micropipetas monocanal de volumes reguláveis;
Pipetador automático ou manual;
Cronômetros;
Agitador de tubos tipo vórtex (opcional); e
Leitor de luz polarizada.
Insumos
Kit de diagnóstico para Brucelose porpolarização fluorescente; e
Água destilada ou deionizada, conforme recomendação do fabricante do kit.
Soluções
No preparo das soluções devem ser utilizados somente os reagentes fornecidos pelo fabricante, ou aqueles por ele indicados.
Realização do ensaio
Para realização dos ensaios de polarização fluorescente devem ser consideradas as orientações do fabricante do kit de diagnóstico utilizado. Atentar para ocorrência de atualização na bula do kit, principalmente em mudanças de lote.
Critérios de aceitação do Ensaio
Devem ser obedecidos os critérios de aceitação para os resultados dos soros controles presentes na bula do fabricante do Kit.
Interpretação dos resultados
Não Reagente: menos de 10 mP (milipolarização) acima da média dos controles negativo;
Inconclusivo: de 10 a 20 mP acima da média dos controles negativos; e
Reagente: mais de 20 mP acima da média dos controles negativos.
Emissão dos resultados
Os resultados deverão ser emitidos e expresso como “REAGENTE”, “NÃO REAGENTE” ou “INCONCLUSIVO”, ou de acordo com o preconizado com o fabricante do insumo (kit de diagnóstico).
Descarte de Amostras e Resíduos
Anteriormente ao descarte de amostras e produtos de ensaio, deverão ser observados os prazos mínimos estabelecidos no item “Retenção de Itens de Ensaio”;
Anteriormente ao descarte de amostras e produtos de ensaio, deve ser realizado registro de descarte em formulário próprio e conferência;
Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos; e
O laboratório deve assegurar a biossegurança dos resíduos gerados, e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo o processo do descarte.
Retenção de itens de ensaio
As amostras de soro poderão ser descartadas 60 dias após a emissão do relatório de ensaio.
Micropipetas monocanal de volumes reguláveis ou volume fixo de 30 µ; e
Caixa de leitura de luz indireta (Huddleson).
Insumos
Antígeno para a prova de AAT.
Soluções
Não aplicável
Realização do ensaio
A temperatura ambiente deve ser de 22ºC ± 4ºC;
As placas e misturadores devem ser limpos com água e detergente, devendo ser reutilizados somente após estarem secos;
Deixar os soros e o antígeno à temperatura de 22ºC ± 4ºC por, pelo menos, 30 (trinta) minutos. Caso os soros estejam congelados, este período de equilíbrio à temperatura ambiente deve ser de uma hora ou até que o material descongele e atinja a temperatura de prova;
Homogeneizar os soros e o antígeno antes de realizar o ensaio;
Dispensar 30 μL de antígeno em cada quadrado da placa devidro;
Dispensar 30 μL do soro a ser testado ao lado do antígeno, preferencialmente sem que os dois entrem em contato;
Misturar, com movimentos circulares, o soro e o antígeno, de modo a obter um círculo de aproximadamente 2 cm de diâmetro;
Agitar a placa com movimentos contínuos, por 4 minutos;
Colocar a placa na caixa de leitura com luz indireta e proceder a leitura; e
Em todas as provas a utilização de soros controle positivo e negativo é obrigatória.
Critérios de aceitação do Ensaio
Os resultados só serão válidos se forem obtidos os resultados esperados para os controles de prova; e
Resultados positivos obtidos após os 4 minutos de prova não deverão ser considerados.
Interpretação dos resultados
Amostra REAGENTE – serão caracterizadas pela presença de aglutinações; e
Amostra NÃO REAGENTE – serão caracterizadas pela ausência de aglutinações.
Emissão dos resultados
Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “REAGENTE” ou “NÃO REAGENTE”.
Descarte de amostras e resíduos
Anteriormente ao descarte de amostras e produtos de ensaio, deverão ser observados os prazos mínimos estabelecidos no item “Retenção de Itens de Ensaio";
Anteriormente ao descarte de amostras e produtos de ensaio, deve ser realizado registro de descarte em formulário próprio e conferência.;
Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos; e
O laboratório deve assegurar a biossegurança dos resíduos gerados, e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo o processo do descarte.
Retenção de itens de ensaio
Amostras de soro poderão ser descartados 60 dias após a emissão do relatório de ensaio.
¶C. Teste por meio da técnica de Soroaglutinação Lenta em Tubos e Redução pelo 2 - Mercaptoetanol (SAL/2-ME)
Materiais
Luvas para procedimentos;
Pipetas de vidro graduadas ou descartáveis;
Provetas graduadas;
Béqueres;
Erlenmeyers;
Tubos de ensaio;
Ponteiras descartáveis;
Descartador de ponteiras;
Reservatórios para descarte de soluções (cubas);
Papel absorvente;
Caneta para identificação de vidraria; e
Cubas para descarte de materiais resistente à autoclavação.
Equipamentos e instrumentos
Capela de exaustão química;
Geladeira;
Freezer;
Estufa;
Termômetros;
Micropipetas monocanal de volumes reguláveis;
Pipetador automático ou manual;
Agitador de tubos;
Balança analítica; e
Centrífuga refrigerada.
Insumos
2-ME com 99% de pureza mínima; e
Antígeno para prova de soroaglutinação lenta em tubos para o diagnóstico da brucelose (SAL/2-ME).
Soluções
Salina 0,85 % sem adição de formol; e
Salina a 0,85% contendo 0,5% de fenol (salina fenicada).
Disposições gerais
A diluição do antígeno para a série de tubos com 2-ME deve ser realizada em solução salina a 0,85%, sem adição de fenol;
Quando não indicado pelo fabricante, os antígenos diluídos devem ser conservados sob refrigeração (+4ºC a +8°C), podendo ser utilizados por um período de até uma semana;
O 2-ME, com 99% de pureza mínima, deve ser mantido em frascos de cor âmbar, hermeticamente fechados, armazenado de acordo com a recomendação do fabricante, e manipulado em capela de exaustão química; e
Em cada teste serão incluídos soros para controle de prova padronizado e com resultados conhecidos pelo laboratório. Devem ser observadas reações positivas e negativas no SAL e no 2- ME, assim como uma reação com título maior na SAL que no 2-ME.
Realização do ensaio
Permitir que a temperatura de todos os reagentes e amostras se equilibre com a do ambiente;
Diluir em tubos, o antígeno para Soroaglutinação Lenta (SAL) 100 (cem) vezes em solução salina a 0,85% contendo 0,5% de fenol. Concentração final 0,045%;
Diluir o antígeno para a prova de 2-ME em tubos 50 (cinquenta) vezes em solução salina 0,85% sem adição de fenol. Concentração final 0,090%;
Preparar solução de 2-ME a 0,1M misturando-se 7,8 mL de 2-ME a 992,20 mL de solução salina a 0,85% sem fenol. Para volumes diferentes, utilizar a mesma proporção;
Colocar, em uma estante, duas fileiras de quatro tubos de vidro de 13 mm X 75 mm, para cada amostra de soro a ser testada;
Utilizando micropipetas, fazer diluições seriadas das amostras de soro a 1:200, 1:100, 1:50 e 1:25, distribuindo-se, nessa ordem, 10 µL, 20 µL, 40 µL e 80 µL de soro em cada fileira de tubo;
Dispensar 1 mL de solução de 2-ME 0,1 mol/L diluído em solução salina nos quatro tubos para a prova de 2-ME;
Deixar esses tubos em repouso por, pelo menos, 15 (quinze) minutos em temperatura ambiente, para que o 2-ME lise as moléculas de IgM;
Enquanto os tubos da prova de 2-ME estiverem em repouso, dispensar 2 mL do antígeno diluído 1:100 em salina fenicada nos quatro tubos para a prova de SAL;
Após os quinze minutos, dispensar 1 mL do antígeno diluído 1:50 em solução salina nos quatro tubos para a prova de 2-ME. A concentração final do antígeno na solução será de 0,045% e a do 2-ME de 0,05 mol/L;
Misturar bem agitando a grade de tubos;
Incubar a 37 ± 2ºC por 48 ± 3 horas; e
Realizar a leitura da prova que é feita por meio de uma fonte de luz indireta contra um fundo escuro e opaco, com uma fonte de luz que atravesse os tubos. As fontes de luz estranhas devem ser reduzidas.
Critérios de aceitação do Ensaio
Os resultados só serão válidos se forem obtidos os resultados esperados para os controles de prova; e
Ocasionalmente, em amostras que apresentam título elevado, o tubo da diluição 1:25 pode estar um pouco turvo na prova do 2-ME, ainda que os tubos subsequentes estejam claros. Isto não deve ser considerado como resultado negativo do teste.
Interpretação dos resultados
As interpretações baseiam-se no grau de turvação dos tubos e na firmeza dos grumos (aglutinação do antígeno), após agitação suave dos tubos;
O resultado de cada amostra será determinado pelo título sorológico encontrado nas provas de SAL e 2-ME. Esse título será correspondente ao inverso da maior diluição em que se observa reação de aglutinação; e
O grau de aglutinação em cada uma das distintas diluições deve ser classificado como: completo (+), incompleto (I) ou negativo (-):
Reação completa: é aquela em que o líquido da mistura soro/antígeno aparece translúcido, e a agitação suave não rompe os grumos;
Reação incompleta: é aquela em que a mistura soro/antígeno aparece parcialmente translúcida, e uma suave agitação não rompe os grumos; e
Reação negativa: é aquela em que a mistura soro/antígeno aparece opaca ou turva, e uma agitação suave não revela grumos.
A interpretação dos resultados da prova é realizada segundo os QUADROS 1 e 2.
QUADRO 1 - Interpretação da prova do 2-ME para fêmeas com idade igual ou superior a 24 (vinte e quatro) meses e vacinadas entre 3 (três) e 8 (oito) meses de idade.
2-ME SAL
NR
25 I
25
50 I
50
100 I
100
200 I
200
NR
-
25 I
-
-
25
-
-
+
50 I
-
-
+
+
50
-
-
+
+
+
100 I
-
-
+
+
+
+
100
Inc
Inc
+
+
+
+
+
200 I
Inc
Inc
+
+
+
+
+
+
200
Inc
Inc
+
+
+
+
+
+
+
(+): positivo; (-): negativo; SAL: Soroaglutinação Lenta; 2 ME: Teste do 2-Mercaptoetanol; NR: não reagente; I: Reação incompleta; Inc: reação inconclusiva; Área hachurada: Combinação teoricamente não esperada.
Fonte: BRASIL. MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO (2006).
QUADRO 2 - Interpretação da prova do 2-ME para fêmeas não vacinadas ou vacinadas com a vacina RB51 e machos com idade superior a 8 (oito) meses.
2-ME SAL
NR
25 I
25
50 I
50
100 I
100
200 I
200
NR
-
25 I
-
-
25
-
-
+
50 I
-
-
+
+
50
Inc
Inc
+
+
+
100 I
Inc
Inc
+
+
+
+
100
Inc
Inc
+
+
+
+
+
200 I
Inc
Inc
+
+
+
+
+
+
200
Inc
Inc
+
+
+
+
+
+
+
(+): positivo; (-): negativo; SAL: soroaglutinação Lenta; 2 ME: Teste do 2-Mercaptoetanol; NR: não reagente; I: reação incompleta; Inc: reação inconclusiva; Área hachurada: combinação não esperada teoricamente.
Fonte: BRASIL. MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO (2006).
Emissão dos resultados
Os resultados deverão ser emitidos e expressos como e expressos como “título (completo ou incompleto)”.
Descarte de Amostras e Resíduos
Anteriormente ao descarte de amostras e produtos de ensaio, deverão ser observados os prazos mínimos estabelecidos no item “Retenção de itens de ensaio”;
Anteriormente ao descarte de amostras e produtos de ensaio, deve ser realizado registro de descarte em formulário próprio e conferência;
Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos; e
O laboratório deve assegurar a biossegurança dos resíduos gerados, e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo o processo do descarte.
Retenção de itens de ensaio
Amostras de soro poderão ser descartados 60 dias após a emissão do relatório de ensaio.
Micropipetas monocanal de volumes reguláveis, ou de volumes fixos de 30 µL e 1000 µL;
Pipetador automático ou manual;
Cronômetros; e
Agitador de tubos tipo vórtex (opcional).
Insumos
Antígeno para a prova de TAL.
Soluções
Não aplicável.
Disposições gerais
As amostras de leite devem ser mantidas entre 2°C e 8ºC por pelo menos 24 horas antes da realização do TAL; e
Amostras que foram congeladas ou pasteurizadas não podem ser utilizadas.
Realização do ensaio
Deixar as amostras de leite e o antígeno à temperatura de 22ºC ± 4ºC por, aproximadamente, 60 (sessenta) minutos, ou até que as temperaturas do leite e do antígeno se equilibrem com a temperatura ambiente;
Homogeneizar as amostras e dispensar 1 mL em tubos de 10 mm x 100 mm, 10 mm x 75 mm ou equivalentes, de modo que a coluna de leite tenha, aproximadamente, 2 cm de altura. A quantidade de leite a ser utilizada no teste deve ser aumentada de acordo com o descrito no QUADRO 3;
Adicionar 30 μL de antígeno ao leite, tampar o tubo e homogeneizar até obter uma mistura homogênea do antígeno no leite; e
Incubar por 1 hora a 37°C ± 2°C e proceder à leitura.
QUADRO 3 - Quantidade de leite a ser utilizada no teste (TAL)
N° de animais
Volume de leite (em mL)
Até 150
1
151 a 450
2
451 a 700
3
Acima de 700
Dividir em lotes menores
Fonte: BRASIL. MINISTÉRIO DA AGRICULTURA e PECUÁRIA (2006).
Critérios de aceitação do Ensaio
De acordo com os resultados dos controles de prova:
Reagente: anel de gordura com coloração azulada igual ou maior que a coluna de leite; e
Não Reagente: coluna de leite com coloração azulada mais intensa que o anel de gordura.
Interpretação dos resultados
Amostra REAGENTE: anel de gordura com coloração azulada igual ou maior que a coluna de leite azulada; e
Amostra NÃO REAGENTE: coluna de leite com coloração azulada mais intensa que o anel de gordura.
Emissão dos resultados
Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “REAGENTE”, “NÃO REAGENTE”, ou de acordo com o preconizado com o fabricante do insumo (kit de diagnóstico).
Descarte de Amostras e Resíduos
Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos; e
O laboratório deve assegurar a biossegurança dos resíduos gerados, e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo o processo do descarte.
Retenção de itens de ensaio
Descartar das amostras após a realização do ensaio.
Papel milimetrado (log/log ou log/probability) – opcional;
Papel milimetrado;
Caneta para identificação de vidraria; e
Cubas para descarte de materiais.
Equipamentos e instrumentos
Geladeira;
Estufa;
Termômetros;
Micropipetas monocanal e multicanal para 25 μL;
Pipetador automático ou manual;
Cronômetros;
Agitador de tubos tipo vórtex (opcional);
Agitador de microplacas; e
Espelho para leitura de microplacas (opcional).
Insumos
Antígeno para diagnóstico da brucelose pela prova de soroaglutinação lenta (Ag);
Controle Positivo Baixo (CL);
Controle Negativo (CN);
Padrão de Cianometahemoglobina (CMH);
Hemácia de Carneiro;
Complemento de cobaio; e
Hemolisina (procedência: coelho).
Soluções
Solução de Alséver ou ACD;
Solução de Drabkin (SD);
Tampão Veronal (1X) ou Trietanolamina;
Suspenção de eritrócitos; e
Tampão Veronal 5X (20,3g de MgCl2, 3,32g de CaCl2, 340g de NaCl, 15g de Barbiturato de sódio, 23g de Barbital e 8000 mL de água destilada).
Realização do ensaio
Tratamento das amostras do ensaio e soros controle
Inativar as amostras que serão analisadas no ensaio e os soros controle, em banho-maria por 30 minutos, a temperatura de 58°C ± 1°C para amostras de soro bovino e 62,5 ºC ± 1°C para amostras de soro bubalino;
Após o período de inativação, se as amostras forem imediatamente testadas podem ser mantidas à temperatura ambiente ou à temperatura de refrigeração (2°C a 8°C);
As amostras inativadas podem permanecer sob refrigeração (2º a 8º C) por no máximo 24h. Após este período devem ser congeladas em temperatura máxima de -20°C;
As amostras do ensaio e soros controle devem ser diluídos em Solução de Trabalho que consiste em 100 mL de tampão veronal 5x concentrado, 395 mL de água destilada, e 5mL de gelatina solúvel 10%, na proporção de 1:10;
Manter, preferencialmente, os reagentes em banho de gelo durante os procedimentos de titulação e execução do ensaio; e
A solução de complemento e o complemento deverão ser mantidos em banho de gelo durante todo período de ensaio ou titulação.
Determinação da densidade óptica (DO) alvo
I. Método da cianometahemoglobina
Neste método, a Hb é convertida em cianometahemoglobina (mais estável), por diluição em RC resultando em um padrão que é utilizado para ajustar o volume celular da suspensão de eritrócitos.; e
Para uma suspensão de eritrócitos a 3%, diluída 1:16, tem-se 60 mg de Hb/dL.
II. Cálculo do fator de calibração
Preparar uma solução padrão de hemoglobina (Hb) contendo 60 mg/dL em 5 mL de RC;
Homogeneizar e aguardar 5 minutos; e
Ler a densidade ótica (DO), em 540 nm, usando RC como branco em aparelho espectrofotômetro. A leitura corresponde à DO alvo.
Lavagem da suspensão de eritrócitos
Coletar aproximadamente 50 mL de sangue de carneiro em 12,5 mL de solução de ACD ou volume correspondente (50 mL) de Alsever;
Armazenar o sangue coletado por uma semana sob refrigeração (2ºC a 8ºC). Descartar caso apresente sinais de contaminação ou hemólise excessiva;
Filtrar volume de suspensão de eritrócitos suficiente para a realização das provas. Sugere-se 5 mL a 10 mL, conservados em ACD ou Alsever, em um filtro delgado de gaze e algodão, para um tubo cônico de centrífuga de 50 mL;
Adicionar volume proporcional de tampão de uso perfazendo uma diluição final de 1:5 (aproximadamente 40 mL);
Sedimentar os eritrócitos por centrifugação. Sugere-se centrifugar a 1500 x g por 10 minutos;
Descartar o sobrenadante e retirar a fina camada de células brancas que se deposita sobre os eritrócitos sedimentados;
Repetir o processo de lavagem 2 vezes;
Descartar o sobrenadante; e
Ressuspender o volume de eritrócitos obtido, em volume 25 vezes maior de tampão de uso, a fim de produzir uma suspensão a aproximadamente 4%. Exemplo de cálculo no QUADRO 4.
QUADRO 4 - Exemplo de cálculo de suspensão a 4% para volume celular obtido de 3,5 mL
1 mL de ER ------------- 25 mL de tampão de uso
3,5 mLde ER obtido ----- X mL de tampão de uso
X = 87,5 mL, de tampão de uso.
Fonte: LFDA-MG
Padronização da suspensão de eritrócitos a 3% volume celular (vc)
Romper 0,5 mL da suspensão de eritrócitos preparada anteriormente em 7,5 mL de RC, obtendo-se uma solução final 1:16;
Ler a DO em 540 nm usando RC como branco;
Calcular a porcentagem de eritrócitos presente nesta suspensão considerando que a DO alvo possui 3% de eritrócitos;
Se necessário, ajustar o volume final adicionando ou retirando tampão de uso da suspensão quando ela apresentar volume celular maior ou menor que 3%, respectivamente, de acordo com a fórmula abaixo;
Romper 0,5 mL da suspensão de eritrócitos padronizada a 3% de células em 7,5 mL de RC (1:16);
Ler a DO em 540 nm, usando RC como branco;
Calcular a porcentagem de eritrócitos presente nesta suspensão considerando que a DO alvo possui 3% de eritrócitos;
Caso os valores não sejam correspondentes, repetir os procedimentos até obter uma suspensão a 3% vc;
Esta é a DO a ser utilizada na rotina (100% de hemólise); e,
A suspensão de eritrócitos padronizada, se estocada sob refrigeração, poderá ser usada por até 72 horas após preparo, desde que não haja evidência de lise.
Fórmula do item 4
C1 x V1 = C2 x V2
C1= DO da suspensão de eritrócitos inicialmente preparada;
V1= volume total da suspensão inicialmente preparada;
C2=DO alvo (60mg/dL);
V2= volume final para obtenção de uma suspensão com 3% de eritrócitos.
Titulação da HL
Titular a HL a cada novo lote;
Preparar uma suspensão de eritrócitos padronizada a 3 % vc;
Preparar uma diluição inicial de HL 1:10 para um volume final de 3 mL;
Preparar 10 mL de uma solução de HL 1:100 (1 mL de HL 1:10 + 9 mL de tampão de uso). Pode-se diluir a HL 1:100 em alíquotas e estocá-las congeladas;
Escolher 9 diluições da HL de acordo com o QUADRO 5. As diluições indicadas são apenas sugestões e podem variar de acordo com a atividade do lote de HL utilizado;
Identificar uma série de 9 tubos com as diferentes diluições de HL que serão utilizadas;
Colocar 1 mL de eritrócitos (ER) padronizados a 3 % em cada um dos tubos;
Adicionar 1 mL de cada diluição de HL no respectivo tubo, formando o SH;
Homogeneizar os tubos e incubá-los em banho-maria a 37 ºC ± 2 ºC por 15 minutos, com agitação a cada 5 minutos;
Preparar uma diluição inicial de C' 1:10 para um volume final de 3 mL (300 μL de C' + 2,7 mL de tampão de uso);
Escolher 3 diluições do C' de acordo com o QUADRO 6. As diluições indicadas são apenas sugestões e podem variar de acordo com a atividade do lote de C' utilizado;
Preparar 3 séries de tubos correspondentes às diluições do complemento que serão utilizadas, de modo que este produza 70 % a 80 % de hemólise com a diluição de HL mais concentrada;
Identificar os tubos de cada série de acordo com as diluições de HL e C' utilizadas;
Adicionar 1 mL de tampão de uso e 0,5 mL de cada C' diluído;
Transferir 0,5 mL do sistema hemolítico (SH) de cada diluição da HL para cada tubo das 3 séries contendo C' e tampão de uso, e homogeneizar;
Incubar em banho-maria a 37 ºC ± 2 ºC por 30 minutos, com agitação aos 15 minutos;
Retirar os tubos do banho-maria e adicionar 2 mL de tampão de uso gelado, a temperatura de 2 ºC a 8 ºC em cada um deles para ajustar o volume para leitura no espectrofotômetro;
Centrifugar a aproximadamente 1.500 x g por 10 minutos, para depositar qualquer eritrócito remanescente não lisado;
Determinar a absorbância de cada um dos tubos no comprimento de onda de 540 nm, utilizando água destilada como branco;
Calcular a porcentagem de hemólise em cada tubo comparando os resultados obtidos acima com o tubo contendo 100 % de hemólise;
Usar como valor de 100 % de hemólise a DO da solução obtida lisando 0,5 mL da suspensão de eritrócitos padronizada a 3 % vc em 7,5 mL de água destilada;
Plotar a porcentagem de hemólise x diluição da hemolisina em papel milimetrado com escala aritmética;
Para calibrar a abscissa, medir uma distância arbitrária (por exemplo, 20 cm), com divisões em escala de 10, a partir da extremidade esquerda e colocar aí um ponto representando a diluição de HL 1:500. Isso forma a extremidade final direita da abscissa. As distâncias representando as outras diluições são calculadas dividindo 500 pela diluição recíproca e multiplicando o resultado pelo comprimento da abscissa (no caso, 20 cm). A porcentagem de hemólise é marcada linearmente ao longo da ordenada, com a distância entre os pontos de 1cm;
Ligar os pontos do gráfico ignorando os outliers;
Determinar o ponto do gráfico no qual se inicia o platô; e
Interpretação dos resultados
Os resultados da titulação serão considerados satisfatórios se o referido platô estiver entre 30 % e 80 % de hemólise;
Para os testes, usar uma diluição acima do ponto onde se inicia o platô ou, no mínimo, 25% mais concentrada que a diluição supracitada; e
A quantidade de HL utilizada no teste não é crítica, ao contrário da quantidade de amostra. Um excesso de HL não afeta a sensibilidade do teste significativamente. Diluições muito baixas de HL, podem provocar aglutinação dos eritrócitos.
QUADRO 5 - Diluições da HL
Diluições da HL
HL 1:10 (mL)
HL 1:100 (mL)
HL 1:1.000 (mL)
Tampão de uso (mL)
Volume final (mL)
1:100
1,0
-----
-----
9,0
10,0
1:250
-----
1,2
-----
1,8
3,0
1:300
-----
1,0
-----
2,0
3,0
1:500
-----
1,0
-----
4,0
5,0
1:750
-----
1,5
-----
3,5
5,0
1:1.000
-----
1,0
-----
9,0
10,0
1:1.500
-----
0,2
-----
2,8
3,0
1:2.000
-----
-----
1,0
1,0
2,0
1:3.000
-----
-----
1,0
2,0
3,0
1:5.000
-----
-----
1,0
4,0
5,0
1:10.000
-----
-----
1,0
9,0
10,0
Fonte: LFDA/MG, adaptado de Alton et al. (1988).
QUADRO 6 - Diluições do C' para titulação da HL
Diluições do C'
C' 1:10 (μL)
Tampão de uso (mL)
Volume final (mL)
1:150
400
5,60
6,0
1:200
300
5,70
6,0
1:250
240
5,76
6,0
1:300
200
5,80
6,0
1:350
171
5,83
6,0
1:400
150
5,85
6,0
Fonte: LFDA/MG, adaptado de Alton et al. (1988).
Sensibilização dos eritrócitos
Preparar uma suspensão de eritrócitos padronizada a 3 % vc;
Diluir a HL de acordo com o título encontrado para a prova;
Misturar partes iguais desses dois componentes; e
Incubar em banho-maria a 37 ºC ± 2 ºC por 15 minutos, com agitação a cada 5 minutos.
Titulação do Complemento (C’)
Titular o C’ a cada novo lote ou quando houver suspeita de degradação do mesmo;
Preparar uma suspensão de eritrócitos padronizada a 3 % vc;
Diluir a HL, de acordo com o título encontrado para a prova, em um volume final de 5 mL e sensibilizar os eritrócitos;
Preparar uma diluição inicial de C’ 1:10 para um volume final de 2 mL;
Escolher 3 diluições do C’ de acordo com o QUADRO 7 (As diluições indicadas são apenas sugestões e podem variar de acordo com a atividade do lote de C’ utilizado);
Identificar três séries de tubos, sendo uma série para cada diluição do C’. Cada série deverá conter 6 tubos identificados com os volumes de C’ a seguir: 0,3 mL; 0,4 mL; 0,5 mL; 0,6 mL; 0,7 mL e 0,8 mL;
Distribuir e incubar os reagentes de acordo com o QUADRO 8;
Após incubação final, adicionar 2 mL de tampão de uso gelado, entre 2 ºC e 8 ºC, em cada tubo e centrifugar a 1500 x g por 10 minutos para deposição de qualquer eritrócito não lisado;
Determinar a absorbância de cada um dos tubos no comprimento de onda de 540 nm, utilizando água destilada como branco;
Calcular a porcentagem de hemólise em cada tubo comparando os resultados obtidos com o tubo contendo 100 % de hemólise;
Usar como valor de 100 % de hemólise a DO da solução obtida lisando 0,5 mL da suspensão de eritrócitos padronizada a 3 % vc em 7,5 mL de água destilada;
Caso seja utilizado papel milimetrado com escala dilog, determinar o índice de hemólise (IH) através da fórmula descrita no QUADRO 9;
Plotar o volume de C’ (ordenadas) x % de hemólise (abscissas) em papel milimetrado log x probability ou o volume de C’ (ordenadas) x IH (abscissas) em papel milimetrado dilog;
Considerar somente os tubos que apresentarem valores entre 10 % e 90 % de hemólise;
O gráfico será válido quando dois pontos estiverem à esquerda do valor correspondente a 50 % de hemólise e dois pontos à direita deste valor;
Determinar os pontos médios entre os dois valores acima de 50 % de hemólise e os dois valores abaixo. Uni-los em uma linha reta;
Traçar uma reta perpendicular ao eixo das abscissas ligando os pontos 50 % de hemólise (abscissas) e o gráfico obtido acima;
Determinar o valor correspondente a este ponto nas ordenadas. Este é o volume 1 C’H50 (volume de C’ diluído capaz de lisar 50 % de eritrócitos sensibilizados);
Determinar a diluição de uso (DU) do complemento através da fórmula descrita no QUADRO 10; e
Determinar a inclinação da reta (tangente do ângulo ou coeficiente angular da reta) encontrada na titulação do complemento. A partir de qualquer ponto próximo a extremidade esquerda do gráfico, traçar uma reta de 10 cm de comprimento paralela às abscissas. Medir a distância, em mm, entre esta e o gráfico;
Quando se utilizar papel log x probability este valor deve corresponder a 44 mm ± 20 % e, para papel dilog o valor encontrado deve ser de 20 mm ± 10 %; e
Valores de inclinação fora dos limites estabelecidos não interferem nos testes diagnósticos, no entanto, obtém-se maior reprodutibilidade e repetitividade de resultados quando os critérios acima citados forem atendidos.
QUADRO 7 - Diluições do Complemento (C’)
Diluições do C’
C’ 1:10 (μL)
Tampão de uso (mL)
Volume final (mL)
1:150
400
5,60
6,0
1:200
300
5,70
6,0
1:250
240
5,76
6,0
1:300
200
5,80
6,0
1:350
171
5,83
6,0
1:400
150
5,85
6,0
1:450
133
5,86
6,0
Fonte: LFDA-MG, adaptado de Alton et al. (1988)
QUADRO 8 - Diluições dos reagentes para titulação do C’
Reagentes (mL)
Tubos
01
02
03
04
05
06
C’ diluído
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
Tampão de uso
1,2
1,1
1,0
0,9
0,8
0,7
Incubar em banho-maria a 37 ºC + 2 ºC / 30 minutos.
ER Sensibilizados
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
Incubar em banho-maria a 37 ºC + 2 ºC / 30 minutos com agitação aos 15 minutos
Fonte: LFDA-MG, adaptado de Alton et al. (1988).
QUADRO 9 - Determinação do índice de hemólise
IH = % de hemólise do tubo / (100 - % de hemólise do tubo)
Fonte: LFDA-MG, adaptado de Alton et al. (1988).
QUADRO 10 - Determinação da diluição de uso (DU) do complemento
DU = (0,5 x diluição utilizada na titulação) / 5CH50 da Titulação
Fonte: LFDA-MG, adaptado de Alton et al. (1988).
Titulação do Ag
Realizar a titulação em microvolumes, em placas de microtitulação com 96 orifícios;
Titular o antígeno sempre que um novo lote for utilizado;
Escolher um soro de título baixo a moderado (de preferência entre 1:50 e 1:100 nas provas de aglutinação, ou 1:16 a 1:32) e diluí-lo a 1:2 (300 µL de soro + 300 µL de tampão de uso);
Inativá-lo em banho-maria a 58 ºC ± 2 ºC por 30 minutos;
Preparar uma suspensão de eritrócitos padronizada a 3 % vc;
Diluir a HL de acordo com o título encontrado para a prova, em um volume final de 3 mL e sensibilizar os eritrócitos;
Preparar as diluições do antígeno para SAL de acordo com o QUADRO 11;
Preparar uma diluição do complemento 5 C’H50, de acordo com o título recomendado para uso em prova e diluí-la para 2,5 C’H50 e 1,25 C’H50;
Recomenda-se preparar 3 mL da diluição 5 C’H50 e 0,5 mL das demais;
Distribuir 25 µL de tampão de uso em todas os orifícios, exceto nos sombreados, de acordo com o QUADRO 12;
Colocar 25 µL de soro inativado e diluído a 1:2 nas colunas 01 e 02, da linha A até a H;
Com pipetador multicanal, diluir o soro em diluições duplas a partir da coluna 02 até a coluna 07, nas linhas A até G, desprezando os 25 µL restantes. A linha H deverá conter apenas as diluições 1:2 e 1:4. Desprezar os 25 µL restantes do orifício 2H;
As colunas 10, 11 e 12 recebem mais 25 µL de tampão de uso, em lugar do soro, para detectar atividade anticomplementar do Ag;
Colocar 25 µL de antígeno, nas respectivas diluições, nas linhas A até G, nas colunas 01 até 07 e 10 a 12;
Os dois primeiros orifícios da linha H recebem mais 25 µL de tampão de uso, em lugar do antígeno, para detectar atividade anticomplementar do soro;
Colocar 25 µL de C’ contendo 5 C’H50 em todas os orifícios contendo soro e, também, na coluna 10, da linha A até a linha G, para controle anticomplementar do Ag;
Colocar 25 µL de C’ contendo 2,5 C’H50 e 1,25 C’H50 nas colunas 11 e 12, respectivamente, da linha A até a linha G;
Agitar a placa por um minuto e incubá-la tampada, a 37 ºC ± 2 ºC por 30 minutos;
Preparar padrões de cor com 0 %, 25 %, 50 %, 75 % e 100 % de hemólise e distribuir 100 µL de cada um na coluna 08;
Adicionar 25 µL de eritrócitos sensibilizados em todos os orifícios, exceto os da coluna 08. Agitar a placa por um minuto e incubá-la, tampada, a 37 ºC ± 2 ºC por 30 minutos com agitação aos 15 minutos;
Centrifugar a placa a no máximo 900 x g por 10 minutos;
Fazer a leitura observando o grau de hemólise de cada cavidade;
Determinar a diluição do antígeno com a qual se obtém o maior título do soro. A diluição mais sensível do antígeno é aquela que produz um nível máximo de fixação do C’ com o antissoro específico;
No teste, o antígeno é usado com o dobro da concentração ótima para reduzir a ocorrência de prozona;
A diluição do antígeno escolhida deve mostrar 100 % de hemólise com 5 C’H50 e 2,5 C’H50 e, no mínimo, 50 % de hemólise com 1,25C’H50; e
No controle anticomplementar do soro, os eritrócitos deverão estar completamente lisados.
QUADRO 11 - Diluições do Ag
Diluições
Ag (µL)
Ag 1:100 (µL)
Tampão de uso (mL)
Volume final (mL)
1:100
100
-----
9,90
10,0
1:200
-----
1000
1,00
2,0
1:300
-----
600
1,40
2,0
1:400
-----
500
1,50
2,0
1:600
-----
500
2,50
3,0
1:800
-----
500
3,50
4,0
1:1.200
-----
300
3,70
4,0
Fonte: LFDA-MG, adaptado de Alton et al. (1988)
QUADRO 12 - Esquema de distribuição dos reagentes na placa de microtitulação
Linhas
Diluições
do Ag
Colunas
01
02
03
04
05
06
07
08
10
11
12
Diluições do soro
PC
CAC Ag / C’H50
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
1:64
1:128
5,0
2,5
1,25
A
1:100
00
B
1:200
25
C
1:300
50
D
1:400
75
E
1:600
100
F
1:800
G
1:1200
H
CAC S
CAC S: controle anticomplementar do soro; PC: padrões de cor; CAC Ag: controle anticomplementar do antígeno; Coluna 09: não é utilizada
Fonte: LFDA-MG, adaptado de Alton et al. (1988)
Preparo dos padrões de cor (PC)
Os padrões de cor simulam diferentes graus de hemólise. São usados como um modelo para comparação na leitura do teste;
Preparar uma suspensão de eritrócitos (SE), contendo 0 % de hemólise, diluindo 1 mL da suspensão de eritrócitos padronizada a 3 % em 7 mL de tampão de uso;
Preparar uma solução de hemoglobina (SH) 100 % de hemólise, rompendo 1 mL da suspensão de eritrócitos padronizada a 3 % em 5,6 mL em água destilada. Agitar até que todas as células sejam lisadas. Adicionar 1,4 mL de tampão veronal 5x concentrado para restabelecer a isotonicidade da solução. Não inverter a ordem da mistura de reagentes; e
Preparar os demais padrões de hemólise misturando volumes proporcionais da SE com a SH como mostrado no QUADRO 13.
QUADRO 13 - Preparo dos Padrões de Cor
Reagentes (mL)
Porcentagem de hemólise
00
25
50
75
100
ER 3 % vc
1,0
---
---
---
1,0
Água destilada
---
---
---
---
5,6
Tampão veronal 5x
---
---
---
---
1,4
Tampão de uso
7,0
---
---
---
---
SE
---
0,75
0,50
0,25
---
SH
---
0,25
0,50
0,75
---
Fonte: LFDA-MG, adaptado de Alton et al. (1988)
Execução da prova de FC (microtécnica)
Preparar uma suspensão de eritrócitos com 3 % de volume celular;
Preparar uma solução de HL para a prova;
Sensibilizar os eritrócitos;
Preparar uma solução de C’ para a prova;
Preparar uma suspensão de Ag para a prova;
Preparar PC (padrão de cor) com 0 %, 25 %, 50 %, 75 % e 100 % de hemólise;
Diluir as amostras de soro em teste a 1:2 (60 μL de soro + 60 μL de tampão de uso);
Incubar as amostras de soro diluídas a 1:2 em banho-maria a 58 ºC ± 2 ºC por 30 minutos para inativar o complemento natural do soro e também as IgM (imunoglobulinas M);
Identificar a(s) placa(s) reservando a linha H para o controle anticomplementar do soro (CAC S) e a coluna 12 para os PC;
Reservar duas colunas de uma das placas para os soros controles, sendo uma para o soro controle positivo (de título médio) e outra para o soro controle negativo;
Distribuir 25 µL de tampão de uso em todas os orifícios, exceto nos sombreados, de acordo com o QUADRO 14;
Distribuir 25 µL dos soros diluídos a 1:2 e inativados nos orifícios das linhas A, B e H das colunas 01 até 11, sendo que cada coluna corresponde a um soro;
Na linha B, homogeneizar o soro e o tampão de uso com auxílio de um micropipetador multicanal e transferir 25 µL desta solução para a linha C. Repetir este procedimento até a linha G, diluindo o soro a 1:4 até a 1:128. Descartar os 25 µL restantes;
Distribuir 25 µL de antígeno diluído em cada orifício das colunas 01 até 11, exceto na linha H;
Distribuir 25 µL de C’ 5 C’H50 em todos os orifícios das colunas 01 até 11;
Agitar a placa por um minuto em agitador de microplaca;
Incubar a placa tampada em estufa a 37 ºC ± 2 ºC por 30 minutos;
Distribuir 25 µL de suspensão de eritrócitos sensibilizados (ES), em todos os orifícios das colunas 01 até 11, inclusive na linha H;
Distribuir 100 µL de cada padrão de cor na coluna12;
Agitar a placa por um minuto em agitador de microplaca;
Incubar em estufa a 37 ºC ± 2 ºC por 30 minutos, com agitação aos 15 minutos;
Centrifugar a microplaca a 900 x g por 5minutos;
Fazer a leitura observando o grau de hemólise, o tamanho e a espessura dos botões de eritrócitos em cada cavidade, comparando os resultados dos soros em teste com os padrões de cor da coluna 12 do QUADRO 14.
QUADRO 14 - Esquema de distribuição dos reagentes na placa de microtitulação
Linhas
Diluições
do Soro
Colunas
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
Amostras
PC
A
1:2
00
B
1:4
25
C
1:8
50
D
1:16
75
E
1:32
100
F
1:64
G
1:128
H
CAC S
CAC S: controle anticomplementar do soro; PC: padrões de cor.
Fonte: LFDA-MG, adaptado de Alton et al. (1988).
Controles
I. Controle do C’
Deve ser realizado em macrovolumes, em paralelo com a prova;
Distribuir 700 µL de tampão de uso em 04 tubos;
Distribuir 50 µL de C´ 5 CH50 em cada um dos tubos;
Incubar em banho-maria a 37 ºC ± 2 ºC por 30 minutos;
Adicionar 250 µL da suspensão de ES em cada tubo;
Incubar em banho-maria a 37 ºC ± 2 ºC por 30 minutos, com agitação aos 15 minutos;
Adicionar 1 mL de tampão de uso gelado, a temperatura entre 2 ºC e 8 ºC, em cada tubo e centrifugar a aproximadamente 1500 x g por 10 minutos e determinar a DO em cada tubo;
Calcular a porcentagem de hemólise em cada tubo comparando os resultados obtidos com o tubo contendo 100 % de hemólise e determinar a média;
Usar como valor de 100 % de hemólise a DO da solução obtida lisando 0,5 mL da suspensão de eritrócitos padronizada a 3 % vc em 7,5 mL de água destilada; e
Calcular a absorbância média dos 04 tubos. O teste será considerado válido se o valor encontrado variar entre 25 % e 75 % de hemólise.
II. Controle de reagentes
Poderá ser realizado alternativamente ao controle do C’. É realizado em microvolumes, juntamente com o teste;
Reservar a coluna 11 e o orifício 12 H para este controle; e
Distribuir os reagentes e realizar a leitura conforme QUADRO 15.
QUADRO 15 - Controle de reagentes
Orifício
Controle
Tampão
de uso (L)
Ag(L)
C’(L)
ES(L)
ER(L)
Resultados esperados
11
A
5 CH50
25
25
25
25
---
0
B
2,5 CH50
25
25
25
25
---
Traços
C
1,25 CH50
25
25
25
25
---
+1 à +2
D
5 CH50 + ES
50
---
25
25
---
0
E
Ag + ES
50
25
---
25
---
+4
F
5 CH50 + ER (1:2)
50
---
25
---
25
+4
G
Ag + ER (1:2)
50
25
---
---
25
+4
H
ER (1:2)
75
---
---
---
25
+4
12
H
ES
75
---
---
25
---
+4
Fonte: LFDA-MG, adaptado de Alton et al. (1988)
Critérios de aceitação do Ensaio
A prova será considerada válida se todos os controles derem os resultados esperados;
Se um dos controles falhar e os demais derem os resultados esperados, deve-se realizar análise crítica dos resultados para julgar a validade ou não da prova;
Se todo o C’ fixou durante o primeiro estágio, não haverá hemólise e isso significa que o soro em teste contém Ac anti - brucela e, então, é positivo;
Se ocorrer lise dos eritrócitos significa que o C’ não foi fixado no primeiro estágio, pois o soro teste não continha Ac anti - brucela e, então, énegativo;
A interpretação dos resultados é baseada no percentual de hemólise dos eritrócitos sensibilizados, comparado ao padrão de cor;
O percentual de hemólise é baseado no tamanho do botão de hemácias, na cor do sobrenadante e na espessura do botão, nesta ordem de importância;
Orifícios com botões grandes têm menos hemólise e, então, maior escore. Se o sobrenadante de um orifício é escuro, mais hemólise ocorreu e o escore é menor. Se o botão é compacto, menos hemólise ocorreu e o escore é maior; e
No controle anticomplementar do soro, os eritrócitos deverão estar completamente lisados.
Interpretação dos resultados
A prova será considerada válida se todos os controles apresentarem resultados esperados;
Se um dos controles falhar e os demais apresentarem os resultados esperados pode ser realizada análise crítica dos resultados para julgar a validade ou não da prova;
Se dois dos controles apresentarem resultados não esperados, invalidar e repetir a prova, após análise da causa dos fatos ocorridos;
Se todo o C’ fixou durante o primeiro estágio, não haverá hemólise e isso significa que o soro em teste contém Ac anti - brucela e, então, é positivo;
Se ocorrer lise dos eritrócitos significa que o C’ não foi fixado no primeiro estágio, pois o soro teste não continha Ac anti - brucela e, então, é negativo; e
A interpretação dos resultados é baseada no percentual de hemólise dos eritrócitos sensibilizados, comparado ao padrão de cor, conforme QUADRO 16.
QUADRO 16 - Interpretação da prova de Fixação de Complemento (por poço)
% de Hemólise
% Fixação de Complemento
Resultado no Orifício
Escore
00
100
Reagente
+4
25
75
Reagente
+3
50
50
Reagente
+2
75
25
Reagente
+1
75 a 100
00 a 25
Não Reagente
T (traços)
100
00
Não Reagente
0
Fonte: LFDA-MG, adaptado de Alton et al. (1988)
Emissão dos resultados
Os resultados deverão ser emitidos e expressos como e expressos como “REAGENTE”, “NÃO REAGENTE”, ou de acordo com o preconizado pelo fabricante do insumo (kit de diagnóstico).
Descarte de Amostras e Resíduos
Anteriormente ao descarte de amostras e produtos de ensaio, deverão ser observados os prazos mínimos estabelecidos no item “Retenção de itens de Ensaio”; anteriormente ao descarte de amostras e produtos de ensaio, deve ser realizado registro de descarte em formulário próprio e conferência;
Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos; e
O laboratório deve assegurar a biossegurança dos resíduos gerados, e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo o processo do descarte.
Retenção de itens de ensaio
Soros sanguíneos poderão ser descartados 60 dias após a emissão do relatório de ensaio.
Placas de Petri de aproximadamente 9,5 mm de diâmetro;
Sacos plásticos para homogeneizador tipo Stomacher;
Suabe estéril;
Tubos de ensaio de 13 mm x 75 mm e 18 mm x 180 mm; e
Grades para tubos de ensaio.
Equipamentos e instrumentos
Banho-maria a 56 ºC;
Cabine de Segurança Biológica (CSB), Classe A Tipo II (requisito mínimo);
Centrífuga refrigerada;
Espectrofotômetro;
Estufa a 37 ºC ± 2 ºC;
Estufa a 37 ºC ± 2 ºC com 5% a 10% de CO2;
Macropipetadores;
Micropipetadores de volumes de 20 µL, 100 µL e 1000 µL;
Microscópio óptico;
Microscópio estereoscópico;
Homogeneizador tipo Stomacher;
Geladeira; e
Autoclave.
Insumos
Água destilada;
Coloração de Lâminas pelo Método de Gram;
Produção de fagos Tb;
Meio SIM;
Ágar sangue de carneiro desfibrinado;
Ágar triptose;
Ágar uréia de Christensen;
Meio nitrato;
Caldo tioglicolato;
Meio de gelatina (12%) nutritivo para punção;
Ágar nutriente com extrato de levedura;
Ágar triptose com corantes (tionina, fucsina básica e safranina O);
Ágar triptose com 5% de soro;
Ágar triptose com suplemento seletivo Farrel e 5% de soro;
Fitas de acetato de chumbo;
Ágar triptose com Eritritol;
Ágar triptose com penicilina;
Ágar MacConkey;
N’N’N’N’Tetrametil-p-fenileno;
Etanol 95 ºGL;
Reativo de Kovac´s;
Ágar citrato de Simmon’s; e
Ágar vermelho de fenol com Glicose a 1%.
Soluções
Solução de cristal de violeta (bateria de GRAM);
Solução de cristal violeta 1:40 para teste de dissociação;
Solução salina 0,5% peptonada a 1%;
Solução salina 0,85%;
Solução salina fenicada;
Solução de ácido sulfanílico 0,8% em ácido acético 5 mol/L;
Solução de alfa-naftilamina 0,5% em ácido acético 5 mol/L;
Solução de acriflavina 1:10.000;
Solução de safranina 0,25%;
Solução de lugol; e
Álcool etílico 95 º INPM.
Realização do ensaio
A) Disposições gerais
Todas as etapas deste ensaio deverão ser realizadas em CSB Classe A Tipo II (requisito mínimo) e atender as recomendações do nível 3 de Biossegurança;
As amostras não devem ser congeladas e descongeladas repetidas vezes pelo risco de reduzir drasticamente a viabilidade das células bacterianas; e
Os testes para tipificação deverão ser feitos o quanto antes, após o isolamento inicial, pois algumas culturas são instáveis e podem tornar-se dissociadas ou inviáveis após vários repiques.
B) Isolamento de bactérias do gênero Brucella
a) Isolamento primário
As amostras deverão ser descongeladas sob refrigeração overnight ou em temperatura ambiente quando forem processadas no mesmo dia.
I. Meios de cultura e reagentes
Ágar triptose com 5% de soro;
Ágar triptose com 5% de soro e suplemento seletivo Farrel;
Salina 0,85%; ou
Salina 0,85% peptonada 1%.
II. Leite
Centrifugar entre 6.000 x g e 7.000 x g por 15 minutos, sob refrigeração;
Descartar a fase intermediária em um recipiente com solução desinfetante;
Misturar o sobrenadante e o depósito com um suabe estéril ou alça bacteriológica;
Estriar a mistura em placas com os meios de cultura citados acima; e
Incubar as placas invertidas a 37 ºC ± 2 ºC por até 14 dias em atmosfera contendo 5% a 10% de CO2.
III. Suabe vaginal, uterino ou retal
Estriar o suabe diretamente em placas com os meios de cultura citados acima; e
Incubar as placas invertidas a 37 ºC ± 2 ºC por até 14 dias em atmosfera contendo 5% a 10% de CO2.
IV. Tecidos sólidos
Remover a gordura da amostra;
Cortar o tecido em pequenos pedaços de aproximadamente 2 cm, usando instrumental esterilizado;
Colocar os pedaços em um saco de stomacher e adicionar um volume de salina peptonada correspondente a aproximadamente duas vezes o volume do material;
Processar no stomacher durante 2 a 3 minutos;
Inocular o material processado em, pelo menos, uma das placas contendo ágar triptose com 5 % de soro e ágar triptose com Farrel; e
Incubar as placas invertidas a 37 ºC ± 2 ºC por até 14 dias em atmosfera contendo 5% a 10% de CO2.
V. Interpretação de resultados
As colônias de brucela podem ser visualizadas na superfície do ágar a partir do 3º ou 4º dia de incubação. Eventualmente, podem ser identificadas após 48 horas de incubação;
São arredondadas, brilhantes, convexas, branco-pérola, com margens lisas e com 1 a 2 mm de diâmetro. Quando as placas são colocadas contra a luz, as colônias apresentam-se transparentes e com característica cor de mel;
No isolamento primário, as colônias podem apresentar uma forma atípica devido à distorção pelos glóbulos de gordura ou fragmentos de tecido deixados no meio; e
Uma minuciosa procura nas placas deve ser feita, pois, frequentemente, pode aparecer apenas uma pequena colônia do microrganismo.
b) Isolamento secundário
No caso de placa muito contaminada ou de colônias muito próximas, repicar as colônias características em placas contendo ágar triptose com 5% de soro e/ou ágar triptose com suplemento seletivo;
Incubar as placas invertidas a 37 ºC ± 2 ºC por até 4 dias em atmosfera contendo 5% a 10% de CO2; e
Verificar o crescimento diariamente, pois as colônias podem crescer antes deste período.
c)Seleção de colônias características
Selecionar pelo menos 3 colônias características;
Repicar as colônias em ágar triptose com 5 % de soro e incubá-las a 37 ºC ± 2 ºC por até 4 dias em atmosfera contendo 5 % a 10 % de CO2 para produção de massa bacteriana;
Recolher a massa e ressuspender em aproximadamente 1 mL de salina estéril 0,85%; e
Inativar em banho–maria à 65°C por 1 hora para serem enviadas à identificação por reação em cadeia da polimerase (PCR). Outra parte da massa bacteriana não inativada será recolhida e armazenada em freezer para posterior identificação bioquímica.
C) Características morfo-tintoriais (Gram)
Disposições gerais
Utilizar lâminas limpas, secas e desengorduradas;
Usar luvas para evitar contato direto da pele com os corantes;
Em caso de fixação do material em chama, aquecer a lâmina somente até o ponto em que o calor seja suportável ao contato com a pele;
Não colocar a lâmina diretamente sobre a chama; e
Evitar confecção de esfregaços muito espessos.
Realização do Ensaio
a) Preparo do esfregaço
I. Culturas em meio sólido
Instilar uma gota de salina 0,85% sobre uma lâmina limpa, seca e desengordurada;
Com auxílio de uma alça bacteriológica, coletar uma pequena amostra do cultivo a ser examinado; e
Misturar o cultivo com a salina e espalhar, com movimentos suaves, sobre a superfície da lâmina.
II. Culturas em meio líquido
Coletar uma alçada do material a ser observado diretamente do cultivo; e
Espalhar o cultivo, com movimentos suaves, sobre a superfície de uma lâmina limpa, seca e desengordurada.
b) Fixação e coloração
Fixar o esfregaço sob luz ultravioleta por pelo menos 15 minutos ou fixá-lo pelo calor passando a lâmina 3 vezes através da chama;
Corar o esfregaço com solução de cristal violeta por 1 minuto;
Escorrer o excesso de corante e enxaguar, suavemente, em água corrente por 5 segundos;
Enxaguar a lâmina com solução de lugol e inundá-la com a mesma solução por 1 minuto;
Escorrer o excesso de lugol e enxaguar, suavemente, em água corrente por 5 segundos;
Descorar o esfregaço com álcool etílico 95º INPM por 15 segundos a 30 segundos;
Enxaguar imediatamente em água corrente por 5 segundos;
Contra-corar com solução de safranina por 1 minuto;
Lavar a lâmina suavemente em água corrente; e
Secar ao ar.
c) Leitura no microscópio óptico
Limpar a objetiva do microscópio com um lenço de papel antes e após cada leitura;
Instilar uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço já corado, sem deixar a ponta do conta-gotas encostar na lâmina; e
Observar ao microscópio com objetiva de imersão em aumento de 1000 X.
Interpretação de resultados
Microrganismos Gram positivos: corados em azul;
Microrganismos Gram negativos: corados em vermelho;
Culturas muito velhas, muito novas e lâminas fixadas em calor excessivo podem fazer com que microrganismos Gram positivos se corem como Gram negativos; e
Mudanças na técnica sem a prévia validação podem causar alterações nos padrões de coloração dos microrganismos.
Descarte de resíduos
O excesso dos corantes e a água de enxágue deverão ser recolhidos em uma cuba e, ao final da coloração, transferidos com o auxílio de um funil para um recipiente grande e com tampa, devidamente identificado e próprio para este fim;
Quando este atingir no máximo 2/3 de sua capacidade, autoclavar a 121ºC por 1 hora;
Medir o volume do resíduo autoclavado com proveta;
Transferir para Erlenmeyer ou balão de fundo chato e inserir uma barra magnética no recipiente;
Adicionar 10 g de carvão ativado para cada litro de resíduo;
Deixar sob agitação em agitador magnético por 10 minutos;
Filtrar à vácuo em funil Buchner com papel filtro e Kitasato;
Repetir o procedimento desde a adição de carvão vegetal até que o filtrado fique translúcido;
Medir e ajustar o pH do filtrado com NaOH 4% até pH neutro. Descartar na rede de tratamento de esgoto; e
Secar o resíduo sólido (papel de filtro e carvão) em uma bandeja a temperatura ambiente e acondicionar em saco plástico.
D) Morfologia colonial – Dissociação
Esta prova deve ser realizada imediatamente depois do isolamento para evitar que os sucessivos subcultivos promovam o aparecimento de mutantes.
a) Meio de cultura e reagentes
Ágar triptose;
Solução de cristal violeta 1:40;
Solução de acriflavina 1:10.000; e
Água destilada.
b) Método
A partir de um cultivo puro recente, fazer estrias em placas contendo ágar triptose de forma a se obter colônias isoladas;
Incubar a 37 ºC ± 2 ºC por 2 a 3 dias;
Observar a placa semeada ao microscópio estereoscópico para avaliar qualitativamente o grau de dissociação das colônias;
Inundar as placas com solução de cristal violeta diluída em água destilada 1:50, e aguardar 15 a 20 segundos;
Desprezar o excesso de corante com o auxílio de uma pipeta em um recipiente de descarte contendo solução desinfetante; e
Observar as placas contra a luz e ao microscópio estereoscópico.
c) Interpretação de resultados
I. Observação direta ao microscópio estereoscópico
Colônias lisas: redondas, brilhantes e azuladas ou verde-azuladas;
Colônias rugosas: possuem aparência seca e granular e são amareladas ou branco amareladas;
Colônias mucóides: podem ser transparentes e acinzentadas, possuem consistência viscosa quando tocadas; e
Colônias intermediárias: aparência intermediária entre lisa e rugosa. São fracamente opacas e mais granulares que as colônias lisas.
II. Observação após coloração com cristal violeta
Colônias lisas: não são coradas; e
Colônias rugosas: são coradas em diversos tons de vermelho e roxo e a superfície pode mostrar rachaduras radiais.
III. Teste de acriflavina
Colocar em uma lâmina ou placa de Petri, uma gota de solução de acriflavina diluída a 1:10.000;
Com o auxílio de uma alça bacteriológica, depositar sobre a gota uma colônia tipicamente lisa para verificar se a solução de acriflavina está em boas condições (controle negativo);
Homogeneizar e observar ao microscópio estereoscópico;
Colônias lisas: permanecem em suspensão;
Colônias rugosas: são aglutinadas imediatamente;
Colônias intermediárias: podem permanecer em suspensão ou pode ocorrer pequena aglutinação;
Colônias mucoides: formam-se pequenas linhas;
B. abortus, B. melitensis e B. suis: são lisas; e
B. ovis, B. canis e RB51: são rugosas.
E) Características gerais
Hemólise
a) Meio de cultura e reagentes
Ágar sangue de carneiro desfibrinado;
Controle positivo: Staphylococcus aureus; e
Controle negativo: Brucella spp ou meio não inoculado.
b) Método
Semear as placas com inóculo denso de um cultivo puro recente; e
Incubar a 37 ºC ±2 ºC por 2 a 3 dias.
c) Interpretação de resultados
Verificar a presença de hemólise, evidenciada pela formação de um halo transparente ao redor do crescimento microbiano;
Hemólise positiva: presença de halo;
Hemólise negativa: ausência de halo; e
Brucella não produz hemólise.
Fermentação da lactose
a) Meios de cultura e reagentes
Ágar MacConkey;
Controle positivo: Salmonella Typhimurium, Escherichia coli, Klebsiela ou Enterobacter; e
Controle negativo: Brucella spp, Staphylococcus aureus, Salmonella, Shigella, Proteus, Edwardsiella, Pseudomonas aeruginosa ou meio não inoculado.
b) Método
Semear as placas com inóculo denso de um cultivo puro recente; e
Incubar a 37 ºC ± 2 ºC por 2 a 3 dias. A incubação prolongada pode levar a resultados confusos.
c) Interpretação de resultados
Fermentadores da lactose (Lac +): colônias cor de rosa ou vermelho tijolo e opacas, se o crescimento for denso; as colônias podem ser circundadas por zonas de bile precipitada (de cor vermelho claro) devido à ação do ácido (produzido pela fermentação da lactose e queda do pH), sobre os sais biliares com subsequente absorção do vermelho neutro;
Não fermentadores da lactose (Lac -): colônias pouco coloridas ou transparentes, observadas melhor contra a luz; se as colônias estiverem perto de colônias Lac +, algumas áreas de bile precipitada podem aparecer; Brucella não fermenta a lactose; e
Fermentadores tardios da lactose: colônias pouco coloridas até 24h e colônias rosa - pálidas após 48h. Exemplo: Citrobacter, Providencia, Serratia e Hafnia.
Fermentação da glicose
a) Meio de cultura e reagentes
Ágar vermelho de fenol com 1 % de glicose;
Controle positivo: Escherichia coli; e
Controle negativo: Brucella spp ou meio sem inoculação.
b) Método
Semear o meio com inóculo denso de um cultivo puro recente; e
Incubar a 37 ºC ± 2 ºC por 2 a 3 dias.
c) Interpretação de resultados
Resultado positivo: meio ácido (pH 6,8) com cor amarela. Presença de gás nos tubos de Duhan;
Resultado positivo retardado: cor alaranjada. Voltar a incubar; e
Resultado negativo: meio alcalino (pH 8,4) com cor rosa.
F) Provas bioquímicas
a) Prova da catalase
I. Reagentes
Peróxido de hidrogênio a 30% (Deve ser conservado em frasco âmbar, e mantido sob refrigeração);
Controle positivo : Brucella spp ou Staphylococcus aureus; e
Com uma alça, pegar uma pequena quantidade de um cultivo puro recente e colocar em uma lâmina de vidro para microscopia ou em uma placa de Petri;
Instilar uma gota de H2O2 a 30 % sobre o cultivo;
Não inverter a ordem do método, pois podem produzir-se resultados falsos positivos; e
Não é necessário misturar o cultivo com o peróxido de hidrogênio.
III. Interpretação de resultados
Prova positiva: formação imediata de borbulhas bem visíveis (formação de O2);
Prova negativa: não há formação de borbulhas (não se forma O2); e
Brucella é catalase positiva.
b) Prova da oxidase
I. Reagentes
N´N´N´N´ tetrametil-parafenileno;
Controle positivo: Brucella spp (exceto B. ovis) ou Pseudomonas aeruginosa; e
Controle negativo: Brucella ovis ou Escherichia coli.
II. Método
Colocar um pedaço de aproximadamente 6 cm2 de papel de filtro em uma placa de Petri;
Instilar 2 ou 3 gotas do reagente no centro do papel;
Com uma alça bacteriológica, estender uma porção de um cultivo puro recente sobre o papel impregnado com o reativo, seguindo uma linha de 1 a 2 cm de longitude; e
Usar somente alça de platina, bastão de vidro ou alças descartáveis. Alças de níquel-cromo podem conter resquícios de ferro, o que pode levar a um resultado falso positivo.
III. Interpretação de resultados
Resultado positivo: a reação é indicada por uma cor negra purpúrea que se desenvolve entre 10 e 60 segundos;
Resultado negativo: não há mudança de cor das colônias. O desenvolvimento tardio de cor, passado um período de 60segundos, indica uma prova negativa; e
Brucella é oxidase positiva, com exceção de B. neotomae e B. ovis que são sempre negativas.
c) Utilização do citrato como única fonte de carbono
I. Meios de cultura e reagentes
Ágar citrato de Simmons;
Controle positivo: Bacillus subtilis, Salmonella sppou Pseudomonas aeruginosa; e
Controle negativo: Brucella spp ou Escherichia coli.
II. Método
Semear este meio antes dos outros para evitar que substâncias, principalmente glicose, sejam carreadas de outros meios para ele, podendo levar a um resultado falso positivo;
Semear toda a superfície do bisel com inóculo pouco denso de um cultivo puro recente. Não inocular a base, pois a mesma serve como controle de cor; e
Incubar a 37 ºC ± 2 ºC por 2 a 3 dias.
III. Interpretação de resultados
Prova positiva: crescimento com uma cor azul intensa no bisel;
Prova negativa: não se observa crescimento e nem mudança de cor (verde); e
Brucella não utiliza o citrato como única fonte de carbono.
d) Atividade uréase
I. Meios de cultura e reagentes
Ágar uréia de Christensen;
Controle positivo: Brucella spp (exceto B. ovis), Proteus vulgaris ou Proteus mirabilis; e
Controle negativo: Brucella ovis, Salmonella Typhimurium, Escherichia coli ou B. abortus 544.
II. Método
Semear toda a superfície do bisel com inóculo denso de um cultivo puro recente. Não inocular a base, pois a mesma serve como controle de cor; e
Incubar a 37 ºC ±2 ºC por até 6dias.
III. Interpretação de resultados
Urease positiva: bisel com cor vermelho-violeta intenso. A cor pode penetrar dentro do ágar. A extensão da cor indica o grau de hidrólise da uréia;
Urease negativa: a cor do meio permanece inalterada (amarelo pálido);
Quase todas as cepas de Brucella possuem atividade ureásica, mas as de B. suis decompõem a uréia com maior rapidez. A reação é mais tardia nos cultivos de B. abortus. No geral, os cultivos de B. melitensis demoram mais em decompor a uréia que os cultivos de B. abortus. Também desintegram a uréia, B. neotomae e B. canis, mas não B. ovis;
Grau de hidrólise: “4+” = tubo inteiro com cor vermelho-violeta intenso; Grau de hidrólise “2+” = Bisel com cor vermelho-violeta intenso, mas a base não é alterada;
Fracamente positivos: topo do bisel rosa e o restante não alterado;
Positivos rápidos: alteração do meio em até 6 horas de incubação; e
Positivos tardios: 24h a 6 dias de incubação, não mais que isso.
e) Liquefação da gelatina
I. Meios de cultura e reagentes
Caldo nutritivo com gelatina;
Controle positivo: Pseudomonas aeruginosa ou S. aureus; e
Controle negativo: Brucella spp ou Escherichia coli.
II. Método
Semear o ágar com inóculo denso de um cultivo puro recente;
Este deve ser picado a uma profundidade de até 2/3 no centro do meio de cultura; e
Incubar a 37 ºC ± 2 ºC por 2 dias ou, por até 14 dias.
III. Interpretação de resultados
Não agitar os tubos ao retirá-los da estufa;
Colocar os tubos em geladeira ou banho de gelo até que esfriem (~ 15 min) antes de fazer a leitura;
Reação positiva: o meio permanece liquefeito;
Reação negativa: o meio torna-se sólido; e
Brucella não liquefaz a gelatina.
f) Motilidade
I. Meios de cultura e reagentes
Meio SIM (Meio semi-sólido utilizado para exibir, além de outras coisas, motilidade);
Controle positivo: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Salmonella Typhimurium ou Proteus vulgaris; e
Controle negativo: Brucella spp ou meio não inoculado.
II. Método
Preparar os tubos em duplicata;
Um inóculo pouco denso de um cultivo puro recente deve ser picado a uma profundidade de até 2/3, no centro do meio de cultura; e
Incubar uma parte dos tubos a 22 ºC ± 2 ºC (temperatura ambiente) e a outra a 37 ºC ± 2 ºC, ambas por 2 a 3 dias.
III. Interpretação de resultados
Motilidade positiva: crescimento difuso para fora da linha de inoculação ou turbidez do meio;
Motilidade negativa: o crescimento está presente apenas na linha de inoculação; e
Brucella é imóvel.
g) Produção de indol
I. Meios de cultura e reagentes
Meio SIM;
Reagente de Kovac;
Controle positivo: Escherichia coli; e
Controle negativo: Brucella spp, Salmonella spp ou Proteus mirabilis.
II. Método
Utilizar os mesmos tubos do Teste de Motilidade a 37 ºC para realizar a leitura;
Instilar aproximadamente 5 gotas do reativo de Kovac diretamente no tubo; e
Agitar suavemente.
III. Interpretação de resultados
Reação positiva: forma-se um anel vermelho na superfície do meio;
Reação negativa: a cor do reagente não é alterada (amarela);
Reação variável: cor alaranjada na superfície do meio devido ao desenvolvimento de escatol, um composto metilado que pode ser um precursor da formação de indol; e
Brucella não produz indol.
h) Redução do nitrato
I. Meios de cultura e reagentes
Caldo nutriente com nitrato 0,1% (1mL / tubo) com 0,2% a 0,4% de ágar;
a- naftilamina 0,5% ou dimetil--naftilamina 0,6%. Armazenar sob refrigeração por até 3 meses;
Ácido Sulfanílico 0,8%. Armazenar sob refrigeração por até 3 meses;
Pó de zinco;
Controle positivo: Brucella spp (exceto B. ovis e B. abortus RB51), Escherichia coli ou Staphylococcus aureus; e
Semear o caldo com inóculo denso de um cultivo puro recente;
Incubar a 37 ºC ± 2 ºC por 2 a 3 dias;
Colocar aproximadamente 1mL de -naftilamina 0,5% ou dimetil--naftilamina 0,6% diretamente sobre o cultivo; e
Imediatamente após, colocar aproximadamente 1mL de ácido Sulfanílico 0,8% diretamente sobre o cultivo;
III. Interpretação de resultados
Resultado positivo: aparecimento de uma cor vermelho tijolo dentro de 30 segundos, indicando uma prova completa;
Resultado negativo: sem aparecimento de cor. Proceder à 2ª fase.
Agregar diretamente ao tubo que contêm os dois reativos acima (-naftilamina e ácido Sulfanílico) aproximadamente 20 mg de pó de zinco;
O aparecimento de uma cor vermelha ao final de 30 segundos confirma um resultado negativo; e
Brucella reduz o nitrato, exceto B. ovis e B. abortus RB51.
i) Relação com o oxigênio
I. Meios de cultura e reagentes
Caldo tioglicolato com indicador de anaerobiose, resazurina ou azul de metileno. A resazurina é mais indicada como indicador de Eh (potencial de oxirredução);
Antes de inocular, checar a porção superior do meio em cada tubo. Se o indicador usado indicar mais de 1/3 da coluna de líquido oxidada, descartar o tubo. Se a oxidação for em 1/3 ou menos retirar a rolha e ferver em banho-maria, sem agitação, por 10 minutos para eliminar o oxigênio absorvido. Resfriar à temperatura ambiente antes do uso;
Não ferver o meio mais de uma vez, pois disso resulta o desenvolvimento de produtos tóxicos. Estocá-lo em temperatura ambiente e no escuro;
Controle positivo da anaerobiose: Clostridiumsporogenes ou Bacteroides fragilis;
Controle positivo da aerobiose: Bacillus subtilis, S. aureus ou Escherichia coli, Brucella ssp; e
Controle negativo: tubo não inoculado ou B. abortus 544.
II. Método
Semear o caldo com inóculo denso de um cultivo puro recente; e
Incubar a 37 ºC ± 2 ºC por 2 a 3 dias.
III. Interpretação de resultados
Registrar a presença ou ausência de crescimento;
Crescimento na porção superior: aeróbios;
Crescimento na porção inferior: anaeróbios. Os anaeróbios tornam o meio turvo devido à floculação na parte onde a concentração de oxigênio é menor;
Crescimento em toda a extensão do tubo: anaeróbios facultativos;
Brucella é aeróbio estrito; e
O QUADRO 17 resume as principais características que diferem Brucella de outros microrganismos Gram-negativos.
QUADRO 17 - Características diferenciais entre Brucella e outros Gram negativos
Provas
Brucella
Bordetella bronchiseptica
Campylobacter fetus
Moraxella
Acinetobacter
Yersinia enterocolitica 09
Morfologia
Pequenos cocobacilos
Pequenos cocobacilos
Forma de vírgula
Diplococos
Diplococos
Bastonete
Motilidade 37ºC
-
+
+
-
-
-
Motilidade
25ºC
-
-
-
-
-
+
Lactose
-
-
-
V a
V
-
Glicose
- b
-
-
-
V
+
Hemólise
-
+
-
V
V
-
Catalase
+
+
+
V
+
+
Oxidase
+ c
+
+
+
-
-
Urease
+ d
+
-
V
V
+
Nitrato
+ e
+
+
V
-
+
Citrato
-
+
-
-
V
-
+: positivo; -: negativo; V: Variável entre positivo e negativo; a: espécies positivas e negativas dentro do gênero; b: B. neotomae pode mostrar alguma fermentação; c: exceto B. ovis, B. neotomae e ocasionalmente cepas de B. abortus que são negativas; d: exceto B. ovis e ocasionalmente cepas de B. abortus que são negativas; e: exceto B. ovis que não reduz nitrato a nitrito.
Fonte: LFDA-MG, adaptado de Alton et al. (1988)
G -Tipificação de culturas de Brucella
Disposições gerais
Após a cepa ter sido identificada como membro do gênero Brucella, é importante tentar estabelecer a espécie e biovar. Os testes de tipificação identificarão a maioria das cepas de Brucella como um biovar particular de uma das espécies estabelecidas;
Ocasionalmente, algumas cepas não serão classificadas exatamente dentro da lista de biovares, por exemplo, B. abortus tem sempre uma ou duas características que diferem daquelas mostradas na QUADRO 18. Antes de dar a esta cepa o status de um novo biovar, ela deverá ser descrita como pertencente a um biovar existente, exceto em situações distintas;
Quando culturas atípicas são identificadas, é importante estabelecer se este fenômeno que se repete representa um modelo local de taxonomia ou erro de laboratório. Características atípicas firmemente estabelecidas em isolados poderão servir como marcadores epidemiológicos, possibilitando traçar mais facilmente os hospedeiros e a extensão geográfica dessas cepas;
A identificação da espécie é baseada em duas propriedades principais: lise por fagos e requerimento de soro, além do hospedeiro preferencial; e
Para B. melitensis, B. abortus e B. suis, a identificação até o nível de biovar é feita por meio de quatro testes: requerimento de CO2, produção de sulfito de hidrogênio (H2S), sensibilidade a corantes (tionina, fucsina básica e safranina O) e aglutinação com antissoro monoespecífico A e M. Entretanto, em um pequeno número de casos, somente as provas metabólicas oxidativas permitem estabelecer a classificação com toda segurança. Os aparatos e materiais necessários para efetuar esta prova são custosos. Além disso, exigem tempo, somente podem ser realizadas por pessoal especializado e oferecem ao operador grave risco de infecção por brucelas. Sendo assim, não são práticas para a tipificação em série de grande número de cultivos.
Identificação da espécie
a) Lise por fagos
I. Meios de cultura e reagentes
Agar triptose; e
Salina 0,85%
II. Método
Com auxílio de suabes semear placas de ágar triptose com a amostra fazendo as estrias bem próximas umas das outras;
Incubar a 37 ºC ± 2 ºC durante 2 a 3 dias;
Coletar o cultivo com aproximadamente 10 mL salina 0,85%. Pode-se utilizar a mesma suspensão preparada na prova de crescimento na presença de corantes;
Padronizar a suspensão coletada acima de modo que contenha, aproximadamente, 109 microrganismos/mL. Para isso, diluir 0,5 mL da suspensão em 20 mL de salina 0,85%;
Identificar as placas e marcar o local onde serão depositadas as diferentes concentrações do fago;
Dispensar 20 µL de cada concentração do fago nos lugares predeterminados;
Aguardar até que os inóculos de fago sequem; e
Incubar a 37 ºC ± 2 ºC por 2 a 3 dias, se necessário em estufa de CO2.
III. Interpretação de resultados
Positivo: formação de um halo transparente, indicando que brucelas foram lisadas pelo fago Tb;
Negativo: sem formação de halo, indicando que brucelas não foram lisadas pelo fago Tb;
Lise parcial: formação de halo mais denso que na reação positiva; e
Interpretar os resultados de acordo com o QUADRO 18.
b) Requerimento de soro
I. Reagentes
Ágar triptose;
Ágar triptose com adição de soro;
Salina 0,85%; e
Controle: B. abortus B19.
II. Método
Com auxílio de suabes, semear placas de ágar triptose 5% soro com a amostra;
Coletar o cultivo com, aproximadamente, 10 mL salina 0,85%. Esta suspensão poderá ser utilizada nas provas de lise por fagos, aglutinação com antissoro monoespecífico A e M, diferenciação de cepas vacinal e de campo;
Inocular cada placa de Ágar triptose com uma estria de cada suspensão preparada anteriormente. Inocular até 6 suspensões por placa;
Inocular as amostras de referência para controle, sendo B. abortus B19;
Como controle negativo, não inocular nenhuma amostra; e
Incubar a 37 ºC ± 2 ºC com atmosfera de 5-10% de CO2. Por 48 horas.
III. Interpretação de resultados
Verificar se houve crescimento e em qual meio; e
Interpretar os resultados de acordo com o QUADRO 18.
QUADRO 18 - Características diferenciais entre espécies do gênero Brucella
Espécies
Morfologia
Colonial
Requerimento de Soro
Lise por Fagos (Tb)
Oxidase
Urease
Hospedeiro Preferencial
DHP
104 x DHP
B. melitensis
Lisa
-
-
-
+
+ a
Ovinos e caprinos
B. abortus
Lisa
- b
+
+
+ c
+ d
Bovinos
B. suis
Lisa
-
-
+
+
+ e
Suínos
B. neotomae
Lisa
-
- f
+
-
+ e
Ratos do deserto
B. ovis
Rugosa
+
-
-
-
-
Carneiros
B. canis
Rugosa
-
-
-
+
+ e
Cães
+: positivo; -: negativo; a: velocidade intermediária, algumas cepas rápidas; b: exceto B. abortusbiovar 2 que geralmente requer soro para crescimento no isolamento primário; c: exceto cepas de B. abortusbiovar 3 isoladas no Senegal e Guinea Bissau, que são negativas; d: velocidade intermediária, exceção para a cepa de referência 544 e, ocasionalmente, algumas cepas de campo que são negativas; e: velocidade rápida; f: placas minúsculas.
Fonte: LFDA-MG, adaptado de Alton et al. (1988).
Identificação da biovar
a) Requerimento de CO2
I. Reagentes
Ágar triptose com 5% de soro;
Salina 0,85%; e
Controle: B. abortus B19 e B. abortus 544.
II. Método
Com auxílio de suabes, semear placas de ágar triptose 5% soro com a amostra;
Coletar o cultivo com, aproximadamente, 10 mL salina 0,85%. Esta suspensão poderá ser utilizada nas provas de lise por fagos, aglutinação com antissoro monoespecífico A e M, diferenciação de cepas vacinal e de campo;
Inocular cada placa de Ágar triptose com 5 % de soro com uma estria de cada suspensão preparada anteriormente. Inocular até 6 suspensões por placa;
Inocular as amostras de referência para controle, sendo B. abortus 544; B. abortus B19; e
Incubar a 37 ºC ± 2 ºC por 48 horas.
III. Interpretação de resultados
Verificar se houve crescimento e em qual atmosfera. Se no cultivo em atmosfera normal só aparecer colônias escassas, não as levar em consideração; e
Interpretar os resultados de acordo com o QUADRO 19.
b) Produção de H2S (ácido sulfídrico)
I. Meios de cultura e reagentes
Fitas impregnadas com acetato de chumbo;
Ágar nutriente (em tubos inclinados);
Controle positivo: B. abortus, B. suis 1, Proteus mirabilis ou Proteus vulgaris; e
Controle negativo: B. melitensis, B. ovis, B. abortus bio 5, B. abortus bio6, B. abortus RB51, B. suis bio 2 ou B. suis bio 3 ou Pseudomonas aeruginosa.
II. Método
Semear o ágar com inóculo denso de um cultivo puro recente;
Assepticamente, colocar uma tira de acetato de chumbo estéril sobre a parede do tubo que não contém ágar a aproximadamente, 10 mm acima do nível deste;
Dobrar a extremidade externa sobre o tubo e colocar a tampa para manter a fita em seu lugar;
Incubar a 37 ºC ± 2 ºC por 3 a 4 dias; e
Observar diariamente;
III. Interpretação de resultados
O período em que se produz H2S somente é importante em espécies de Brucella;
Registrar os resultados diariamente seguindo o modelo: “H2S produzido nos primeiros dois dias”, “H2S produzido desde o 1º ao 5º dia” etc.;
Positivo: coloração negra-pardacenta na tira de papel, podendo ter brilho;
Negativo: não se observa mudança na coloração da tira de papel ou a presença de traços; e
Interpretar os resultados de acordo com o QUADRO 19.
c) Crescimento na presença de corantes
I. Reagentes
Ágar triptose com 5% de soro;
Ágar triptose com 5% de soro e corantes Tionina e fucsina básica 1:50.000, 1:80.000 ou 1:100.000; Safranina 0 a 1:25.000;
Salina 0,85% (10 mL/placa); e
Controles: B. abortus 544, B. abortus B19, B. melitensis 16M e B. suis 1330.
II. Método
Com auxílio de suabes, semear placas de ágar triptose 5% soro com a amostra;
Coletar o cultivo com aproximadamente 10 mL salina 0,85%. Esta suspensão poderá ser utilizada nas provas de lise por fagos, aglutinação com antissoro monoespecífico A e M, diferenciação de cepas vacinal e de campo e para testes de requerimento de CO2 e requerimento de soro;
Inocular cada placa de Agar triptose com 5 % de soro e corantes com uma estria de cada suspensão preparada anteriormente. Inocular até 6 suspensões por placa;
Inocular as amostras de referência para controle, sendo: B. abortus 544; B. abortus B19; B. melitensis 16M; B. suis 1330; e
Incubar a 37 ºC ± 2 ºC em atmosfera com 5 a 10% de CO2 por 2 a 3 dias.
III. Interpretação de resultados
Verificar se houve crescimento no meio e comparar os resultados com os controles; e
Interpretar os resultados de acordo com o QUADRO 19.
d) Aglutinação com antissoro monoespecífico A e M
I. Reagentes
Salina fenicada;
Salina 0,85%;
Soro anti - A;
Soro anti – M;
Controles Anti – A (B. abortus biovar 1, B. suis biovar 1); e
Controles Anti – M (B. melitensis biovar 1, B. abortus biovar 4),
II. Método 1
Preparar soluções estoque de soro monoespecífico anti-A e anti-M diluindo cada soro em salina fenicada até que uma gota aglutine a suspensão controle homóloga dentro de 1 minuto, sem aglutinação visível das outras duas suspensões controle durante o mesmo período. Essas soluções estoque se mantêm conservadas por vários meses se estocadas sob refrigeração;
Com auxílio de suabes, semear placas de ágar triptose com a amostra fazendo as estrias bem próximas umas das outras;
Incubar a 37 ºC ± 2 ºC durante 2 a 3 dias;
Coletar o cultivo com, aproximadamente, 10 mL salina 0,85%. Pode-se utilizar a mesma suspensão preparada na prova de crescimento na presença de corantes. Inativar essa suspensão aquecendo-a em banho-maria a 65 ºC durante 1 hora;
Colocar uma gota de cada soro diluído, A e M, em uma placa de Petri;
Adicionar uma gota da suspensão da cultura em cada soro e misturar; e
Observar a aglutinação que deverá o BIOVAR correr dentro de 1 minuto com um dos soros.
III. Método 2
Preparar uma suspensão bacteriana de modo a se obter aproximadamente 40 % de Transmitância em 600 mM;
Diluir os soros anti-A e anti-M conforme título recomendado para a partida utilizada na prova;
Distribuir 1 mL de cada suspensão em 2 tubos de vidro de 13 mm x 75 mm;
Distribuir 1 mL do soro anti-A diluído em um dos tubos e 1 mL do soro anti-M no outro tubo;
Incubar a 37 ºC ± 2 ºC por 48h;
Proceder a leitura observando a turbidez do sobrenadante e presença de aglutinação; e
A prova poderá ser realizada em microplaca utilizando-se um décimo do volume empregado na prova em tubos, incubando-se a 37 ºC ± 2 ºC por 24h.
IV. Interpretação de resultados
Interpretar os resultados de acordo com o QUADRO 19.
QUADRO 19 - Diferenciação entre biovares das espécies do gênero Brucella
Espécies
Biovar
Requerimento de CO2
Produção de H2S
Crescimento em Corantes a
Aglutinação em Soros b
Tionina
Fucsina
Safranina
A
M
R
B. melitensis
1
-
-
+
+
+
-
+
-
2
-
-
+
+
+
+
-
-
3
-
-
+
+
+
+
+
-
B. abortus
1
+ c
+
-
+
+
+
-
-
2
+ c
+
-
-
-
+
-
-
3
+ c
+
+
+
+
+
-
-
4
+ c
+
-
+ d
+
-
+
-
5
-
-
+
+
+
-
+
-
6
-
-
+
+
+
+
-
-
9
+ ou -
+
+
+
+
-
+
-
B. suis
1
-
+
+
- e
- h
+
-
-
2
-
-
+
-
- h
+
-
-
3
-
-
+
+
- h
+
-
-
4
-
-
+
- f
- h
+
+
-
5
-
-
+
-
- h
-
+
-
B. neotomae
N/A
-
+
- g
-
N/A
+
-
-
B. ovis
N/A
+
-
+
- f
N/A
-
-
+
B. canis
N/A
-
-
+
- f
N/A
-
-
+
+: positivo; -: negativo; a: Concentração de corante: 20µg / mL (1:50.000), exceto Safranina O 100µg / mL (1:10.000); b: A: antissoro monoespecífico A, M: antissoro monoespecífico M e R: antissoro anti-brucela rugosa; c: Usualmente positivo no isolamento primário; d: Algumas cepas isoladas no Canadá, Grã Bretanha e USA não crescem em corantes; e: Algumas cepas resistentes à fucsina básica foram isoladas na América do Sul e Sudeste Asiático; f: Negativo para a maioria das cepas; g: Crescimento poderá ocorrer na concentração de 10µg / mL (1:100.000) de tionina; h: A maioria das cepas de B. suis são inibidas por Safranina O na concentração de 100µg / mL (1:10.000); N/A: não se aplica.
Fonte: LFDA-MG, adaptado de Alton et al. (1988).
Diferenciação de amostra vacinal (B19) e amostra de campo
a) Reagentes
Ágar triptose com i-eritritol (1 mg/mL);
Ágar triptose com penicilina (5 UI/mL); e
Controles: B. abortus B19 e B. abortus biovar 544.
b) Método
Pode-se utilizar a mesma suspensão;
Padronizar uma suspensão de modo que contenha, aproximadamente, 109 microrganismos/mL. Para isso, diluir 0,5 mL da suspensão preparada na prova de crescimento na presença de corantes, em 20 mL de salina 0,85%;
Inocular as placas contendo os diferentes reagentes com uma estria de cada suspensão. Pode-se inocular até seis suspensões por placa; e
Incubar as placas a 37 ºC ± 2 ºC por 3 a 4 dias.
c) Interpretação de resultados
Interpretar os resultados de acordo com o QUADRO 20.
QUADRO 20 - Características diferenciais entre B. abortus cepa 19 (cepa vacinal) e B. abortusbiovar 1 (cepa de campo)
Cepa
Requerimento de CO2
Crescimento em meio contendo
i - eritritol
(1 mg/mL)
Penicilina (5 UI/mL)
B. abortus biovar 1
+ a
+
+ a
B. abortus 19
-
- b
-
+: positivo; - negativo; a: usualmente positivo no isolamento primário; b: O padrão de mutação para tolerância ao eritritol é bastante alto e algumas cepas suspeitas B19 isoladas podem crescer em eritritol embora pareça com a cepa B19 em outros testes. Fonte:
LFDA-MG, adaptado de Alton et al. (1988)
Critérios de aceitação do ensaio
O isolamento positivo é conclusivo e definitivo;
Devido à baixa sensibilidade da prova, o não isolamento do microrganismo requer que a interpretação dos resultados seja feita pelo solicitante com base no histórico do animal e/ou rebanho e legislação vigente; e
Os resultados referem-se única e exclusivamente às amostras enviadas ao laboratório.
Interpretação de resultados
O isolamento positivo é conclusivo e definitivo; e
Devido à baixa sensibilidade da prova, o não isolamento do microrganismo requer que a interpretação dos resultados seja feita com base no histórico do animal e/ou rebanho e legislação vigente.
Emissão dos resultados
Os resultados deverão ser emitidos em documento denominado “Relatório de Ensaio” e expresso como “positivo” ou “não isolado”.
Descarte de amostras e resíduos
Anteriormente ao descarte de amostras e produtos de ensaio, deverão ser observados os prazos mínimos estabelecidos no item “Retenção de itens de Ensaio”;
Anteriormente ao descarte de amostras e produtos de ensaio, deve ser realizado registro de descarte em formulário próprio e conferência;
Todo o material utilizado na realização do ensaio deve ser submetido ao processo de autoclavagem apropriado. A efetividade de esterilização deve estar comprovada em procedimentos e registros próprios do laboratório;
Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos; e
O laboratório deve assegurar a biossegurança dos resíduos gerados, e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo o processo do descarte.
Retenção de itens de ensaio
As amostras de espécimes clínicos poderão ser descartadas 60 dias após a emissão do relatório de ensaio; e
As brucelas isoladas deverão ser recolhidas em veículos de liofilização e congeladas a -70ºC para posterior envio ao LFDA-MG.
¶G. Identificação de Brucella spp e diferenciação de amostra vacinal da amostra de campo, por biologia molecular - PCR convencional multiplex
Materiais
Luvas de procedimento nitrílicas ou de látex isentas de pó;
Microtubos de volumes variados;
Microplacas ou microtubos de PCR;
Adesivo selante para microplacas ou tampas para os microtubos de PCR;
Ponteiras com filtro, estéreis, livres de DNAses e RNAses;
Estantes para microtubos; e
Gaze ou papel toalha.
Equipamentos e instrumentos
Estação de trabalho para PCR (Workstation PCR) com luz UV germicida;
Geladeira;
Freezer;
Micropipetas de volumes reguláveis;
Termociclador para PCR convencional;
Centrífuga refrigerada com rotores para microtubos;
Agitador de microtubos (opcional);
Microcomputador; e
Equipamento para extração automatizada de ácidos nucleicos (opcional).
Insumos
Agarose;
Água livre de nucleases;
Corante para ácidos nucléicos;
Mix de dNTP (deoxinucleotídeos trifosfato);
MgCl2 25 mmol/L;
Tampão da Taq DNA polimerase;
DNA polimerase;
Tampão TE pH=8;
Iniciadores para PCR (QUADRO 21); e
Controles positivos: isolados de B. abortus biovar 1, 2 ou 3; B. abortus biovar 3, 5, 6 ou 9; B. suis; B. melitensis; cepa vacinal B. abortus B19; B. ovis.
QUADRO 21 - Sugestão de oligonucleotídeos para PCR multiplex para detecção molecular de Brucella
OLIGONUCLEOTÍDEO
SEQUÊNCIA (5’-3’)
REFERÊNCIA
B. abortus
GAC GAA CGG AAT TTT TCC AAT CCC
BRICKER & HALLING, 1993
B. melitensis
AAA TCG CGT CCT TGC TGG TCT GA
BRICKER & HALLING, 1993
B. ovis
CGG GTT CTG GCA CCA TCG TCG
BRICKER & HALLING, 1993
B. suis
GCG CGG TTT TCT GAA GGT TCA GG
BRICKER & HALLING, 1993
IS711
TGC CGA TCA CTT AAG GGC CTT CAT TCG CAG
BRICKER & HALLING, 1993
16S F
GTG CCA GCA GCC GCC GTA ATA C
BRICKER, 2003
16S R
TGG TGT GAC GGG CGG TGT GTA CAA G
BRICKER,2003
428F
GCC GCT ATT ATG TGG ACT GG
LÓPEZ-GOÑI, 2008
428R
AAT GAC TTC ACG GTC GTT CG
LÓPEZ-GOÑI, 2008
Fonte: Orzil et al. (2016).
Soluções
Solução de álcool 70º INPM;
Solução descontaminante de DNA e DNAses;
Solução tampão TBE (Tris/Borato/EDTA) 1X;
Soluções estoque dos iniciadores: ressuspender os iniciadores liofilizados em tampão TE pH=8, de modo que a solução estoque seja de 500 pmol/µL; e
Soluções de trabalho: preparar soluções de trabalho de concentração 5pmol/µL a partir das soluções estoque. Usar como diluente o tampão TE pH=8 ou água livre de nucleases.
Realização do ensaio
Disposições gerais
Observar a diferenciação entre as áreas físicas de preparo de amostra, preparo do mix de PCR, aplicação da amostra e eletroforese, a fim de prevenir contaminações com amostra ou com produto amplificado;
As micropipetas utilizadas para cada uma das etapas da metodologia devem ser exclusivas para tais finalidades; e
As concentrações das soluções estoque e soluções de trabalho dos iniciadores poderá variar desde que observadas a concentração final de cada reagente do mix de reação de PCR contida no QUADRO 22.
Extração da amostra
Ressuspender as culturas puras do isolamento bacteriano em aproximadamente 1 mL de salina estéril 0,85%; e
Extrair o DNA genômico através da lise pelo calor em banho–maria à 65°C por 1 hora.
Preparo do mix de reação
Antes e após o preparo do mix de reação, descontaminar a estação de trabalho e os materiais a serem utilizados, com solução específica (para degradação de DNA, RNA, proteínas e nucleases) e/ou álcool 70º INPM, com auxílio de papel toalha ou gaze e com lâmpada UV por no mínimo 15 minutos;
Preparar o mix de reação de acordo com protocolos validados e específicos para o agente pesquisado (Brucella sp.) em quantidade suficiente para o número de amostras a serem testadas, controle positivo e branco de reação;
Homogeneizar preferencialmente em agitador de tubos e adicionar o mix de reação a cada poço da microplaca ou microtubo para PCR; e
Devem ser incluídos nas análises: controle DETECTADO para Brucella spp e Branco (mix de PCR com água livre de nucleases aplicada no lugar do DNA).
Aplicação da amostra
Antes e após a aplicação da amostra, descontaminar a estação de trabalho e os materiais a serem utilizados, com solução específica (para degradação de DNA, RNA, proteínas e nucleases) e/ou álcool 70º INPM, com auxílio de papel toalha ou gaze e se possível com lâmpada UV por no mínimo 15 minutos;
Adicionar o DNA nos poços da placa ou em microtubos identificados com a numeração da amostra a ser testada;
Utilizar como controles positivos de reação, as cepas de Controles positivos: isolados de B. abortus biovar 1, 2 ou 3; B. abortus biovar 3, 5, 6 ou 9; B. suis; B. melitensis; cepa vacinal B. abortus B19; B. ovis; e
Utilizar como branco de reação, água no lugar do DNA.
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Proceder à amplificação em termociclador certificado, de acordo com especificações de temperatura do protocolo utilizado.
Eletroforese em gel de agarose
1Preparar o gel de agarose em concentração adequada ao protocolo de PCR utilizado. Adicionar corante para ácidos nucleicos em proporção suficiente para visualização das bandas;
Para a corrida das amostras, adicionar tampão de carregamento (loading buffer) ao produto de PCR;
Aplicar marcador de peso molecular em um dos poços do gel;
Realizar a corrida em cuba de eletroforese, utilizando o tempo e a voltagem adequados para o volume do gel e o protocolo de PCR utilizado. Sugere-se 100 volts por 90 minutos2; e
Visualizar o gel sob luz ultravioleta, fotografar com o auxílio de um fotodocumentador e analisar o resultado.
Nota:
1. A metodologia de eletroforese capilar pode ser utilizada como alternativa de acordo com protocolo da marca e cuja validação possa ser devidamente comprovada.
2. Para a identificação de B. ovis é necessário utilizar os parâmetros de corrida 180 minutos em gel de agarose 2% ou tempo e concentração ótima definidos em cada laboratório cujos testes sejam devidamente registrados e comprovados.
Critérios de aceitação do Ensaio
Os controles positivos devem apresentar bandas de tamanhos correspondentes aos amplicons do protocolo utilizado. Em caso da utilização dos iniciadores contidos no QUADRO 21, os controles positivos devem apresentar bandas de acordo com o seguinte padrão: o produto amplificado correspondente à IS711 é de aproximadamente 498 pares de base (pb) para B. abortus, 537 pb para B. abortus B19, 731 pb para B. melitensis, 976 pb para B. ovis, 285 pb para B. suis bv1. O gene universal 16S é de 900 pb. O gene EriC por sua vez, corresponde a aproximadamente 587 pb; e
O branco de reação não deve apresentar bandas de amplificação.
Interpretação dos resultados
Avaliar a correspondência entre o padrão de bandas apresentado pela amostra e por cada um dos controles positivos utilizados a fim de classificá-las como positivas ou negativas;
Avaliar a presença de banda relativa ao gene constitutivo de procariotos;
A leitura das bandas deve ser clara e livre de amplicons inespecíficos para que o teste seja considerado satisfatório; e
Qualquer amostra questionável deverá ser repetida em novo teste.
Nota: A metodologia não faz distinção entre B abortus biovar 1, 2 ou 3 nem entre B. abortus biovar 3, 5, 6 ou 9. Os resultados para tais biovariedades devem ser, portanto, reportados como “detectado” ou “não detectado” para o respectivo grupo.
Emissão dos resultados
Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO” ou “NÃO DETECTADO”.
Descarte de Amostras e Resíduos
Anteriormente ao descarte de amostras e produtos de ensaio, deverão ser observados os prazos mínimos estabelecidos no item “Retenção de itens de Ensaio”;
Anteriormente ao descarte de amostras e produtos de ensaio, deve ser realizado registro de descarte em formulário próprio e conferência;
Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos; e
O laboratório deve assegurar a biossegurança dos resíduos gerados, e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo o processo do descarte.
Retenção de itens de ensaio
Os isolados para análise de PCR devem ser armazenados por período mínimo de 12 meses a partir da realização das análises, em freezer a -20 ºC; e
As amostras negativas devem ser armazenadas por período mínimo de 90 dias a partir da realização das análises, em freezer a -20 ºC.
Anônimo. Standardised Complement Fixation Test for Bovine Brucelosis. Australian Veterinary Journal, V.53, P. 394-440, 1977
ALTON, G.G. et al. Las Técnicas de laboratório en la Brucelosis. 2ª edição. Genebra: Organización Mundial de la Salud, 1976. 190p.
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As sugestões para aprimoramento ou possíveis correções deste documento devem ser direcionadas ao Departamento responsável, para alinhamento das melhores práticas de mercado, legislação vigente e/ou regulamentações, que não tenham sido contempladas na versão vigente.