¶ Folha de rosto
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Ano 2024
Elaboração, distribuição, informações:
Ministério da Agricultura e Pecuária
Secretaria de Defesa Agropecuária - SDA
Departamento de Serviços Técnicos - DTEC
Esplanada dos Ministérios, Bloco D, Anexo, Ala B, 4º andar, sala 433
CEP: 70043-900, Brasília - DF
www.agricultura.gov.br
e- mail: cgal@agro.gov.br
Central de Relacionamento: 0800 704 1995
Equipe Técnica:
Ana Cristina Gonçalves Pinto da Rocha
Ana Carolina de Oliveira Nascimento
Anapolino Macedo de Oliveira
Aerlem Cynara Silva
Ana Karina Cunha Callado
Andrea Padilha de Alencar
Anselmo Vasconcelos Rivetti Júnior
Antônio Augusto Fonseca Júnior
Cid Aristóteles de Siqueira Alencar
Dilmara Reischak
Fernanda Gomes Cardoso
Isabela Ciarlini de Azevedo
João Marcos Nacif da Costa
Juliana Nabuco Pereira Otaka
Luanda Bispo Santos do Nascimento Maués
Luciana Amaral Pinto
Luciana Rabello Ferreira
Luciana Taborda Corrêa
Marcelo Fernandes Camargos
Marco Antônio de Carvalho Marques Serqueira
Paulo Martins Soares Filho
Patrícia Gomes de Souza
Rene Ribeiro da Silva
Sheila de Matos Xavier
Silvio Orlan de Castro Chaves
Soraya Cecilia Albieri Camillo
¶ Folha resumo
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Macroprocesso: Laboratórios |
Objetivo: Realizar a padronização, harmonização, atualização e a unificação dos procedimentos para execução de ensaios laboratoriais da área de Diagnóstico Animal |
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Processo: Análises Laboratoriais |
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Entrega: Segurança e saúde dos rebanhos animais |
Público alvo e demais interessados: Laboratórios oficiais ou credenciados do Ministério da Agricultura e Pecuária (Mapa) |
Versão do documento: 1 |
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Setor responsável e responsabilidades A Coordenação Geral de Laboratórios Agropecuários do Departamento de Serviços Técnicos é responsável pela elaboração, atualização e envio para aprovação deste manual, tendo responsabilidade quanto aos procedimentos descritos no documento. |
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¶ 1. Definições e conceitos
Não aplicável.
¶ 2. Responsabilidades
O presente manual possui vigência e prazo indeterminado e será revisado sempre que necessário, no mínimo anualmente, pela Coordenação Geral de Laboratórios Agropecuários do Departamento de Serviços Técnicos (CGAL/DTEC).
A gestão desse manual está sob a responsabilidade da CGAL/DTEC que prestará auxílio ao público alvo leitor dúvidas e/ou sugestões quanto à aplicação deste manual devem ser submetidas ao Departamento responsável.
A publicação e atualização das versões na plataforma oficial da SDA para acesso pelo público alvo será de responsabilidade da Secretaria representada pelo DTEC.
¶ 3. Objetivo
O objetivo do Manual é reunir os métodos analíticos a serem empregados na execução de ensaios laboratoriais da área de Diagnóstico Animal da Rede Nacional de Laboratórios Agropecuários (Rede LFDA e Laboratórios credenciados junto ao Ministério da Agricultura e Pecuária).
¶ 4. Procedimentos - Suínos
¶ 4.4 GASTROENTERITE TRANSMISSÍVEIL DOS SUÍNOS - TGE
¶ 4.4.1 Amostras
São consideradas amostras para o diagnóstico de TGE:
Detecção da Resposta Imune
Soro sanguíneo.
Detecção do Agente
- Fezes;
- Intestino delgado.
¶ 4.4.2 Recebimento das Amostras
4.4.2.1. Os Laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
4.4.2.2. Deverão ser obedecidos os critérios estabelecidos no capítulo de verificação de conformidade de amostras.
¶ 4.4.3. Técnicas de Diagnóstico
4.4.3.1. Somente poderão ser utilizados insumos de diagnóstico que tenham registro no MAPA, segundo legislação em vigor;
4.4.3.2 Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados;
4.4.3.3. O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos
a) Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente
b) Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 e 25ºC.
4.4.3.4. Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados;
4.4.3.5. O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios;
4.4.3.6. Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada;
4.4.3.7. Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório;
Nota: a utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitido quando:
I. A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos.
II. As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes.
III. O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
¶ A. Ensaio Imunoenzimático (ELISA)
¶ Materiais
- Luvas para procedimentos;
- Pipetas de vidro graduadas ou descartáveis;
- Provetas graduadas;
- Béqueres;
- Erlenmeyers;
- Ponteiras descartáveis;
- Descartador de ponteiras;
- Reservatórios para soluções (cubetas);
- Papel absorvente;
- Selador ou tampa para placas de ELISA;
- Caneta para identificação de vidraria; e
- Cubas para descarte de materiais resistente à autoclavação.
¶ Equipamentos e instrumentos
- Autoclave;
- Geladeira;
- Estufa;
- Termômetros
- Micropipetas monocanal e multicanal de volumes reguláveis;
- Pipetador automático ou manual;
- Leitora de ELISA;
- Cronômetros;
- Agitador de tubos tipo vórtex (opcional);
- Agitador de microplacas (opcional); e
- Lavadora de microplacas (opcional).
¶ Insumos
Kits de ELISA de detecção de anticorpos para o vírus da TGE.
¶ Soluções
- No preparo das soluções deve ser utilizado somente os reagentes fornecidos pelo fabricante, ou aqueles por ele indicados.;
- Conjugados, substratos e solução de parada deverão ser utilizados obedecendo-se as condições do fabricante;
- No preparo da solução de lavagem deve-se assegurar que não existem cristais precipitados na solução; e
- Diluir a soluções utilizando água ultrapura ou destilada conforme instruções do fabricante e homogeneizar bem.
¶ Realização do ensaio
- Para realização dos ensaios de ELISA devem ser consideradas as orientações do fabricante do kit de diagnóstico utilizado. Atentar para ocorrência de atualização na bula do kit, principalmente em mudanças de lote;
- A ordem de execução das etapas do ensaio, duração, volumes utilizados e temperatura de incubação variam de acordo com fabricante do kit utilizado;
- Homogeneizar gentilmente todos reagentes e amostras antes do uso;
- Utilizar ponteiras distintas para cada controle e amostra de soro;
- Homogeneizar as placas tocando-as na lateral ou utilizando um agitador de placas;
- Nas etapas de incubação, as placas devem ser seladas para se evitar evaporação;
- As placas devem ser lavadas com a solução indicada pelo kit. Após a última lavagem remover resíduos em um material absorvente (papel toalha ou toalha). Deixar as placas secas o mínimo de tempo possível entre a lavagem e adição do próximo reagente; e
- Decorridas todas as etapas do teste, realizar a leitura da absorbância na leitora de ELISA utilizando filtro com comprimento de onda indicado nas instruções do fabricante.
¶ Critérios de aceitação do Ensaio
O resultado do ensaio será considerado válido somente se as DOs dos soros controles estiverem dentro dos limites aceitáveis e determinados pelo fabricante. Caso contrário, o ensaio deve ser repetido.
¶ Interpretação dos resultados
De acordo com as DOs obtidas consideram-se os resultados como não reagente ou reagente.
¶ Emissão dos resultados
Os resultados deverão ser emitidos e expresso como, REAGENTE, NÃO REAGENTE, ou de acordo com o preconizado com o fabricante do insumo (kit de diagnóstico).
¶ Descarte de Amostras e Resíduos
- Antes da realização do descarte de amostras e produtos de ensaio deverão ser observados os prazos mínimos estabelecidos no item Retenção de Itens de Ensaio
- Todo material utilizado na realização do ensaio deve ser imerso em cuba com solução de ácido cítrico 0,2%, hipoclorito de sódio 0,5% ou solução para descontaminação similar, por no mínimo de 1 hora;
- Após este período, todo o material utilizado na realização do ensaio deve ser submetido ao processo de autoclavação apropriado e validado. A efetividade de esterilização deve estar comprovada em procedimentos próprios do laboratório;
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo processo de descarte.
¶ Retenção de itens de ensaio
¶ Soro sanguíneo
Poderão ser descartados 60 dias após a emissão do relatório de ensaio, registrando-se nos formulários próprios e conferindo antes do descarte.
¶ Amostras positivas de qualquer origem
Devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo as mesmas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
¶ B. Virusneutralização para detecção de anticorpos para o TGEV
¶ Materiais
- Luvas para procedimentos;
- Pipetas de vidro graduadas ou descartáveis;
- Provetas graduadas;
- Béqueres;
- Erlenmeyers;
- Frascos de vidro tipo penicilina com tampa;
- Ponteiras descartáveis;
- Descartador de ponteiras;
- Reservatórios para soluções (cubetas);
- Papel absorvente;
- Microplacas para cultivo celular em poliestireno cristal com 96 cavidades de fundo chato;
- Caneta para identificação de vidraria; e
- Cubas para descarte de materiais resistente à autoclavação.
¶ Equipamentos e instrumentos
- Autoclave;
- Cabine de segurança biológica, classe II B1 (requisito mínimo);
- Geladeira;
- Freezer;
- Estufa com atmosfera de CO2;
- Estufa;
- Banho seco ou que empregam água;
- Termômetros;
- Micropipetas mono e multicanais de volumes reguláveis;
- Pipetador automático ou manual;
- Agitador de tubos;
- Microscópio invertido;
- Balança analítica; e
- Centrífuga refrigerada.
¶ Insumos
- Suspensão da linhagem celular SK6 contendo 300.000 células/mL e 10% de soro fetal bovino.
- Meio MEM (Meio Essencial Mínimo, reconstituído de acordo com o fabricante);
- Soro fetal bovino (SFB) livre de pestivírus (BVDV) e micoplasma;
- Solução de antibióticos e antifúngicos;
- Anticorpo reagente e não reagente para o TGEV; e
- Suspensão do vírus da Gastroenterite Transmissível Suína (TGEV).
¶ Soluções
- Meio MEM com adição de antimicrobianos;
- Solução de salina 0,15 mol/L %;
- Ácido cítrico 0,2 %;
- Solução salina 0,85 % fosfatada tamponada (PBS) pH 7,2-7,4; e
- Solução de antibióticos e antifúngicos.
¶ Realização do ensaio
¶ Método quantitativo
- Adicionar 25 µL de MEM na linha A (controle de toxidez, caso não tenha sido ainda avaliado);
- Adicionar 25 µL de MEM nas linhas C a H;
- Distribuir as amostras e controles como descrito no QUADRO 1;
- Adicionar 25 µL de soro na linha A (controle de toxidez);
- Adicionar 50 µL de soro puro na linha B;
- Transferir 25 µL do soro puro da linha B para C, e assim sucessivamente até a linha H. Ao final descartar 25 µL (a diluição inicial na linha B será ½ após adição do vírus);
- Preparar as colunas referentes aos controles conforme Controles.
QUADRO 1 - Distribuição das amostras e controles.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | Log | Diluição | |
| A | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | CC | CC | CC | - | TX |
| B | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | CC | CC | CC | 0,3 | 1:2 |
| C | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | CC | CC | CC | 0,6 | 1:4 |
| D | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | CC | CC | CC | 0,9 | 1:8 |
| E | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | CC | CC | CC | 1,2 | 1:16 |
| F | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | CC | CC | CC | 1,5 | 1:32 |
| G | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | CC | CC | CC | 1,8 | 1:64 |
| H | 1 | 2 | 3 | 4 | CN | CP | -1 | -2 | -3 | CC | CC | CC | 2,1 | 1:128 |
| RT | ||||||||||||||
¶ Controles
- Utilizar uma coluna para o soro controle negativo (CN) e uma coluna para o soro controle positivo (CP). Adicionar o MEM e os soros controle em cada uma das colunas conforme descrito no método quantitativo, sem avaliação da toxidez;
- Para o controle de retrotitulação viral (RT), adicionar 25 µL de MEM nas três colunas destinadas à retrotitulação; e
- Para o controle de células (CC), adicionar 50 µL de MEM. Reservar, pelo menos, uma coluna como controle de células. Nessa coluna não deve ser adicionado vírus ou soro.
¶ Diluição de trabalho (DT) do vírus, incubação e adição da suspensão celular
- Retirar um criotubo do vírus do ultrafreezer. Diluir o vírus de acordo com o título para que no ensaio sejam utilizados aproximadamente 100 TCID50/25 µL.
- Utilizar um vírus de título conhecido. A partir do título, obter a diluição de trabalho (DT) diminuindo-se 102 do título.
- Registrar os cálculos da diluição;
- A partir da diluição de trabalho, preparar diluições 1/10 (10-1), 1/100 (10-2) e 1/1.000 (10-3) utilizando MEM. Essas três diluições serão chamadas de retrotitulação (10-1, 10-2 e 10-3)
- Adicionar 25 µL da suspensão viral diluída (1/10, 1/100 e 1/1.000) em cada um dos poços das colunas destinadas à retrotitulação (uma coluna por diluição), começando pela suspensão mais diluída, desta maneira pode-se utilizar o mesmo reservatório e as mesmas ponteiras;
- Adicionar 25 µL da DT em todos os poços da placa, exceto nos destinados ao controle de toxidez, retrotitulação e controle de células.
- Incubar as placas em estufa a 37 ºC com 5% de CO2 durante uma hora.
- Distribuir 100 µL de suspensão celular a 300.000 células/mL com 10% SFB em todos os poços da placa, inclusive em todos os controles, iniciando-se pela coluna referente ao controle de células.
- Incubar as placas por 48 a 72 horas em estufa a 37 ºC com 5% de CO2; e
- Realizar a leitura em microscópio invertido e registrar, utilizando:
- + para indicar presença de efeito citopático (ECP);
- (-) para indicar ausência de ECP;
- TX para indicar toxidez do soro;
- C para indicar contaminação.
Nota 1: Exemplo prático de diluição para o item 2.
Exemplo para fazer 20mL de DT, a partir de vírus com título de 104,5
Vírus com título de 104,5 - 102,0 = 102,5 ou 1/316.
Realizar duas diluições em base 10 (10-1 e 10-2);
Ci x Vi = Cf x Vf
1/100 x Vi = 1/316 x 20 (Vf)
Vi = 20 x 100/316 = 6,3 mL da diluição 1/100 (10-2) e 13,7 mL de MEM
¶ Critérios de aceitação da Prova
- Avaliar os resultados dos controles para considerar o ensaio válido;
- Soros controles apresentando resultados dentro do comportamento esperado: REAGENTE com ausência de efeito citopático de acordo com o título conhecido e NÃO REAGENTE apresentando efeito citopático, o ensaio é considerado válido;
- A prova estará válida quando a retrotitulação do vírus de prova na diluição de trabalho apresentar dose infectante de 100 TCID50/25 μL, aceitando-se a variação de 31 a 316 TCID50/25 μL; e
- Controle de células apresentando tapete íntegro em todos os poços isentos de contaminação ou toxidez.
¶ Interpretação dos resultados
- Deve-se considerar como título o inverso da diluição em que foi observado 50% de neutralização. Esses valores devem ser convertidos em log base 10.
- Para ser considerado negativo, o soro não deve gerar nenhuma neutralização na menor diluição testada (ou seja, soro puro, equivalente a uma diluição de ½ na etapa de neutralização). Ocorrendo neutralização em, pelo menos, uma diluição, o soro é considerado positivo.
- A amostra será considerada tóxica quando se observar a ausência de multiplicação celular, ou destruição das células por componentes do soro no poço de controle de toxidez. Geralmente é caracterizada pela sedimentação do cultivo semeado no fundo do poço.
- A amostra será considerada contaminada quando houve presença de contaminação bacteriana ou por fungos impedindo a interpretação do resultado.
- O título neutralizante se expressa pela recíproca da diluição mais alta do soro em que houve inibição da replicação viral em 50% dos poços (QUADRO 2).
QUADRO 2 - Título neutralizante expresso pela recíproca da diluição mais alta do soro em que houve inibição da replicação viral em 50% dos poços.
|
Diluição |
Título |
Transformação logarítmica |
Poço |
|
½ |
2 |
0,3 |
B |
|
¼ |
4 |
0,6 |
C |
|
1/8 |
8 |
0,9 |
D |
|
1/16 |
16 |
1,2 |
E |
|
1/32 |
32 |
1,5 |
F |
|
1/64 |
64 |
1,8 |
G |
|
1/128 |
>=128 |
2,1 |
H |
¶ Emissão dos resultados
Os resultados deverão ser emitidos e expressos como, REAGENTE, NÃO REAGENTE, TÓXICO ou CONTAMINADO. Caso a amostra seja considerada reagente, deve ser descrito o valor do título final, que é expresso como o logaritmo da diluição em que houve 100% de Virusneutralização.
¶ Descarte de Amostras e Resíduos
- Antes da realização do descarte de amostras e produtos de ensaio deverão ser observados os prazos mínimos estabelecidos. Retenção de Itens de Ensaio
- Todo material utilizado na realização do ensaio deve ser imerso em cuba com solução de ácido cítrico 0,2%, hipoclorito de sódio 0,5% ou solução para descontaminação similar, por no mínimo de 1 hora;
- Após este período, todo o material utilizado na realização do ensaio deve ser submetido ao processo de autoclavação apropriado e validado. A efetividade de esterilização deve estar comprovada em procedimentos próprios do laboratório; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo processo de descarte.
¶ Retenção de itens de ensaio
¶ Soro sanguíneo
Poderão ser descartados 60 dias após a emissão do relatório de ensaio, registrando-se nos formulários próprios e conferindo antes do descarte.
¶ Amostras positivas de qualquer origem
Devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo elas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
¶ C. Técnica de PCR convencional com transcrição reversa RT-PCR detecção de TGEV
¶ Materiais
- Luvas de procedimento nitrílica ou de látex isentas de pó;
- Pipetas graduadas;
- Microtubos de volumes variados ou microplacas;
- Ponteiras com filtro, estéreis, livres de DNAses e RNAses;
- Estantes para microtubos; e
- Gaze ou papel toalha.
¶ Equipamentos e instrumentos
- Autoclave;
- Cabine de segurança biológica com filtro HEPA classe II (requisito mínimo) ou estação de trabalho para PCR (Workstation PCR) com luz UV germicida;
- Geladeira;
- Freezer;
- Micropipetas mono e multicanais de volumes reguláveis;
- Pipetador automático ou manual;
- Termociclador;
- Balança de precisão;
- Centrífuga refrigerada com rotores para microtubos;
- Agitador de microtubos;
- Micro-ondas;
- Cuba e fonte para eletroforese;
- Microcomputador;
- Sistema de fotodocumentação; e
- Equipamento para extração automatizada de ácidos nucleicos (opcional).
¶ Insumos
- Água livre de nucleases;
- Oligonucleotídeos para RT-PCR (QUADRO 3);
- Controle DETECTADO para o vírus da TGEV (sempre utilizar RNA viral para averiguar eficiência da transcrição reversa);
- Kit de RT-PCR;
- Kit de extração de RNA (automática);
- Trizol (manual); e
- Recomenda-se o uso de reações de passo único (one step) para síntese e amplificação de cDNA no mesmo tubo.
QUADRO 3: Sugestão de oligonucleotídeos para RT-qPCR e RT-PCR para detecção e sequenciamento genético de TGEV.
|
Oligonucleotídeo |
Tipo de PCR |
Sequência |
Referência |
| TGEV.ISU.SP.143.F | RT-qPCR | AACCATAAGTTCCCTATATGTCCTT | Hartman, 1997 |
| TGEV.ISU.SP.143.R | CCAGACCATTGATTTTCAAAACTAATAC | ||
| TGEV.ISU.SP.143.S | TET-CACCATGTAAATAAGCAACAA-MGB/NFQ | ||
| TGEV.ISU.NP.93.F | RT-qPCR | TTGTCTGGGTTGCCAAGGAT | Hartman, 1997 |
| TGEV.ISU.NP.93.R | CATCGAATTTCAAAGCTTTGGATT | ||
| TGEV.ISU.NP.93.S | FAM-CCACGACTACCAAGCGT-MGB/NFQ | ||
| TGEV.ISU.600.F | RT-PCR | GCAACAATCCAATAACAAGAAGG | Hartman, 1997 |
| TGEV.ISU.600.R | ACCTCATCAATCATCTCAACCTG | ||
| TGEV.ISU.200/800.F | GTAAAAACATTAGCCACATA | ||
| TGEV.ISU.200/800.R | AGGGTAAGTTGCTCATTAG |
¶ Soluções
- Solução de Álcool 70%; e
- Solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses.
¶ Realização do ensaio
¶ Extração de RNA
- A extração pode ser realizada de forma automatizada ou manual, através de kits de extração de RNA ou reagentes específicos para o tipo de material a ser analisado, seguindo as recomendações do fabricante;
- Não utilizar reagentes após a data de validade e não misturar reagentes de lotes diferentes; e
- Adicionar as seguintes amostras controle a cada procedimento de extração: controle NÃO DETECTADO (água ou tecido bovino ou suíno).
¶ Reação de amplificação de ácido nucleico (RT-PCR)
- Realizar o ensaio em duas áreas separadas: uma para o preparo do mix de reação (sala de pré-PCR), isenta de material genético e amplicons, e outra para a transferência de DNA para placa ou microtubos (sala de PCR);
- Antes e após o preparo do mix de reação, descontaminar a cabine e os materiais a serem utilizados com Solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses e/ou Álcool 70%; e
- As micropipetas utilizadas para o preparo do mix de reação e adição das amostras devem ser exclusivas para tais finalidades.
¶ Preparo do mix de reação
- Preparar o mix de reação de acordo com protocolos validados e específicos para o agente pesquisado (vírus da TGE), em quantidade suficiente para o número de amostras a serem testadas, considerando algumas a mais;
- Adicionar o mix de reação a cada poço da microplaca (ou microtubos); e
- Devem ser incluídos nas análises:
- Controle DETECTADO para TGEV;
- Controle NÃO DETECTADO da extração; e
- Branco (água livre de nucleases).
¶ Reação de RT-PCR
- Após o preparo do mix, adicionar o RNA nos poços da placa ou em microtubos identificados com a numeração da amostra a ser testada; e
- Realizar a amplificação em termociclador certificado, conforme as especificações de temperatura do protocolo utilizado.
¶ Eletroforese
- Preparar o gel de agarose em concentração adequada ao protocolo de PCR utilizado. Adicionar um corante para ácidos nucleicos em proporção suficiente para visualização das bandas;
- Para a corrida das amostras, adicionar tampão de carregamento (loading buffer) ao produto de PCR;
- Aplicar marcador de peso molecular em um dos poços do gel;
- Realizar a corrida em cuba de eletroforese, utilizando o tempo e a voltagem adequados para o volume do gel e o protocolo de PCR utilizado; e
- Visualizar o gel sob luz ultravioleta, fotografar com o auxílio de um fotodocumentador e analisar o resultado.
¶ Critérios de aceitação da prova
- As amostras de controle DETECTADO para TGEV devem apresentar bandas de tamanhos correspondentes aos amplicons do protocolo utilizado; e
- As amostras de controle NÃO DETECTADO (controle NÃO DETECTADO da extração e branco) não devem apresentar bandas de amplificação.
¶ Interpretação dos resultados
- Comparar os resultados das amostras testadas ao das amostras controle, a fim de classificá-las como positivas ou negativas;
- O limiar de Cq a ser considerado DETECTADO deve ser avaliado conforme definido na verificação desempenho da técnica ou conforme consta a literatura;
- A leitura das bandas deve ser clara e livre de amplicons inespecíficos para o teste ser considerado satisfatório; e
- Qualquer amostra questionável deverá ser retestada.
¶ Emissão dos resultados
- Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”; e
- Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
¶ Descarte das amostras e Resíduos
- Após um período mínimo de 90 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
- Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
¶ D. Técnica de PCR em tempo real com transcrição reversa - RT-qPCR para detecção do TGEV
¶ Materiais
- Luvas de procedimento nitrílica ou de látex isentas de pó;
- Microtubos de volumes variados ou microplacas;
- Microplacas ou microtubos para leitura óptica de RT-qPCR;
- Tampas adesivas para microplacas para leitura óptica de RT-qPCR;
- Ponteiras com filtro, estéreis, livres de DNAses e RNAses;
- Estantes para microtubos; e
- Gaze ou papel toalha.
¶ Equipamentos e instrumentos
- Autoclave;
- Cabine de segurança biológica com filtro HEPA classe II (requisito mínimo) ou estação de trabalho para PCR (Workstation PCR) com luz UV germicida;
- Geladeira;
- Freezer;
- Micropipetas mono e multicanais de volumes reguláveis;
- Termociclador para PCR em tempo real;
- Centrífuga refrigerada com rotores para microtubos;
- Agitador de microtubos;
- Microcomputador; e
- Equipamento para extração automatizada de ácidos nucleicos (opcional).
¶ Insumos
- Água livre de nucleases;
- Kit específico de RT-qPCR para detecção de TGEV;
- Controle DETECTADO para TGEV (sempre utilizar RNA viral para averiguar eficiência da transcrição reversa);
- Kit de extração de RNA (automática);
- Trizol (manual); e
- Recomenda-se o uso de kits com reações de passo único (one step) para síntese e amplificação de cDNA no mesmo tubo.
¶ Soluções
- Solução de Álcool 70%; e
- Solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses.
¶ Realização do ensaio
¶ Extração de RNA
- A extração pode ser realizada de forma automatizada ou manual, através de kits de extração de RNA ou reagentes específicos para o tipo de material a ser analisado, seguindo as recomendações do fabricante;
- Não utilizar reagentes após a data de validade e não misturar reagentes de lotes diferentes; e
- Adicionar as seguintes amostras controle a cada procedimento de extração: controle NÃO DETECTADO (água ou tecido bovino ou suíno).
¶ Reação de amplificação de ácido nucleico por RT-qPCR
- Realizar o ensaio em duas áreas separadas: uma para o preparo do mix de reação (sala de pré-PCR) isenta de material genético e amplicons, e outra para a transferência de DNA para placa ou microtubos (sala de PCR);
- Antes e após o preparo do mix de reação, descontaminar a cabine e os materiais a serem utilizados com solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses e/ou álcool 70º INPM ; e
- As micropipetas utilizadas para o preparo do mix de reação e adição das amostras devem ser exclusivas para tais finalidades.
¶ Preparo do mix de reação
- Preparar o mix de reação de acordo com protocolos validados e específicos para o agente pesquisado (vírus da TGEV), em quantidade suficiente para o número de amostras a serem testadas, considerando algumas a mais;
- Após o preparo do mix, adicionar o RNA nos poços da placa ou em microtubos para leitura óptica;
- A adição de DNA e das amostras controle deve ser realizada em uma área distinta do preparo do mix (sala de PCR);
- Devem ser incluídos nas análises:
- Controle DETECTADO para TGE;
- Controle NÃO DETECTADO da extração;
- Branco (água livre de nucleases); e
- Controle DETECTADO e NÃO DETECTADO do kit utilizado (se houver).
¶ Reação de RT-qPCR
- Selar a placa com adesivo óptico ou fechar a tampa dos microtubos. Verificar se há bolhas no fundo do poço e/ou gotículas na parede dos poços da placa ou tubo. Caso isto ocorra, centrifugar brevemente para reduzir as bolhas e para que o conteúdo se posicione na parte inferior da placa ou tubo;
- Iniciar e entrar com os dados no software do termociclador (identificação das amostras e seleção dos fluoróforos), conforme especificações do fabricante;
- Inserir a placa ou os tubos no termociclador, salvar o arquivo e iniciar a corrida; e
- Ao finalizar, salvar os dados e interpretar os resultados.
¶ Critérios de aceitação da prova
- Para a validação do ensaio, o controle DETECTADO deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório; e
- O controle NÃO DETECTADO deve ter Cq indeterminado ou maior que o limite do kit. O gráfico do controle NÃO DETECTADO deve apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
¶ Interpretação dos resultados
- Ao analisar os resultados da corrida, o operador deve avaliar os seguintes componentes: controle DETECTADO, controle NÃO DETECTADO, controle da extração, background de fluorescência e gráficos de amplificação de cada amostra individualmente. Após a validação do ensaio, interpretar os resultados conforme especificações do fabricante;
- Os resultados devem ser positivos para TGEV.ISU.NP e TGEV.ISU.SP para ser positivo para TGEV. Positivo apenas para FAM é sugestivo de PRCV;
- O limiar de Cq a ser considerado DETECTADO deve ser avaliado conforme definido na verificação desempenho da técnica ou conforme consta a literatura;
- Qualquer amostra questionável deverá ser retestada; e
- Amostras positivas devem ser submetidas a sequenciamento para genotipagem viral.
¶ Emissão dos resultados
- Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO” ou “NÃO DETECTADO”; e
- Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
¶ Descarte das amostras e Resíduos
- Após um período mínimo de 90 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
- Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
¶ 4.5 DIARREIA EPIDÊMICA DOS SUÍNOS – PED
¶ 4.5.1 Amostras
São consideradas amostras para o diagnóstico da DIARREIA EPIDÊMICA DOS SUÍNOS (PED)
Identificação do Agente
- Fezes;
- Intestino delgado.
¶ 4.5.2. Recebimento das Amostras
4.5.2.1. Para atendimento aos Programas e Controles Oficiais do MAPA os Laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
4.5.2.2. Deverão ser obedecidos aos critérios estabelecidos no capítulo de verificação de conformidade de amostras.
¶ 4.5.3. Técnicas de Diagnóstico
4.5.3.1. Somente poderão ser utilizados insumos de diagnóstico que tenham registro no MAPA, segundo legislação em vigor;
4.5.3.2 Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados;
4.5.3.3. O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos
a) Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente
b) Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 e 25ºC.
4.5.3.4. Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados;
4.5.3.5. O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios;
4.5.3.6. Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada;
4.5.3.7. Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório;
Nota: a utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitido quando:
I. A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos.
II. As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes.
III. O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
Técnica de PCR em tempo real com transcrição reversa - RT-qPCR para detecção do PEDV
¶ Equipamentos e instrumentos
- Autoclave;
- Cabine de segurança biológica com filtro HEPA classe II (requisito mínimo) ou estação de trabalho para PCR (Workstation PCR) com luz UV germicida;
- Geladeira;
- Freezer;
- Micropipetas mono e multicanais de volumes reguláveis;
- Termociclador para PCR em tempo real;
- Centrífuga refrigerada com rotores para microtubos;
- Agitador de microtubos;
- Microcomputador; e
- Equipamento para extração automatizada de DNA (opcional).
¶ Insumos
- Água livre de nucleases
- Iniciadores e sondas descritos no QUADRO 1
- Master mix para PCR em tempo real
- Controle DETECTADO para o vírus da PED (Material genético extraído do alvo ou controle sintético); e
- Kits de detecção do vírus da Diarréia Epidêmica dos Suínos (PEDv) - PCR.
QUADRO 1 - Sugestão de Oligonucletídeos para reação de PCR em tempo real com transcrição reversa - RT-qPCR para detecção do Virus da PED
|
Oligonucleotídeo |
Sequência |
Referência |
|
PEDV.Lowe2014.198.F |
CGCAAAGACTGAACCCACTAACCT |
Lowe J., 2014 |
|
PEDV.Lowe2014.198.R |
TTGCCTCTGTTGTTACTTGGAGAT |
Lowe J., 2014 |
|
PEDV.Lowe2014.198.S |
FAM-TGTTGCCATTACACCGACTCCTGC-ZEN/IowaBlack |
Lowe J., 2014 |
¶ Soluções
- Solução de álcool 70%; e
- Solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses.
¶ Realização do ensaio
¶ Extração de RNA
- A extração pode ser realizada de forma automatizada ou manual, através de kits de extração de RNA ou reagentes específicos para o tipo de material a ser analisado, seguindo as recomendações do fabricante;
- Não utilizar reagentes após a data de validade e não misturar reagentes de lotes diferentes; e
- Adicionar as seguintes amostras controle a cada procedimento de extração: controle NÃO DETECTADO (água ou tecido suíno).
¶ Reação de amplificação de ácido nucleico (RT-qPCR)
- Realizar o ensaio em duas áreas separadas: uma para o preparo do mix de reação (sala de pré-PCR), isenta de material genético e amplicons, e outra para a transferência de DNA para placa ou microtubos (sala de PCR);
- Antes e após o preparo do mix de reação, descontaminar a cabine e os materiais a serem utilizados com solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses e/ou álcool 70º INPM; e
- As micropipetas utilizadas para o preparo do mix de reação e adição das amostras devem ser exclusivas para tais finalidades.
¶ Preparo do mix de reação
- Preparar o mix de reação de acordo com protocolos validados e específicos para o agente pesquisado (vírus da PED) em quantidade suficiente para o número de amostras a serem testadas, considerando algumas a mais;
- Adicionar o mix de reação a cada poço da microplaca (ou microtubos); e
- Devem ser incluídos nas análises:
- Controle DETECTADO para PED;
- Controle NÃO DETECTADO da extração;
- Branco (água livre de nucleases).
¶ Reação de RT - qPCR
1 - Após o preparo do mix, adicionar o RNA nos poços da placa ou em microtubos identificados com a numeração da amostra a ser testada,
2 - Realizar a amplificação em termociclador certificado, conforme as especificações de temperatura do protocolo utilizado.
¶ Critérios de aceitação da prova
- Para a validação do ensaio, o controle DETECTADO deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório; e
- O controle NÃO DETECTADO deve ter Cq indeterminado ou maior que o limite do kit. O gráfico do controle NÃO DETECTADO deve apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
¶ Interpretação dos resultados
- Ao analisar os resultados da corrida, o operador deve avaliar os seguintes componentes: controle DETECTADO, controle NÃO DETECTADO, controle da extração, background de fluorescência e gráficos de amplificação de cada amostra individualmente. Após a validação do ensaio, interpretar os resultados conforme especificações do fabricante;
- O limiar de Cq a ser considerado DETECTADO deve ser avaliado conforme definido na verificação desempenho da técnica ou conforme consta a literatura;
- Qualquer amostra questionável deverá ser retestada; e
- Amostras positivas devem ser submetidas a sequenciamento para genotipagem viral.
¶ Emissão dos resultados
- Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO” ou “NÃO DETECTADO”; e
- Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
¶ Descarte das amostras e Resíduos
- Após um período mínimo de 90 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
- Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
¶ 4.6 SENECAVIRUS A - SVA
¶ 4.6.1.Amostras
São consideradas amostras para o diagnóstico do Senecavirus A
Detecção da Resposta Imune
Soro sanguíneo.
Identificação do Agente
- Epitélio;
- Líquido de vesículas; e
- Suabe de vesículas rompidas.
¶ 4.6.2. Recebimento das Amostras
4.6.2.1. Para atendimento aos Programas e Controles Oficiais do MAPA os Laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
4.6.2.2. Deverão ser obedecidos aos critérios estabelecidos no capítulo de verificação de conformidade de amostras.
¶ 4.6.3. Técnicas de Diagnóstico
4.6.3.1. Somente poderão ser utilizados insumos de diagnóstico que tenham registro no MAPA, segundo legislação em vigor;
4.6.3.2. Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados;
4.6.3.3. O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos
a) Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente
b)Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 e 25ºC.
4.6.3.4. Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados;
4.6.3.5. O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios;
4.6.3.6. Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada;
4.6.3.7. Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório;
Nota: Utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitido quando:
I. A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos.
II. As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes.
III. O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
¶ A. Teste de Virusneutralização - VN
¶ Materiais
- Luvas para procedimentos;
- Pipetas de vidro graduadas ou descartáveis;
- Provetas graduadas;
- Béqueres;
- Erlenmeyers;
- Frascos de vidro tipo penicilina com tampa;
- Ponteiras descartáveis;
- Descartador de ponteiras;
- Reservatórios para soluções (cubetas);
- Algodão hidrófilo;
- Microplacas para cultivo celular em poliestireno cristal com 96 cavidades de fundo chato;
- Caneta para identificação de vidraria; e
- Cubas para descarte de materiais resistente à autoclavação.
¶ Equipamentos e Instrumentos
- Autoclave;
- Cabine de segurança biológica classe II B1 (requisito mínimo);
- Geladeira;
- Ultrafreezer;
- Estufa com atmosfera de CO2;
- Banho seco ou que empregam água;
- Termômetros;
- Micropipetas mono e multicanais de volumes reguláveis;
- Pipetador automático ou manual;
- Agitador de tubos;
- Microscópio invertido; e
- Centrífuga refrigerada.
¶ Insumos
- Suspensão celular de linhagem sensível (NCI-H1299);
- Meio MEM (Meio Essencial Mínimo, reconstituído de acordo com o fabricante);
- Soro fetal bovino (SFB) livre de pestivirus (BVDV) e micoplasma;
- Solução de antibióticos e antifúngicos; e
- Cepa de SVA.
¶ Soluções
- Meio MEM com piruvato com 5% de soro fetal bovino e antimicrobianos (anexo 008);
- Solução de salina 0,15 mol/L % (anexo 008); e
- Soros controles reagente e não reagente do SVA.
¶ Realização do ensaio
¶ Método quantitativo
- Avaliar a toxidez apenas se o soro não tiver sido testado em outro ensaio de neutralização viral.
- Antes de pipetar as amostras de soro, homogeneizar com auxílio de agitador de tubos ou fazer movimentos de inverter os microtubos;
- Adicionar 93,75 µL de MEM e 6,25 µL de soro na linha A (controle de toxidez).
- Adicionar 87,5 µL de MEM e 12,5 µL de soro na linha B (diluição inicial 1/8 e final 1/16). Cada amostra de soro deve ser adicionada a uma coluna da placa;
- Adicionar 50 µL de MEM nas linhas C a H;
- Distribuir as amostras, controles e retrotitulação conforme o QUADRO 1.
- Homogeneizar as amostras e transferir 50 µL MEM/soro da linha B para C, e assim sucessivamente até a linha H. Ao final descartar 50 µL.
- Em caso de a toxidez já ter sido avaliada, iniciar o ensaio na linha A conforme descrito acima (Adicionar 87,5 µL de MEM e 12,5 µL de soro);
- Preparar as colunas referentes aos controles negativo e positivo, com o mesmo procedimento adotado para as amostras testes;
- Retirar um criotubo do SVA do ultrafreezer, o qual já deverá ter sido titulado pelo método de Reed-Muenchen. Este método será também empregado na titulação da diluição de trabalho do vírus (retrotitulação);
- Diluir o vírus de acordo com o título para que no ensaio sejam utilizados aproximadamente 100 TCID50/50 μL (DT- diluição de trabalho);
- A partir da diluição de trabalho, preparar diluições da retrotitulação (RT) conforme descrito no item da “Retrotitulação” e distribuir 50 µL das diluições nas colunas indicadas no QUADRO 1;
- Utilizar uma coluna para o soro controle NÃO DETECTADO (CN) e uma coluna para o soro controle DETECTADO (CP). Adicionar o MEM e os soros controle em cada uma das colunas, conforme descrito para diluição das amostras de soro que estão sendo testadas sem toxidez;
- Para o controle de células (CC), adicionar 100 µL de MEM. Reservar, pelo menos uma coluna como controle de células. Nessa coluna não deve ser adicionado vírus ou soro;
- Adicionar 50 µL da DT em todos os poços da placa, exceto nos destinados ao controle de toxidez, controle de células e retrotitulação;
- Incubar as placas em estufa a 37 ºC durante uma hora;
- Distribuir 100 µL de suspensão celular a 225.000 células/mL em todos os poços da placa, inclusive em todos os controles;
- Incubar as placas por aproximadamente 48 a 72 horas a 37 ºC;
- Realizar a leitura em microscópios invertido e registrar os resultados.
QUADRO 1 – Localização das amostras, controles e retrotitulação na placa
|
|
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
8 |
9 |
10 |
11 |
12 |
Log |
Diluição |
|
A |
1 |
2 |
3 |
4 |
CN |
CP |
-1 |
-2 |
-3 |
CC |
CC |
CC |
TX |
TX |
|
B |
1 |
2 |
3 |
4 |
CN |
CP |
-1 |
-2 |
-3 |
CC |
CC |
CC |
1,2 |
1/16 |
|
C |
1 |
2 |
3 |
4 |
CN |
CP |
-1 |
-2 |
-3 |
CC |
CC |
CC |
1,5 |
1/32 |
|
D |
1 |
2 |
3 |
4 |
CN |
CP |
-1 |
-2 |
-3 |
CC |
CC |
CC |
1,8 |
1/64 |
|
E |
1 |
2 |
3 |
4 |
CN |
CP |
-1 |
-2 |
-3 |
CC |
CC |
CC |
2,1 |
1/128 |
|
F |
1 |
2 |
3 |
4 |
CN |
CP |
-1 |
-2 |
-3 |
CC |
CC |
CC |
2,4 |
1/256 |
|
G |
1 |
2 |
3 |
4 |
CN |
CP |
-1 |
-2 |
-3 |
CC |
CC |
CC |
2,7 |
1/512 |
|
H |
1 |
2 |
3 |
4 |
CN |
CP |
-1 |
-2 |
-3 |
CC |
CC |
CC |
3,0 |
1/1.028 |
|
|
RT |
|
||||||||||||
¶ Retrotitulação
- A retrotitulação deve ser feita em uma das placas do ensaio. O QUADRO 1 apresenta o modelo de distribuição das diluições obtidas a partir da diluição de trabalho;
- Preparar três diluições do vírus em base 10 a partir da diluição de trabalho (DT) realizar diluições em base 10 (10-1 10-2 e 10-3);
- Adicionar 50 μL de MEM em três colunas de uma microplaca, conforme indicado no QUADRO 1;
- Adicionar 50 μL de cada uma das diluições do vírus em uma coluna, começando pelo vírus mais diluído, de forma que possam ser utilizadas as mesmas ponteiras e o mesmo reservatório para todas as diluições do vírus; e
- Ao final do ensaio calcular o título pelo método de Reed-Muenchen com base na presença ou ausência de crescimento viral nas colunas inoculadas com as diluições do vírus.
¶ Critérios de aceitação da Prova
- O título do soro controle DETECTADO deve ser superior a 64 (1,8);
- O soro controle NÃO DETECTADO deve apresentar título inferior a 64 (1,8);
- A amostra será considerada tóxica quando se observar a ausência de multiplicação celular, ou destruição das células por componentes do soro no poço de controle de toxidez. Geralmente é caracterizada pela sedimentação do cultivo semeado no fundo do poço.
- A amostra será considerada contaminada quando houve presença de contaminação bacteriana ou por fungos impedindo a interpretação do resultado;
- A prova estará válida quando a retrotitulação do vírus de prova na diluição de trabalho apresentar as doses infectantes dentro da variação 102±0.5, que corresponde a 31 a 316 TCID50/50 μL;
- Quando a retrotitulação do vírus de prova na diluição de trabalho apresentar título inferior a 101,5 poderão ser validados os resultados das amostras não reagentes, e do mesmo, retrotitulação com título superior a 102,5 poderão ser validados as amostras reagentes;
- Será considerada válida a prova em que os soros controle se apresentarem dentro do comportamento esperado:
- Soro controle REAGENTE, com ausência de efeito citopático (ECP) (Fig. 1 A);
- Soro controle NÃO REAGENTE, com presença de ECP (Fig. 1B);
- Controle de toxicidade: na presença de toxicidade as amostras devem ser reanalisadas por ELISA ou pelo método quantitativo;
- Controle de células apresentando tapete íntegro e todos os poços isentos de contaminação ou toxidez; e
- Se o resultado de um ou mais controles não atender aos critérios estabelecidos, os ensaios deverão ser repetidos. Estando em conformidade, avaliar o resultado das amostras.
¶ Interpretação dos resultados
- O título de um soro é expresso pelo denominador da mais alta diluição em que houve neutralização completa dos ECP do vírus em 50% dos poços, no caso do ensaio realizado em duas colunas, ou no poço que não houve ECP no caso de ensaio realizado com uma coluna. Se houver neutralização apenas na amostra não diluída solicitar nova colheita, pelo menos, oito dias após a primeira colheita.
- Soro controle REAGENTE – amostra em que houve de neutralização viral traduzida pela ausência de efeito citopático (ECP) a partir do título 64 (1,8);
- Soro controle NÃO REAGENTE – amostra em que não houve de neutralização viral traduzida pela presença de efeito citopático (ECP) no título inferior a 64 (1,8);
- A amostra será considerada tóxica quando se observar a ausência de multiplicação celular, ou destruição das células por componentes do soro no poço de controle de toxidez. Geralmente é caracterizada pela sedimentação do cultivo semeado no fundo do poço. Na presença de toxicidade as amostras devem ser reanalisadas por ELISA ou pelo método quantitativo.
- Amostra contaminada - a amostra será considerada contaminada quando se observar o crescimento bacteriano ou fúngico no poço amostra processada.
FIGURA 1 – Cultivo de células NCI 1299 sem ECP (1A) e com a presença de ECP (1B) causado pelo SVA.
¶ Emissão dos resultados
Os resultados deverão ser emitidos e expresso como, REAGENTE, NÃO REAGENTE. Caso a amostra seja considerada reagente, deve ser descrito a valor do título final, que é expresso como o logaritmo da diluição em que houve 100% de neutralização viral (QUADRO 2).
QUADRO 2 - Título neutralizante expresso pela recíproca da diluição mais alta do soro em que houve inibição da replicação viral em 50% dos poços
|
Diluição |
Título |
Título Logarítmico |
|
1/16 |
16 |
1,2 |
|
1/32 |
32 |
1,5 |
|
1/64 |
64 |
1,8 |
|
1/128 |
128 |
2,1 |
|
1/256 |
256 |
2,4 |
|
1/512 |
512 |
2,7 |
|
1/1024 |
1024 |
3,0 |
|
1/2048 |
2048 |
>=3,3 |
¶ Descarte de Amostras e Resíduos
- Antes da realização do descarte de amostras e produtos de ensaio deverão ser observados os prazos mínimos estabelecidos Retenção de Itens de Ensaio
- Todo material utilizado na realização do ensaio deve ser imerso em cuba com solução de ácido cítrico 0,2%, hipoclorito de sódio 0,5% ou solução para descontaminação similar, por no mínimo de 1 hora;
- Após este período, todo o material utilizado na realização do ensaio deve ser submetido ao processo de autoclavação apropriado e validado. A efetividade de esterilização deve estar comprovada em procedimentos próprios do laboratório; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo processo de descarte.
¶ Retenção de itens de ensaio
¶ Soro sanguíneo
Poderão ser descartados 60 dias após a emissão do relatório de ensaio, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte.
¶ Amostras positivas de qualquer origem
Devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo as mesmas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
¶ B. Isolamento viral
¶ Materiais
- Luvas para procedimentos;
- Pipetas de vidro graduadas ou descartáveis;
- Provetas graduadas;
- Béqueres;
- Erlenmeyers;
- Placas de Petri;
- Frascos de vidro tipo penicilina com tampa;
- Tubo de centrífuga;
- Tubos de ensaio;
- Ponteiras descartáveis;
- Descartador de ponteiras;
- Reservatórios para soluções (cubetas);
- Papel absorvente;
- Microplacas para cultivo celular em poliestireno com 24 cavidades de fundo chato;
- Microplacas para cultivo celular em poliestireno com 96 cavidades de fundo chato;
- Caneta para identificação de vidraria;
- Cubas para descarte de materiais resistente à autoclavação;
- Areia estéril;
- Filtro para seringa (0,45 µm);
- Gral e Pistilo;
- Tesoura cirúrgica e bisturi; e
- Seringa descartável.
¶ Equipamentos e instrumentos
- Autoclave;
- Cabine de segurança biológica classe II A (requisito mínimo);
- Geladeira;
- Freezer;
- Estufa com atmosfera de CO2;
- Estufa;
- Banho seco ou que empregam água;
- Termômetros;
- Micropipetas mono e multicanais de volumes reguláveis;
- Pipetador automático ou manual;
- Agitador de tubos;
- Microscópio invertido
- Cronômetro;
- Balança analítica; e
- Centrífuga refrigerada.
¶ Insumos
- Suspensão celular de linhagem sensível (NCI-H1299);
- Meio MEM (Meio Essencial Mínimo, reconstituído de acordo com o fabricante);
- Soro fetal bovino (SFB), livre de pestivirus (BVDV) e micoplasma;
- Solução de antibióticos e antifúngicos – (anexo 0020); e
- Cepas do SVA.
¶ Soluções
- Meio MEM tradado com solução de antibióticos e antifúngicos;
- Ácido cítrico 0,2 %; e
- Solução de antibióticos e antifúngicos.
¶ Realização do ensaio
¶ Preparo das amostras
- Escolher os órgãos encaminhados, que serão submetidos à prova. Os órgãos de eleição para este ensaio são líquidos de vesículas, epitélio lingual. Utilizar aproximadamente 0,5 cm3 de cada tecido;
- Remover o excesso de tecido conjuntivo;
- Recortar e macerar os fragmentos de cada órgão preparando um pool para cada requisição, utilizando gral, pistilo e MEM tratado com solução antimicrobiana até que se forme uma pasta homogênea. Pode ser utilizada areia estéril como abrasivo se necessário.
- Completar o volume com MEM resultando em uma suspensão de aproximadamente 20 % (P/V);
- Centrifugar a 3000 rpm por 10 minutos;
- Colher o sobrenadante, filtrar e colocar em frasco devidamente identificado; descartar o precipitado;
- Adicionar 100 µL de solução antimicrobiana; e
- Encaminhar 400 µL de inóculo ou de fragmentos do tecido tratado com 1,0 mL de Trizol para diagnóstico molecular.
¶ Passagens em células (suspensão celular)
- Adicionar 100 µL do inóculo de macerado de tecidos em um poço da microplaca de 24 poços. Caso seja utilizada uma garrafa de 25 cm2 utilizar 0,5 mL de inóculo de macerado de tecidos;
- Acrescentar 0,5 mL de suspensão celular com 5 % de soro fetal bovino na concentração de 300.000 células/mL por poço da microplaca, ou 5 mL nas garrafas de 25 cm2
- Incubar a microplaca por 48 a 72 horas em estufa de CO2.
- Fazer a leitura e registrar os resultados. Os materiais em que for observada contaminação não deverão ser submetidos à segunda passagem.
- Congelar a microplaca e descongelar;
- Inocular o material da primeira passagem em microplaca de 24 poços ou garrafas de 25 cm2 , conforme descrito acima.
- Realizar a leitura dos cultivos por 48 a 72 horas em microscópio óptico. Amostras que apresentarem características de efeito citopático deverão ser encaminhadas para a confirmação por biologia molecular.
¶ Critérios de aceitação das provas
- As provas de identificação do agente serão consideradas válidas quando os cultivos celulares sabidamente infectados (controles DETECTADOs) apresentam efeito citopático (ECP) caracterizado pelo destacamento do cultivo celular e formação de células sinciciais e ausências de ECP nos cultivos que não foram infectados (controles NÃO DETECTADOS ou de células);
- Se o resultado de um ou mais controles não atender aos critérios estabelecidos, os ensaios deverão ser repetidos. Estando em conformidade, avaliar o resultado das amostras; e
- Na presença de ECP deverá ser realizada a confirmação do isolamento por método molecular.
¶ Interpretação dos resultados
- DETECTADO - presença de ECP nos cultivos infectados pelo SVA, Fig. (2B).
- NÃO DETECTADO – ausência de ECP nos cultivos celulares Fig. (2A).
- A amostra será considerada tóxica quando se observar a ausência de multiplicação celular, ou destruição das células por componentes do soro no poço de controle de toxidez. Geralmente é caracterizada pela sedimentação do cultivo semeado no fundo do poço; e
- A amostra será considerada contaminada quando houve presença de contaminação bacteriana ou por fungos impedindo a interpretação do resultado.
FIGURA 2 – Cultivo de células NCI-H1299 sem ECP (2A) causado pelo SVA e com a presença de ECP (2B).
¶ Emissão dos resultados
Os resultados deverão ser emitidos e expressos como, “DETECTADO” ou “NÃO DETECTADO” no isolamento viral do SVA.
¶ Descarte de Amostras e Resíduos
- Antes da realização do descarte de amostras e produtos de ensaio deverão ser observados os prazos mínimos estabelecidos. Retenção de Itens de Ensaio;
- Todo material utilizado na realização do ensaio deve ser imerso em cuba com solução de ácido cítrico 0,2%, hipoclorito de sódio 0,5% ou solução para descontaminação similar, por no mínimo de 1 hora;
- Após este período, todo o material utilizado na realização do ensaio deve ser submetido ao processo de autoclavação apropriado e validado. A efetividade de esterilização deve estar comprovada em procedimentos próprios do laboratório; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes durante todo processo de descarte.
¶ Retenção de itens de ensaio
Amostras positivas de qualquer origem devem ser armazenadas de forma permanente, incluindo todos os registros e documentação pertinente, devendo as mesmas serem registradas e controladas pelo laboratório responsável pela análise.
¶ C. Técnica de PCR convencional com transcrição reversa RT-PCR para detecção do SVA
¶ Materiais
- Luvas de procedimento nitrílicas ou de látex isentas de pó;
- Microtubos de volumes variados ou microplacas;
- Microplacas ou microtubos para leitura óptica de RT-qPCR;
- Tampas adesivas para microplacas para leitura óptica de RT-qPCR;
- Ponteiras com filtro, estéreis, livres de DNAses e RNAses;
- Estantes para microtubos; e
- Gaze ou papel toalha.
¶ Equipamentos e Instrumentos
- Autoclave;
- Cabine de segurança biológica com filtro HEPA classe II (requisito mínimo) ou estação de trabalho para PCR (Workstation PCR) com luz UV germicida;
- Geladeira;
- Freezer;
- Micropipetas mono e multicanais de volumes reguláveis;
- Termociclador para PCR em tempo real;
- Centrífuga refrigerada com rotores para microtubos;
- Agitador de microtubos;
- Microcomputador; e
- Equipamento para extração automatizada de ácidos nucleicos (opcional).
¶ Insumos
- Água livre de nucleases;
- Oligonucleotídeos para RT-PCR (QUADRO 3);
- Controle DETECTADO para o vírus da SVA (sempre utilizar RNA viral para averiguar eficiência da transcrição reversa);
- Kit de RT-PCR;
- Kit de extração de RNA (automática);
- Trizol (manual); e
- Recomenda-se o uso de reações de passo único (one step) para síntese e amplificação de cDNA no mesmo tubo.
¶ Soluções
- Solução de álcool 70%; e
- Solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses.
¶ Realização do ensaio
¶ Extração de RNA
- A extração pode ser realizada de forma automatizada ou manual, através de kits de extração de RNA ou reagentes específicos para o tipo de material a ser analisado, seguindo as recomendações do fabricante;
- Não utilizar reagentes após a data de validade e não misturar reagentes de lotes diferentes; e
- Adicionar as seguintes amostras controle a cada procedimento de extração: controle NÃO DETECTADO (água ou tecido bovino ou suíno).
¶ Reação de amplificação de ácido nucleico (RT - PCR)
- Realizar o ensaio em duas áreas separadas: uma para o preparo do mix de reação (sala de pré-PCR), isenta de material genético e amplicons, e outra para a transferência de DNA para placa ou microtubos (sala de PCR);
- Antes e após o preparo do mix de reação, descontaminar a cabine e os materiais a serem utilizados com solução descontaminante. Solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses e/ou álcool 70º INPM; e
- As micropipetas utilizadas para o preparo do mix de reação e adição das amostras devem ser exclusivas para tais finalidades.
¶ Preparo do mix de reação
- Preparar o mix de reação de acordo com protocolos validados e específicos para o agente pesquisado (vírus da SVA) em quantidade suficiente para o número de amostras a serem testadas, considerando algumas a mais;
- Adicionar o mix de reação a cada poço da microplaca (ou microtubos); e
- Devem ser incluídos nas análises:
- Controle DETECTADO para SVA;
- Controle NÃO DETECTADO da extração;
- Branco (água livre de nucleases); e
- Controle DETECTADO e NÃO DETECTADO do kit utilizado (se houver).
¶ Reação de RT-PCR
- Após o preparo do mix, adicionar o RNA nos poços da placa ou em microtubos identificados com a numeração da amostra a ser testada; e
- Realizar a amplificação em termociclador certificado, conforme as especificações de temperatura do protocolo utilizado.
¶ Eletroforese
- Preparar o gel de agarose em concentração adequada ao protocolo de PCR utilizado. Adicionar um corante para ácidos nucleicos em proporção suficiente para visualização das bandas;
- Para a corrida das amostras, adicionar tampão de carregamento (loading buffer) ao produto de PCR;
- Aplicar marcador de peso molecular em um dos poços do gel;
- Realizar a corrida em cuba de eletroforese, utilizando o tempo e a voltagem adequados para o volume do gel e o protocolo de PCR utilizado; e
- Visualizar o gel sob luz ultravioleta, fotografar com o auxílio de um fotodocumentador e analisar o resultado.
¶ Critérios de aceitação da prova
- As amostras de controle DETECTADO para SVA devem apresentar bandas de tamanhos correspondentes aos amplicons do protocolo utilizado; e
- As amostras de controle NÃO DETECTADO (controle NÃO DETECTADO da extração e branco) não devem apresentar bandas de amplificação.
¶ Interpretação dos resultados
- Comparar os resultados das amostras testadas ao das amostras controle, a fim de classificá-las como positivas ou negativas;
- A leitura das bandas deve ser clara e livre de amplicons inespecíficos para o teste ser considerado satisfatório; e
- Qualquer amostra questionável deverá ser retestada.
¶ Emissão dos resultados
- Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO” ou “NÃO DETECTADO”; e
- Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
¶ Descarte das amostras e Resíduos
- Após um período mínimo de 90 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
- Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
¶ D. Técnica de PCR em tempo real com transcrição reversa RT-qPCR para SVA
¶ Materiais
- Luvas de procedimento nitrílica ou de látex isentas de pó;
- Microtubos de volumes variados ou microplacas;
- Microplacas ou microtubos para leitura óptica de RT-qPCR;
- Tampas adesivas para microplacas para leitura óptica de RT-qPCR;
- Ponteiras com filtro, estéreis, livres de DNAses e RNAses;
- Estantes para microtubos;
- Gaze ou papel toalha;
- Equipamentos e instrumentos;
- Autoclave;
- Cabine de segurança biológica com filtro HEPA classe II (requisito mínimo) ou estação de trabalho para PCR (Workstation PCR) com luz UV germicida;
- Geladeira;
- Freezer;
- Micropipetas mono e multicanais de volumes reguláveis;
- Termociclador para PCR em tempo real;
- Centrífuga refrigerada com rotores para microtubos;
- Agitador de microtubos;
- Microcomputador; e
- Equipamento para extração automatizada de ácidos nucleicos (opcional).
¶ Insumos
- Água livre de nucleases;
- Oligonucleotídeos para RT-qPCR (QUADRO 3);
- Controle DETECTADO para SVA (sempre utilizar RNA viral para averiguar eficiência da transcrição reversa);
- Kit de RT-qPCR;
- Kit de extração de RNA (automática);
- Trizol (manual); e
- Recomenda-se o uso de reações de passo único (one step) para síntese e amplificação de cDNA no mesmo tubo.
¶ Soluções
- Solução de álcool 70º INPM; e
- Solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses.
¶ Realização do ensaio
¶ Extração de RNA
- A extração pode ser realizada de forma automatizada ou manual, através de kits de extração de RNA ou reagentes específicos para o tipo de material a ser analisado, seguindo as recomendações do fabricante;
- Não utilizar reagentes após a data de validade e não misturar reagentes de lotes diferentes; e
- Adicionar as seguintes amostras controle a cada procedimento de extração: controle NÃO DETECTADO (água ou tecido bovino ou suíno).
¶ Reação de amplificação de ácido nucleico por RT-qPCR
- Realizar o ensaio em duas áreas separadas: uma para o preparo do mix de reação (sala de pré-PCR) isenta de material genético e amplicons, e outra para a transferência de DNA para placa ou microtubos (sala de PCR);
- Antes e após o preparo do mix de reação, descontaminar a cabine e os materiais a serem utilizados com solução descontaminante Solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses e/ou álcool 70º INPM; e
- As micropipetas utilizadas para o preparo do mix de reação e adição das amostras devem ser exclusivas para tais finalidades.
¶ Preparo do mix de reação
- Preparar o mix de reação de acordo com protocolos validados e específicos para o agente pesquisado (vírus da SVA) em quantidade suficiente para o número de amostras a serem testadas, considerando algumas a mais;
- Após o preparo do mix, adicionar o RNA nos poços da placa ou em microtubos para leitura óptica;
- A adição de RNA e das amostras controle deve ser realizada em uma área distinta do preparo do mix (sala de PCR); e
- Devem ser incluídos nas análises:
- Controle DETECTADO para SVA;
- Controle NÃO DETECTADO da extração;
- Branco (água livre de nucleases);
- Controle DETECTADO e NÃO DETECTADO do kit utilizado (se houver).
QUADRO 3 - Sugestão de oligonucleotídeos para RT-PCR e RT-qPCR para detecção molecular do SVA
|
Oligonucleotídeo |
Tipo de PCR |
Sequência |
Referência |
|
SV-A.3D.464.F |
RT-PCR |
tgcctttgactcttcacacg
|
Laguardia-Nascimento, 2016 |
|
SV-A.3D.464.R |
ataagccrtcrttgttttgg
|
||
|
SV-A.3D.78.F |
RT-qPCR |
tagattgatgcaccccttcg |
Laguardia-Nascimento, 2016 |
|
SV-A.3D.78.R |
aacaaggccctccatcttg
|
||
|
SV-A.3D.78.S |
FAM ccgtaccgagtcacgagtacctgca-IowaBlack
|
||
|
SV-A.VP1.599. |
Sequenciamento |
taacaccccgcccaacag |
Laguardia-Nascimento, 2016 |
|
SV-A.VP1.599. |
agggccagggttggtctc |
¶ Reação de RT-qPCR
- Selar a placa com adesivo óptico ou fechar a tampa dos microtubos. Verificar se há bolhas no fundo do poço e/ou gotículas na parede dos poços da placa ou tubo. Caso isto ocorra, centrifugar brevemente para reduzir as bolhas e para que o conteúdo se posicione na parte inferior da placa ou tubo;
- Iniciar e entrar com os dados no software do termociclador (identificação das amostras e seleção dos fluoróforos), conforme especificações do fabricante;
- Inserir a placa ou os tubos no termociclador, salvar o arquivo e iniciar a corrida; e
- Ao finalizar, salvar os dados e interpretar os resultados.
¶ Critérios de aceitação da prova
- Para a validação do ensaio, o controle DETECTADO deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório; e
- O controle NÃO DETECTADO deve ter Cq indeterminado ou maior que o limite do kit. O gráfico do controle NÃO DETECTADO deve apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
¶ Interpretação dos resultados
- Ao analisar os resultados da corrida, o operador deve avaliar os seguintes componentes: controle DETECTADO, controle NÃO DETECTADO, controle da extração, background de fluorescência e gráficos de amplificação de cada amostra individualmente. Após a validação do ensaio, interpretar os resultados conforme especificações do fabricante;
- O limiar de Cq a ser considerado DETECTADO deve ser avaliado conforme definido na verificação desempenho da técnica ou conforme consta a literatura; e
- Qualquer amostra questionável deverá ser retestada;
¶ Emissão dos resultados
- Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO” ou “NÃO DETECTADO”; e
- Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
¶ Descarte das amostras e Resíduos
- Após um período mínimo de 60 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas por dois analistas antes do descarte;
- Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos; e
- O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
¶ 5. Base legal e documentos de referência
¶ GASTROENTERITE TRANSMISSÍVEIL DOS SUÍNOS - TGE
- Hartman SJ, Paul PS, Halbur PG, Lester MK, Yoon K-J, Harmon K. 1997. Application of a reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) for detection and differentiation of transmissible gastroeneteritis virus in feces. 78th Conference of Research Workers in Animal Diseases, abstract #84.
- Hartman SJ, Paul PS, Halbur PG, Lester MK, Yoon K-J, Harmon K. 1997. Application of a reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) for detection and differentiation of transmissible gastroeneteritis virus in feces. 78th Conference of Research Workers in Animal Diseases, abstract #84.
- Transmissible gastroenteritis. CHAPTER 3.9.10. Version (NB: Version adopted in May 2008). Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, 2023, versão online. Disponível em: https://www.woah.org/en/what-we-do/standards/codes-and-manuals/terrestrial-manual-online-access/ Acesso em 20 de junho de 2024
¶ DIARREIA EPIDÊMICA DOS SUÍNOS – PED
- Kim SH, Kim IJ, Pyo HM, Tark DS, Song JY, Hyun BH. Multiplex real-time RT-PCR for the simultaneous detection and quantification of transmissible gastroenteritis virus and porcine epidemic diarrhea virus. J Virol Methods. 2007 Dec;146(1-2):172-7.
- Lowe J, Gauger P, Harmon K. Role of transportation in spread of porcine epidemic diarrhea virus infection, United States. Emerg Infect Dis. 2014;20(5):872–874. doi:10.3201/eid2005.131628
¶ SENECAVIRUS A - SVA
- Goolia M, Vannucci F, Yang M, Patnayak D, Babiuk S, Nfon CK. Validation of a competitive ELISA and a virus neutralization test for the detection and confirmation of antibodies to Senecavirus A in swine sera. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation 2017, v.29 (2), 250-253.
- Laguardia-Nascimento M, Gasparini MR, Sales ÉB, Rivetti AV Jr, Sousa NM, Oliveira AM, Camargos MF, Pinheiro de Oliveira TF, Gonçalves JP, Madureira MC, Ribeiro DP, Marcondes IV, Barbosa-Stancioli EF, Fonseca AA Jr. Molecular epidemiology of Senecavirus A associated with vesicular disease in pigs in Brazil. Vet J. 2016 Oct; 216:207-9.
- Reed LJ, Muench H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints. Am J Hyg. 1938; 27:493–497.
¶ 6. Disposições Gerais
As sugestões para aprimoramento ou possíveis correções deste documento devem ser direcionadas ao Departamento responsável, para alinhamento das melhores práticas de mercado, legislação vigente e/ou regulamentações, que não tenham sido contempladas na versão vigente.
¶ 7. Histórico de revisões
| Versão | Conteúdo alterado | Data | Motivo |
|---|---|---|---|
| 1 | -//- | 05.09.2024 | Elaboração do documento |