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Ano 2026
Elaboração, distribuição, informações:
Ministério da Agricultura e Pecuária
Secretaria de Defesa Agropecuária - SDA
Departamento de Serviços Técnicos - DTEC
Esplanada dos Ministérios, Bloco D, Anexo, Ala B, 4º andar, sala 433
CEP: 70043-900, Brasília - DF
www.agricultura.gov.br
e- mail: cgal@agro.gov.br
Central de Relacionamento: 0800 704 1995
Equipe Técnica:
Ana Cristina Gonçalves Pinto da Rocha
Anapolino Macedo de Oliveira
Anselmo Vasconcelos Rivetti Júnior
Antônio Augusto Fonseca Júnior
Cairo Henrique Sousa de Oliveira
Carla do Amaral Pinto
Cid Aristóteles de Siqueira Alencar
Fabíola Nascimento Correa
Jonh Aldson Bezerra Tenório
Marcelo Fernandes Camargos
Maria da Glória Trindade
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Macroprocesso: Laboratórios |
Objetivo: Realizar a padronização, harmonização, atualização e a unificação dos procedimentos para execução de ensaios laboratoriais da área de Diagnóstico Animal, destinadas aos laboratórios oficiais e credenciados da Rede Nacional de Laboratórios Agropecuários |
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Processo: Análises Laboratoriais |
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Entrega: Segurança e saúde dos animais |
Público alvo e demais interessados: Laboratórios oficiais e credenciados do Ministério da Agricultura e Pecuária (Mapa) |
Versão do documento: 1 |
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Setor responsável e responsabilidades A Coordenação Geral de Laboratórios Agropecuários do Departamento de Serviços Técnicos é responsável pela elaboração, atualização e envio para aprovação deste manual, tendo responsabilidade quanto aos procedimentos descritos no documento. |
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Não aplicável.
Não aplicável.
O presente manual possui vigência e prazo indeterminado e será revisado sempre que necessário pela Coordenação Geral de Laboratórios Agropecuários do Departamento de Serviços Técnicos (CGAL/DTEC).
A gestão desse manual está sob a responsabilidade da CGAL/DTEC que prestará auxílio ao público alvo leitor dúvidas e/ou sugestões quanto à aplicação deste manual devem ser submetidas ao Departamento responsável.
A publicação e atualização das versões na plataforma oficial da SDA para acesso pelo público alvo será de responsabilidade da Secretaria representada pelo DTEC.
O objetivo do Manual é reunir os métodos analíticos a serem empregados na execução de ensaios laboratoriais da área de Diagnóstico Animal da Rede Nacional de Laboratórios Agropecuários (Rede LFDA e Laboratórios credenciados junto ao Ministério da Agricultura e Pecuária).
São consideradas amostras para o diagnóstico da Síndorme da Mancha Branca:
a) músculo;
b) brânquias;
c) pleópodes;
d) hemolinfa.
a) Para atendimento aos Programas e Controles Oficiais do MAPA os laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
b) Deverão ser obedecidos os critérios de verificação de conformidade das amostras estabelecidos no Volume I - REGRAS GERAIS.
c) As amostras deverão ser encaminhadas ao laboratório, individualmente e obedecendo a critérios de biossegurança.
a) Somente poderão ser utilizados insumos de diagnóstico que tenham registro no MAPA, segundo legislação em vigor.
b) Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados.
c) O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos.
Nota 1: Com relação às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos:
I – Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente.
II – Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 e 25ºC.
d) Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados.
e) O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios.
f) Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada.
g) Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório.
Nota 2: A utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitida quando:
I – A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos;
II – As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes;
III – O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
QUADRO 1. Sugestão de oligonucleotídeos para o diagnóstico de doenças em camarões.
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Doença ou alvo |
Iniciadores / Sonda |
Sequência |
Concentração final na reação |
Amplicon / Genoma |
Referência |
|
Síndrome da Mancha Branca - White spot syndrome virus (WSSV) |
WSSV.69.F |
5’-TGG-TCC-CGT-CCT-CAT-CTC-AG-3’ |
0,3 uM |
69 pb DNA |
WOAH
Durand & Lightner (2002) |
|
WSSV.69.R |
5’-GCT-GCC-TTG-CCG-GAA-ATT-A-3’ |
0,3 uM |
|||
|
WSSV.69.S |
FAM-5'-AGC-CAT-GAA-GAA-TGC-CGT-CTA-TCA-CAC-A-3'-TAMRA |
0,15 uM |
|||
|
Elongation factor 1-α (Gene endógeno Penaeus vannamei) |
EF63.RNAshrimp F |
5’-CTC-CTC-TCG-GAC-GTT-TTG-CT-3’ |
0,3 uM |
281pb - |
Anantasomboona et al. (2008) |
|
EF63.RNAshrimp R |
5’-CCT-TGA-TCA-CAC-CCA-CAG-CTA-3’ |
0,3 uM |
|||
|
EF63.RNAshrimp S |
FAM-5'-CCG-TCT-GCT-TCA-TGT-CAC-3'-TAMRA |
0,15 uM |
a) A extração pode ser realizada de forma automatizada ou manual, através de kits de extração de ácidos nucleicos ou reagentes específicos para o tipo de material a ser analisado, seguindo as recomendações do fabricante;
b) Os kits de extração com tecnologia baseada em beads magnéticas apresentam bom desempenho na obtenção de ácidos nucleicos a partir de amostras de camarão;
c) Não utilizar reagentes após a data de validade e não misturar reagentes de lotes diferentes;
d) Adicionar as seguintes amostras controle a cada procedimento de extração: controle de EXTRAÇÃO (água ou tecido sabidamente negativo para o alvo).
a) Realizar o ensaio em duas áreas separadas: uma para o preparo do mix de reação (sala de pré-PCR ou de mix) isenta de material genético e amplicons, e outra para a transferência de DNA/RNA para placa ou microtubos (sala de PCR);
b) Antes e após o preparo do mix de reação, descontaminar a cabine e os materiais a serem utilizados com solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses, ou hipoclorito de sódio a 1%;
c) Limpar as superfícies com álcool 70º INPM;
d) As micropipetas utilizadas para o preparo do mix de reação e adição das amostras devem ser exclusivas para tais finalidades.
a) Preparar o mix de reação de acordo com protocolos validados e específicos para o agente pesquisado, em quantidade suficiente para o número de amostras a serem testadas;
b) Após o preparo do mix, adicionar o DNA/RNA nos poços da placa ou em microtubos para leitura óptica;
c) A adição de DNA/RNA e das amostras controle deve ser realizada em uma área distinta do preparo do mix;
d) Devem ser incluídos nas análises:
I. Controle DETECTADO para o alvo;
II. Controle da EXTRAÇÃO;
III. Controle de REAÇÃO ou Branco (água livre de nucleases);
IV. Controle ENDÓGENO, gene endógeno a ser amplificado para cada amostra testada;
V. Controle DETECTADO e NÃO DETECTADO do kit utilizado, se aplicável.
a) Selar a placa com adesivo óptico ou fechar a tampa dos microtubos. Verificar se há bolhas no fundo do poço e/ou gotículas na parede dos poços da placa ou tubo. Caso isto ocorra, centrifugar brevemente para reduzir as bolhas e para que o conteúdo se posicione na parte inferior da placa ou tubo;
b) Iniciar e entrar com os dados no software do termociclador (identificação das amostras e seleção dos fluoróforos), conforme especificações do fabricante;
c) Inserir a placa ou os tubos no termociclador, salvar o arquivo e iniciar a corrida, conforme ciclagem a ser ajustada de acordo com o mastermix utilizado, ver Quadro 1;
d) Ao finalizar, salvar os dados e interpretar os resultados.
Quadro 1. Ciclagem para o diagnóstico de doenças de camarão para os agentes DNA, considerando o mastermix TaqPath™ ProAmp™ Master Mix, Applied Biosystems.
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Número de ciclos |
Temperatura |
Tempo |
|
1 |
50ºC |
2 min |
|
1 |
95ºC |
10 min |
|
45 |
95ºC |
15 seg. |
|
60ºC |
1 min |
a) Para a validação do ensaio, o controle DETECTADO deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório;
b) O controle de EXTRAÇÃO, de REAÇÃO e NÃO DETECTADO, devem ter Cq indeterminado ou maior que o limite definido pelo fabricante do kit, pelo processo de verificação de desempenho do método ou pela literatura. Os gráficos desses controles devem apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
a) Ao analisar os resultados da corrida, o operador deve avaliar os seguintes componentes: controle DETECTADO, controle de EXTRAÇÃO, controle de REAÇÃO, background de fluorescência e gráficos de amplificação de cada amostra individualmente. Após a validação do ensaio, interpretar os resultados conforme especificações do fabricante;
b) O limiar de Cq a ser considerado DETECTADO deve ser avaliado conforme definido na verificação de desempenho da técnica, bula do kit ou conforme consta a literatura;
c) Amostras com resultado NÃO DETECTADO para o alvo devem apresentar resultado DETECTADO para o gene endógeno;
d) Qualquer amostra com resultado questionável deverá ser reanalisada;
e) Amostras positivas podem ser submetidas a sequenciamento para confirmação.
a) Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
b) Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
a) Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
b) O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
a) Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
b) Amostras com resultados DETECTADO, não devem ser descartadas sem autorização prévia da CGAL.
a) Imediatamente após a emissão do resultado poderão ser descartados, registrando-se em formulários próprios e conferidas antes do descarte.
São consideradas amostras para o diagnóstico da Necrose Infecciosa Hipodérmica e Hematopoiética:
a) músculo;
b) brânquias;
c) pleópodes;
d) hemolinfa.
a) Para atendimento aos Programas e Controles Oficiais do MAPA os laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
b) Deverão ser obedecidos os critérios de verificação de conformidade das amostras estabelecidos no Volume I - REGRAS GERAIS.
c) As amostras deverão ser encaminhadas ao laboratório, individualmente e obedecendo a critérios de biossegurança.
a) Somente poderão ser utilizados insumos de diagnóstico que tenham registro no MAPA, segundo legislação em vigor.
b) Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados.
c) O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos.
Nota 1: Com relação às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos:
I – Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente.
II – Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 e 25ºC.
d) Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados.
e) O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios.
f) Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada.
g) Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório.
Nota 2: A utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitida quando:
I – A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos;
II – As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes;
III – O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
QUADRO 1. Sugestão de oligonucleotídeos para o diagnóstico de doenças em camarões.
|
Doença ou alvo |
Iniciadores / Sonda |
Sequência |
Concentração final na reação |
Amplicon / Genoma |
Referência |
|
Necrose Infecciosa Hipodermal e Hematopoiética - Decapod hepanhamaparvovirus 1 (IHHNV) |
IHHNV.81.F |
5’-TAC-TCC-GGA-CAC-CCA-ACC-A-3’ |
0,3 uM |
81 pb DNA |
WOAH
Tang & Lightner (2001) |
|
IHHNV.81.R |
5’-GGC-TCT-GGC-AGC-AAA-GGT-AA-3’ |
0,3 uM |
|||
|
IHHNV.81.S |
FAM-5'-ACC-AGA-CAT-AGA-GCT-ACA-ATC-CTC-GCC-TAT-TTG-3'-TAMRA |
0,15 uM |
|||
|
Elongation factor 1-α (Gene endógeno Penaeus vannamei) |
EF63.RNAshrimp F |
5’-CTC-CTC-TCG-GAC-GTT-TTG-CT-3’ |
0,3 uM |
281pb - |
Anantasomboona et al. (2008) |
|
EF63.RNAshrimp R |
5’-CCT-TGA-TCA-CAC-CCA-CAG-CTA-3’ |
0,3 uM |
|||
|
EF63.RNAshrimp S |
FAM-5'-CCG-TCT-GCT-TCA-TGT-CAC-3'-TAMRA |
0,15 uM |
a) A extração pode ser realizada de forma automatizada ou manual, através de kits de extração de ácidos nucleicos ou reagentes específicos para o tipo de material a ser analisado, seguindo as recomendações do fabricante;
b) Os kits de extração com tecnologia baseada em beads magnéticas apresentam bom desempenho na obtenção de ácidos nucleicos a partir de amostras de camarão;
c) Não utilizar reagentes após a data de validade e não misturar reagentes de lotes diferentes;
d) Adicionar as seguintes amostras controle a cada procedimento de extração: controle de EXTRAÇÃO (água ou tecido sabidamente negativo para o alvo).
a) Realizar o ensaio em duas áreas separadas: uma para o preparo do mix de reação (sala de pré-PCR ou de mix) isenta de material genético e amplicons, e outra para a transferência de DNA/RNA para placa ou microtubos (sala de PCR);
b) Antes e após o preparo do mix de reação, descontaminar a cabine e os materiais a serem utilizados com solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses, ou hipoclorito de sódio a 1%;
c) Limpar as superfícies com álcool 70º INPM;
d) As micropipetas utilizadas para o preparo do mix de reação e adição das amostras devem ser exclusivas para tais finalidades.
a) Preparar o mix de reação de acordo com protocolos validados e específicos para o agente pesquisado, em quantidade suficiente para o número de amostras a serem testadas;
b) Após o preparo do mix, adicionar o DNA/RNA nos poços da placa ou em microtubos para leitura óptica;
c) A adição de DNA/RNA e das amostras controle deve ser realizada em uma área distinta do preparo do mix;
d) Devem ser incluídos nas análises:
I. Controle DETECTADO para o alvo;
II. Controle da EXTRAÇÃO;
III. Controle de REAÇÃO ou Branco (água livre de nucleases);
IV. Controle ENDÓGENO, gene endógeno a ser amplificado para cada amostra testada;
V. Controle DETECTADO e NÃO DETECTADO do kit utilizado, se aplicável.
a) Selar a placa com adesivo óptico ou fechar a tampa dos microtubos. Verificar se há bolhas no fundo do poço e/ou gotículas na parede dos poços da placa ou tubo. Caso isto ocorra, centrifugar brevemente para reduzir as bolhas e para que o conteúdo se posicione na parte inferior da placa ou tubo;
b) Iniciar e entrar com os dados no software do termociclador (identificação das amostras e seleção dos fluoróforos), conforme especificações do fabricante;
c) Inserir a placa ou os tubos no termociclador, salvar o arquivo e iniciar a corrida, conforme ciclagem a ser ajustada de acordo com o mastermix utilizado, ver Quadro 1;
d) Ao finalizar, salvar os dados e interpretar os resultados.
Quadro 1. Ciclagem para o diagnóstico de doenças de camarão para os agentes DNA, considerando o mastermix TaqPath™ ProAmp™ Master Mix, Applied Biosystems.
|
Número de ciclos |
Temperatura |
Tempo |
|
1 |
50ºC |
2 min |
|
1 |
95ºC |
10 min |
|
45 |
95ºC |
15 seg. |
|
60ºC |
1 min |
a) Para a validação do ensaio, o controle DETECTADO deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório;
b) O controle de EXTRAÇÃO, de REAÇÃO e NÃO DETECTADO, devem ter Cq indeterminado ou maior que o limite definido pelo fabricante do kit, pelo processo de verificação de desempenho do método ou pela literatura. Os gráficos desses controles devem apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
a) Ao analisar os resultados da corrida, o operador deve avaliar os seguintes componentes: controle DETECTADO, controle de EXTRAÇÃO, controle de REAÇÃO, background de fluorescência e gráficos de amplificação de cada amostra individualmente. Após a validação do ensaio, interpretar os resultados conforme especificações do fabricante;
b) O limiar de Cq a ser considerado DETECTADO deve ser avaliado conforme definido na verificação de desempenho da técnica, bula do kit ou conforme consta a literatura;
c) Amostras com resultado NÃO DETECTADO para o alvo devem apresentar resultado DETECTADO para o gene endógeno;
d) Qualquer amostra com resultado questionável deverá ser reanalisada;
e) Amostras positivas podem ser submetidas a sequenciamento para confirmação.
a) Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
b) Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
a) Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
b) O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
a) Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
b) Amostras com resultados DETECTADO, não devem ser descartadas sem autorização prévia da CGAL.
a) Imediatamente após a emissão do resultado poderão ser descartados, registrando-se em formulários próprios e conferidas antes do descarte.
São consideradas amostras para o diagnóstico da Doença da Cabeça Amarela:
a) brânquias;
b) órgãos linfóides;
c) hemolinfa.
a) Para atendimento aos Programas e Controles Oficiais do MAPA os laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
b) Deverão ser obedecidos os critérios de verificação de conformidade das amostras estabelecidos no Volume I - REGRAS GERAIS.
c) As amostras deverão ser encaminhadas ao laboratório, individualmente e obedecendo a critérios de biossegurança.
a) Somente poderão ser utilizados insumos de diagnóstico que tenham registro no MAPA, segundo legislação em vigor.
b) Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados.
c) O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos.
Nota 1: Com relação às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos:
I – Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente.
II – Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 e 25ºC.
d) Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados.
e) O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios.
f) Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada.
g) Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório.
Nota 2: A utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitida quando:
I – A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos;
II – As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes;
III – O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
QUADRO 1. Sugestão de oligonucleotídeos para o diagnóstico de doenças em camarões.
|
Doença ou alvo |
Iniciadores / Sonda |
Sequência |
Concentração final na reação |
Amplicon / Genoma |
Referência |
|
Doença da Cabeça Amarela - Yellow head virus (YHV) |
YHV70.F |
5’- CGA-CAT-CAC-TCC-AGA-CAA-CAT-CT -3’ |
0,3 uM |
70 pb RNA |
Anantasomboona, et al. (2008) |
|
YHV70.R |
5’-ACA-ATG-CCG-GGA-CGA-TAT-GT-3’ |
0,3 uM |
|||
|
YHV70.S |
FAM-5’- AAG-GCG-TCT-ATG-ACT-TCG -3’-TAMRA |
0,15 uM |
|||
|
Elongation factor 1-α (Gene endógeno Penaeus vannamei) |
EF63.RNAshrimp F |
5’-CTC-CTC-TCG-GAC-GTT-TTG-CT-3’ |
0,3 uM |
281pb - |
Anantasomboona et al. (2008) |
|
EF63.RNAshrimp R |
5’-CCT-TGA-TCA-CAC-CCA-CAG-CTA-3’ |
0,3 uM |
|||
|
EF63.RNAshrimp S |
FAM-5'-CCG-TCT-GCT-TCA-TGT-CAC-3'-TAMRA |
0,15 uM |
a) A extração pode ser realizada de forma automatizada ou manual, através de kits de extração de ácidos nucleicos ou reagentes específicos para o tipo de material a ser analisado, seguindo as recomendações do fabricante;
b) Os kits de extração com tecnologia baseada em beads magnéticas apresentam bom desempenho na obtenção de ácidos nucleicos a partir de amostras de camarão;
c) Não utilizar reagentes após a data de validade e não misturar reagentes de lotes diferentes;
d) Adicionar as seguintes amostras controle a cada procedimento de extração: controle de EXTRAÇÃO (água ou tecido sabidamente negativo para o alvo).
a) Realizar o ensaio em duas áreas separadas: uma para o preparo do mix de reação (sala de pré-PCR ou de mix) isenta de material genético e amplicons, e outra para a transferência de DNA/RNA para placa ou microtubos (sala de PCR);
b) Antes e após o preparo do mix de reação, descontaminar a cabine e os materiais a serem utilizados com solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses, ou hipoclorito de sódio a 1%;
c) Limpar as superfícies com álcool 70º INPM;
d) As micropipetas utilizadas para o preparo do mix de reação e adição das amostras devem ser exclusivas para tais finalidades.
a) Preparar o mix de reação de acordo com protocolos validados e específicos para o agente pesquisado, em quantidade suficiente para o número de amostras a serem testadas;
b) Após o preparo do mix, adicionar o DNA/RNA nos poços da placa ou em microtubos para leitura óptica;
c) A adição de DNA/RNA e das amostras controle deve ser realizada em uma área distinta do preparo do mix;
d) Devem ser incluídos nas análises:
I. Controle DETECTADO para o alvo;
II. Controle da EXTRAÇÃO;
III. Controle de REAÇÃO ou Branco (água livre de nucleases);
IV. Controle ENDÓGENO, gene endógeno a ser amplificado para cada amostra testada;
V. Controle DETECTADO e NÃO DETECTADO do kit utilizado, se aplicável.
a) Selar a placa com adesivo óptico ou fechar a tampa dos microtubos. Verificar se há bolhas no fundo do poço e/ou gotículas na parede dos poços da placa ou tubo. Caso isto ocorra, centrifugar brevemente para reduzir as bolhas e para que o conteúdo se posicione na parte inferior da placa ou tubo;
b) Iniciar e entrar com os dados no software do termociclador (identificação das amostras e seleção dos fluoróforos), conforme especificações do fabricante;
c) Inserir a placa ou os tubos no termociclador, salvar o arquivo e iniciar a corrida, conforme ciclagem a ser ajustada de acordo com o mastermix utilizado, ver Quadro 1;
d) Ao finalizar, salvar os dados e interpretar os resultados.
Quadro 1. Ciclagem para o diagnóstico de doenças de camarão para os agentes DNA, considerando o mastermix TaqPath™ ProAmp™ Master Mix, Applied Biosystems.
|
Número de ciclos |
Temperatura |
Tempo |
|
1 |
45ºC |
10 min |
|
1 |
95ºC |
10 min |
|
45 |
95ºC |
15 seg. |
|
60ºC |
45 seg. |
a) Para a validação do ensaio, o controle DETECTADO deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório;
b) O controle de EXTRAÇÃO, de REAÇÃO e NÃO DETECTADO, devem ter Cq indeterminado ou maior que o limite definido pelo fabricante do kit, pelo processo de verificação de desempenho do método ou pela literatura. Os gráficos desses controles devem apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
a) Ao analisar os resultados da corrida, o operador deve avaliar os seguintes componentes: controle DETECTADO, controle de EXTRAÇÃO, controle de REAÇÃO, background de fluorescência e gráficos de amplificação de cada amostra individualmente. Após a validação do ensaio, interpretar os resultados conforme especificações do fabricante;
b) O limiar de Cq a ser considerado DETECTADO deve ser avaliado conforme definido na verificação de desempenho da técnica, bula do kit ou conforme consta a literatura;
c) Amostras com resultado NÃO DETECTADO para o alvo devem apresentar resultado DETECTADO para o gene endógeno;
d) Qualquer amostra com resultado questionável deverá ser reanalisada;
e) Amostras positivas podem ser submetidas a sequenciamento para confirmação.
a) Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
b) Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
a) Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
b) O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
a) Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
b) Amostras com resultados DETECTADO, não devem ser descartadas sem autorização prévia da CGAL.
a) Imediatamente após a emissão do resultado poderão ser descartados, registrando-se em formulários próprios e conferidas antes do descarte.
São consideradas amostras para o diagnóstico da Mionecrose Infecciosa:
a) músculo;
b) pleópodes;
c) hemolinfa.
a) Para atendimento aos Programas e Controles Oficiais do MAPA os laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
b) Deverão ser obedecidos os critérios de verificação de conformidade das amostras estabelecidos no Volume I - REGRAS GERAIS.
c) As amostras deverão ser encaminhadas ao laboratório, individualmente e obedecendo a critérios de biossegurança.
a) Somente poderão ser utilizados insumos de diagnóstico que tenham registro no MAPA, segundo legislação em vigor.
b) Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados.
c) O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos.
Nota 1: Com relação às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos:
I – Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente.
II – Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 e 25ºC.
d) Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados.
e) O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios.
f) Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada.
g) Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório.
Nota 2: A utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitida quando:
I – A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos;
II – As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes;
III – O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
QUADRO 1. Sugestão de oligonucleotídeos para o diagnóstico de doenças em camarões.
|
Doença ou alvo |
Iniciadores / Sonda |
Sequência |
Concentração final na reação |
Amplicon / Genoma |
Referência |
|
Mionecrose Infecciosa - Infectious myonecrosis virus (IMNV) |
IMNV.134.F |
5’-GGA-CCT-ATC-ATA-CAT-AGC-GTT-GCA-3’ |
0,3 uM |
134 pb RNA |
WOAH
Andrade et al. (2007)
|
|
IMNV.134.R |
5’-AAC-CCA-TAT-CTA-TTG-TCG-CTG-GAT-3’ |
0,3 uM |
|||
|
IMNV.134.S |
FAM-5’-CCA-CCT-TTA-CTT-TCA-ATA-CTA-CAT-CAT-CCC-CGG-BHQ1 |
0,2 uM |
|||
|
Elongation factor 1-α (Gene endógeno Penaeus vannamei) |
EF63.RNAshrimp F |
5’-CTC-CTC-TCG-GAC-GTT-TTG-CT-3’ |
0,3 uM |
281pb - |
Anantasomboona et al. (2008) |
|
EF63.RNAshrimp R |
5’-CCT-TGA-TCA-CAC-CCA-CAG-CTA-3’ |
0,3 uM |
|||
|
EF63.RNAshrimp S |
FAM-5'-CCG-TCT-GCT-TCA-TGT-CAC-3'-TAMRA |
0,15 uM |
a) A extração pode ser realizada de forma automatizada ou manual, através de kits de extração de ácidos nucleicos ou reagentes específicos para o tipo de material a ser analisado, seguindo as recomendações do fabricante;
b) Os kits de extração com tecnologia baseada em beads magnéticas apresentam bom desempenho na obtenção de ácidos nucleicos a partir de amostras de camarão;
c) Não utilizar reagentes após a data de validade e não misturar reagentes de lotes diferentes;
d) Adicionar as seguintes amostras controle a cada procedimento de extração: controle de EXTRAÇÃO (água ou tecido sabidamente negativo para o alvo).
a) Realizar o ensaio em duas áreas separadas: uma para o preparo do mix de reação (sala de pré-PCR ou de mix) isenta de material genético e amplicons, e outra para a transferência de DNA/RNA para placa ou microtubos (sala de PCR);
b) Antes e após o preparo do mix de reação, descontaminar a cabine e os materiais a serem utilizados com solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses, ou hipoclorito de sódio a 1%;
c) Limpar as superfícies com álcool 70º INPM;
d) As micropipetas utilizadas para o preparo do mix de reação e adição das amostras devem ser exclusivas para tais finalidades.
a) Preparar o mix de reação de acordo com protocolos validados e específicos para o agente pesquisado, em quantidade suficiente para o número de amostras a serem testadas;
b) Após o preparo do mix, adicionar o DNA/RNA nos poços da placa ou em microtubos para leitura óptica;
c) A adição de DNA/RNA e das amostras controle deve ser realizada em uma área distinta do preparo do mix;
d) Devem ser incluídos nas análises:
I. Controle DETECTADO para o alvo;
II. Controle da EXTRAÇÃO;
III. Controle de REAÇÃO ou Branco (água livre de nucleases);
IV. Controle ENDÓGENO, gene endógeno a ser amplificado para cada amostra testada;
V. Controle DETECTADO e NÃO DETECTADO do kit utilizado, se aplicável.
a) Selar a placa com adesivo óptico ou fechar a tampa dos microtubos. Verificar se há bolhas no fundo do poço e/ou gotículas na parede dos poços da placa ou tubo. Caso isto ocorra, centrifugar brevemente para reduzir as bolhas e para que o conteúdo se posicione na parte inferior da placa ou tubo;
b) Iniciar e entrar com os dados no software do termociclador (identificação das amostras e seleção dos fluoróforos), conforme especificações do fabricante;
c) Inserir a placa ou os tubos no termociclador, salvar o arquivo e iniciar a corrida, conforme ciclagem a ser ajustada de acordo com o mastermix utilizado, ver Quadro 1;
d) Ao finalizar, salvar os dados e interpretar os resultados.
Quadro 1. Ciclagem para o diagnóstico de doenças de camarão para os agentes DNA, considerando o mastermix TaqPath™ ProAmp™ Master Mix, Applied Biosystems.
|
Número de ciclos |
Temperatura |
Tempo |
|
1 |
45ºC |
10 min |
|
1 |
95ºC |
10 min |
|
45 |
95ºC |
15 seg. |
|
60ºC |
45 seg. |
a) Para a validação do ensaio, o controle DETECTADO deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório;
b) O controle de EXTRAÇÃO, de REAÇÃO e NÃO DETECTADO, devem ter Cq indeterminado ou maior que o limite definido pelo fabricante do kit, pelo processo de verificação de desempenho do método ou pela literatura. Os gráficos desses controles devem apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
a) Ao analisar os resultados da corrida, o operador deve avaliar os seguintes componentes: controle DETECTADO, controle de EXTRAÇÃO, controle de REAÇÃO, background de fluorescência e gráficos de amplificação de cada amostra individualmente. Após a validação do ensaio, interpretar os resultados conforme especificações do fabricante;
b) O limiar de Cq a ser considerado DETECTADO deve ser avaliado conforme definido na verificação de desempenho da técnica, bula do kit ou conforme consta a literatura;
c) Amostras com resultado NÃO DETECTADO para o alvo devem apresentar resultado DETECTADO para o gene endógeno;
d) Qualquer amostra com resultado questionável deverá ser reanalisada;
e) Amostras positivas podem ser submetidas a sequenciamento para confirmação.
a) Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
b) Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
a) Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
b) O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
a) Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
b) Amostras com resultados DETECTADO, não devem ser descartadas sem autorização prévia da CGAL.
a) Imediatamente após a emissão do resultado poderão ser descartados, registrando-se em formulários próprios e conferidas antes do descarte.
São consideradas amostras para o diagnóstico da Síndrome da Necrose Hepatopancreática Aguda:
a) hepatopâncreas;
b) estômago;
c) intestino médio;
d) intestino posterior.
a) Para atendimento aos Programas e Controles Oficiais do MAPA os laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
b) Deverão ser obedecidos os critérios de verificação de conformidade das amostras estabelecidos no Volume I - REGRAS GERAIS.
c) As amostras deverão ser encaminhadas ao laboratório, individualmente e obedecendo a critérios de biossegurança.
a) Somente poderão ser utilizados insumos de diagnóstico que tenham registro no MAPA, segundo legislação em vigor.
b) Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados.
c) O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos.
Nota 1: Com relação às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos:
I – Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente.
II – Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 e 25ºC.
d) Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados.
e) O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios.
f) Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada.
g) Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório.
Nota 2: A utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitida quando:
I – A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos;
II – As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes;
III – O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
QUADRO 1. Sugestão de oligonucleotídeos para o diagnóstico de doenças em camarões.
|
Doença ou alvo |
Iniciadores / Sonda |
Sequência |
Concentração final na reação |
Amplicon / Genoma |
Referência |
|
Síndrome da Necrose Hepatopancreática Aguda - (AHPND) |
AHPND.VpPirA.F |
5’-TTG-GAC-TGT-CGA-ACC-AAA-CG-3’ |
0,3 uM |
135 pb DNA |
WOAH
Han et al. (2015) |
|
AHPND.VpPirA.R |
5’-GCA-CCC-CAT-TGG-TAT-TGA-ATG-3’ |
0,3 uM |
|||
|
AHPND.VpPirA.S |
FAM-5’-AGA-CAG-CAA-ACA-TAC-ACC-TAT-CAT-CCC-GGA-3'-TAMRA |
0,1 uM |
|||
|
Elongation factor 1-α (Gene endógeno Penaeus vannamei) |
EF63.RNAshrimp F |
5’-CTC-CTC-TCG-GAC-GTT-TTG-CT-3’ |
0,3 uM |
281pb - |
Anantasomboona et al. (2008) |
|
EF63.RNAshrimp R |
5’-CCT-TGA-TCA-CAC-CCA-CAG-CTA-3’ |
0,3 uM |
|||
|
EF63.RNAshrimp S |
FAM-5'-CCG-TCT-GCT-TCA-TGT-CAC-3'-TAMRA |
0,15 uM |
a) A extração pode ser realizada de forma automatizada ou manual, através de kits de extração de ácidos nucleicos ou reagentes específicos para o tipo de material a ser analisado, seguindo as recomendações do fabricante;
b) Os kits de extração com tecnologia baseada em beads magnéticas apresentam bom desempenho na obtenção de ácidos nucleicos a partir de amostras de camarão;
c) Não utilizar reagentes após a data de validade e não misturar reagentes de lotes diferentes;
d) Adicionar as seguintes amostras controle a cada procedimento de extração: controle de EXTRAÇÃO (água ou tecido sabidamente negativo para o alvo).
a) Realizar o ensaio em duas áreas separadas: uma para o preparo do mix de reação (sala de pré-PCR ou de mix) isenta de material genético e amplicons, e outra para a transferência de DNA/RNA para placa ou microtubos (sala de PCR);
b) Antes e após o preparo do mix de reação, descontaminar a cabine e os materiais a serem utilizados com solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses, ou hipoclorito de sódio a 1%;
c) Limpar as superfícies com álcool 70º INPM;
d) As micropipetas utilizadas para o preparo do mix de reação e adição das amostras devem ser exclusivas para tais finalidades.
a) Preparar o mix de reação de acordo com protocolos validados e específicos para o agente pesquisado, em quantidade suficiente para o número de amostras a serem testadas;
b) Após o preparo do mix, adicionar o DNA/RNA nos poços da placa ou em microtubos para leitura óptica;
c) A adição de DNA/RNA e das amostras controle deve ser realizada em uma área distinta do preparo do mix;
d) Devem ser incluídos nas análises:
I. Controle DETECTADO para o alvo;
II. Controle da EXTRAÇÃO;
III. Controle de REAÇÃO ou Branco (água livre de nucleases);
IV. Controle ENDÓGENO, gene endógeno a ser amplificado para cada amostra testada;
V. Controle DETECTADO e NÃO DETECTADO do kit utilizado, se aplicável.
a) Selar a placa com adesivo óptico ou fechar a tampa dos microtubos. Verificar se há bolhas no fundo do poço e/ou gotículas na parede dos poços da placa ou tubo. Caso isto ocorra, centrifugar brevemente para reduzir as bolhas e para que o conteúdo se posicione na parte inferior da placa ou tubo;
b) Iniciar e entrar com os dados no software do termociclador (identificação das amostras e seleção dos fluoróforos), conforme especificações do fabricante;
c) Inserir a placa ou os tubos no termociclador, salvar o arquivo e iniciar a corrida, conforme ciclagem a ser ajustada de acordo com o mastermix utilizado, ver Quadro 1;
d) Ao finalizar, salvar os dados e interpretar os resultados.
Quadro 1. Ciclagem para o diagnóstico de doenças de camarão para os agentes DNA, considerando o mastermix TaqPath™ ProAmp™ Master Mix, Applied Biosystems.
|
Número de ciclos |
Temperatura |
Tempo |
|
1 |
50ºC |
2 min |
|
1 |
95ºC |
10 min |
|
45 |
95ºC |
15 seg. |
|
60ºC |
1 min |
a) Para a validação do ensaio, o controle DETECTADO deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório;
b) O controle de EXTRAÇÃO, de REAÇÃO e NÃO DETECTADO, devem ter Cq indeterminado ou maior que o limite definido pelo fabricante do kit, pelo processo de verificação de desempenho do método ou pela literatura. Os gráficos desses controles devem apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
a) Ao analisar os resultados da corrida, o operador deve avaliar os seguintes componentes: controle DETECTADO, controle de EXTRAÇÃO, controle de REAÇÃO, background de fluorescência e gráficos de amplificação de cada amostra individualmente. Após a validação do ensaio, interpretar os resultados conforme especificações do fabricante;
b) O limiar de Cq a ser considerado DETECTADO deve ser avaliado conforme definido na verificação de desempenho da técnica, bula do kit ou conforme consta a literatura;
c) Amostras com resultado NÃO DETECTADO para o alvo devem apresentar resultado DETECTADO para o gene endógeno;
d) Qualquer amostra com resultado questionável deverá ser reanalisada;
e) Amostras positivas podem ser submetidas a sequenciamento para confirmação.
a) Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
b) Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
a) Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
b) O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
a) Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
b) Amostras com resultados DETECTADO, não devem ser descartadas sem autorização prévia da CGAL.
a) Imediatamente após a emissão do resultado poderão ser descartados, registrando-se em formulários próprios e conferidas antes do descarte.
São consideradas amostras para o diagnóstico da Hepatopancreatite Necrosantes:
a) hepatopâncreas;
b) fezes.
a) Para atendimento aos Programas e Controles Oficiais do MAPA os laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
b) Deverão ser obedecidos os critérios de verificação de conformidade das amostras estabelecidos no Volume I - REGRAS GERAIS.
c) As amostras deverão ser encaminhadas ao laboratório, individualmente e obedecendo a critérios de biossegurança.
a) Somente poderão ser utilizados insumos de diagnóstico que tenham registro no MAPA, segundo legislação em vigor.
b) Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados.
c) O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos.
Nota 1: Com relação às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos:
I – Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente.
II – Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 e 25ºC.
d) Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados.
e) O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios.
f) Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada.
g) Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório.
Nota 2: A utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitida quando:
I – A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos;
II – As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes;
III – O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
QUADRO 1. Sugestão de oligonucleotídeos para o diagnóstico de doenças em camarões.
|
Doença ou alvo |
Iniciadores / Sonda |
Sequência |
Concentração final na reação |
Amplicon / Genoma |
Referência |
|
Hepatopancreatite necrosante - Hepatobacter penaei (NHPB) |
NHP.67.F |
5’-CGT-TCA-CGG-GCC-TTG-TAC-AC-3’ |
0,3 uM |
67 pb DNA |
WOAH
Aranguren et al. (2010) |
|
NHP.67.R |
5’-GCT-CAT-CGC-CTT-AAA-GAA-AAG-ATA-A-3’ |
0,3 uM |
|||
|
NHP.67.S |
FAM-5'-CCG-CCC-GTC-AAG-CCA-TGG-AA-3'-TAMRA |
0,1 uM |
|||
|
Elongation factor 1-α (Gene endógeno Penaeus vannamei) |
EF63.RNAshrimp F |
5’-CTC-CTC-TCG-GAC-GTT-TTG-CT-3’ |
0,3 uM |
281pb - |
Anantasomboona et al. (2008) |
|
EF63.RNAshrimp R |
5’-CCT-TGA-TCA-CAC-CCA-CAG-CTA-3’ |
0,3 uM |
|||
|
EF63.RNAshrimp S |
FAM-5'-CCG-TCT-GCT-TCA-TGT-CAC-3'-TAMRA |
0,15 uM |
a) A extração pode ser realizada de forma automatizada ou manual, através de kits de extração de ácidos nucleicos ou reagentes específicos para o tipo de material a ser analisado, seguindo as recomendações do fabricante;
b) Os kits de extração com tecnologia baseada em beads magnéticas apresentam bom desempenho na obtenção de ácidos nucleicos a partir de amostras de camarão;
c) Não utilizar reagentes após a data de validade e não misturar reagentes de lotes diferentes;
d) Adicionar as seguintes amostras controle a cada procedimento de extração: controle de EXTRAÇÃO (água ou tecido sabidamente negativo para o alvo).
a) Realizar o ensaio em duas áreas separadas: uma para o preparo do mix de reação (sala de pré-PCR ou de mix) isenta de material genético e amplicons, e outra para a transferência de DNA/RNA para placa ou microtubos (sala de PCR);
b) Antes e após o preparo do mix de reação, descontaminar a cabine e os materiais a serem utilizados com solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses, ou hipoclorito de sódio a 1%;
c) Limpar as superfícies com álcool 70º INPM;
d) As micropipetas utilizadas para o preparo do mix de reação e adição das amostras devem ser exclusivas para tais finalidades.
a) Preparar o mix de reação de acordo com protocolos validados e específicos para o agente pesquisado, em quantidade suficiente para o número de amostras a serem testadas;
b) Após o preparo do mix, adicionar o DNA/RNA nos poços da placa ou em microtubos para leitura óptica;
c) A adição de DNA/RNA e das amostras controle deve ser realizada em uma área distinta do preparo do mix;
d) Devem ser incluídos nas análises:
I. Controle DETECTADO para o alvo;
II. Controle da EXTRAÇÃO;
III. Controle de REAÇÃO ou Branco (água livre de nucleases);
IV. Controle ENDÓGENO, gene endógeno a ser amplificado para cada amostra testada;
V. Controle DETECTADO e NÃO DETECTADO do kit utilizado, se aplicável.
a) Selar a placa com adesivo óptico ou fechar a tampa dos microtubos. Verificar se há bolhas no fundo do poço e/ou gotículas na parede dos poços da placa ou tubo. Caso isto ocorra, centrifugar brevemente para reduzir as bolhas e para que o conteúdo se posicione na parte inferior da placa ou tubo;
b) Iniciar e entrar com os dados no software do termociclador (identificação das amostras e seleção dos fluoróforos), conforme especificações do fabricante;
c) Inserir a placa ou os tubos no termociclador, salvar o arquivo e iniciar a corrida, conforme ciclagem a ser ajustada de acordo com o mastermix utilizado, ver Quadro 1;
d) Ao finalizar, salvar os dados e interpretar os resultados.
Quadro 1. Ciclagem para o diagnóstico de doenças de camarão para os agentes DNA, considerando o mastermix TaqPath™ ProAmp™ Master Mix, Applied Biosystems.
|
Número de ciclos |
Temperatura |
Tempo |
|
1 |
50ºC |
2 min |
|
1 |
95ºC |
10 min |
|
45 |
95ºC |
15 seg. |
|
60ºC |
1 min |
a) Para a validação do ensaio, o controle DETECTADO deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório;
b) O controle de EXTRAÇÃO, de REAÇÃO e NÃO DETECTADO, devem ter Cq indeterminado ou maior que o limite definido pelo fabricante do kit, pelo processo de verificação de desempenho do método ou pela literatura. Os gráficos desses controles devem apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
a) Ao analisar os resultados da corrida, o operador deve avaliar os seguintes componentes: controle DETECTADO, controle de EXTRAÇÃO, controle de REAÇÃO, background de fluorescência e gráficos de amplificação de cada amostra individualmente. Após a validação do ensaio, interpretar os resultados conforme especificações do fabricante;
b) O limiar de Cq a ser considerado DETECTADO deve ser avaliado conforme definido na verificação de desempenho da técnica, bula do kit ou conforme consta a literatura;
c) Amostras com resultado NÃO DETECTADO para o alvo devem apresentar resultado DETECTADO para o gene endógeno;
d) Qualquer amostra com resultado questionável deverá ser reanalisada;
e) Amostras positivas podem ser submetidas a sequenciamento para confirmação.
a) Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
b) Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
a) Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
b) O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
a) Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
b) Amostras com resultados DETECTADO, não devem ser descartadas sem autorização prévia da CGAL.
a) Imediatamente após a emissão do resultado poderão ser descartados, registrando-se em formulários próprios e conferidas antes do descarte.
São consideradas amostras para diagnóstico do vírus Decapod iridescent virus 1 (DIV1), previamente nomeado como Shrimp hemocyte iridescent virus (SHIV):
a) hepatopâncreas;
b) brânquias;
c) músculo;
d) hemolinfa.
a) Para atendimento aos Programas e Controles Oficiais do MAPA os laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
b) Deverão ser obedecidos os critérios de verificação de conformidade das amostras estabelecidos no Volume I - REGRAS GERAIS.
c) As amostras deverão ser encaminhadas ao laboratório, individualmente e obedecendo a critérios de biossegurança.
a) Somente poderão ser utilizados insumos de diagnóstico que tenham registro no MAPA, segundo legislação em vigor.
b) Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados.
c) O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos.
Nota 1: Com relação às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos:
I – Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente.
II – Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 e 25ºC.
d) Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados.
e) O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios.
f) Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada.
g) Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório.
Nota 2: A utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitida quando:
I – A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos;
II – As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes;
III – O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
QUADRO 1. Sugestão de oligonucleotídeos para o diagnóstico de doenças em camarões.
|
Doença ou alvo |
Iniciadores / Sonda |
Sequência |
Concentração final na reação |
Amplicon / Genoma |
Referência |
|
Decapod iridescent virus 1 (DIV1) |
SHIV.F |
5’-AGG AGA GGG AAA TAA CGG GAA AAC-3’ |
0,5 uM |
188 pb DNA |
Qiu et al. (2018) |
|
SHIV.R |
5’-CGT CAG CAT TTG GTT CAT CCA TG-3’ |
0,5 uM |
|||
|
SHIV.S |
FAM - 5'-CTG CCC ATC TAA CAC CAT CTC CCG CCC-3’ - MGB NFQ |
0,2 uM |
|||
|
Elongation factor 1-α (Gene endógeno Penaeus vannamei) |
EF63.RNAshrimp F |
5’-CTC-CTC-TCG-GAC-GTT-TTG-CT-3’ |
0,3 uM |
281pb - |
Anantasomboona et al. (2008) |
|
EF63.RNAshrimp R |
5’-CCT-TGA-TCA-CAC-CCA-CAG-CTA-3’ |
0,3 uM |
|||
|
EF63.RNAshrimp S |
FAM-5'-CCG-TCT-GCT-TCA-TGT-CAC-3'-TAMRA |
0,15 uM |
a) A extração pode ser realizada de forma automatizada ou manual, através de kits de extração de ácidos nucleicos ou reagentes específicos para o tipo de material a ser analisado, seguindo as recomendações do fabricante;
b) Os kits de extração com tecnologia baseada em beads magnéticas apresentam bom desempenho na obtenção de ácidos nucleicos a partir de amostras de camarão;
c) Não utilizar reagentes após a data de validade e não misturar reagentes de lotes diferentes;
d) Adicionar as seguintes amostras controle a cada procedimento de extração: controle de EXTRAÇÃO (água ou tecido sabidamente negativo para o alvo).
a) Realizar o ensaio em duas áreas separadas: uma para o preparo do mix de reação (sala de pré-PCR ou de mix) isenta de material genético e amplicons, e outra para a transferência de DNA/RNA para placa ou microtubos (sala de PCR);
b) Antes e após o preparo do mix de reação, descontaminar a cabine e os materiais a serem utilizados com solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses, ou hipoclorito de sódio a 1%;
c) Limpar as superfícies com álcool 70º INPM;
d) As micropipetas utilizadas para o preparo do mix de reação e adição das amostras devem ser exclusivas para tais finalidades.
a) Preparar o mix de reação de acordo com protocolos validados e específicos para o agente pesquisado, em quantidade suficiente para o número de amostras a serem testadas;
b) Após o preparo do mix, adicionar o DNA/RNA nos poços da placa ou em microtubos para leitura óptica;
c) A adição de DNA/RNA e das amostras controle deve ser realizada em uma área distinta do preparo do mix;
d) Devem ser incluídos nas análises:
I. Controle DETECTADO para o alvo;
II. Controle da EXTRAÇÃO;
III. Controle de REAÇÃO ou Branco (água livre de nucleases);
IV. Controle ENDÓGENO, gene endógeno a ser amplificado para cada amostra testada;
V. Controle DETECTADO e NÃO DETECTADO do kit utilizado, se aplicável.
a) Selar a placa com adesivo óptico ou fechar a tampa dos microtubos. Verificar se há bolhas no fundo do poço e/ou gotículas na parede dos poços da placa ou tubo. Caso isto ocorra, centrifugar brevemente para reduzir as bolhas e para que o conteúdo se posicione na parte inferior da placa ou tubo;
b) Iniciar e entrar com os dados no software do termociclador (identificação das amostras e seleção dos fluoróforos), conforme especificações do fabricante;
c) Inserir a placa ou os tubos no termociclador, salvar o arquivo e iniciar a corrida, conforme ciclagem a ser ajustada de acordo com o mastermix utilizado, ver Quadro 1;
d) Ao finalizar, salvar os dados e interpretar os resultados.
Quadro 1. Ciclagem para o diagnóstico de doenças de camarão para os agentes DNA, considerando o mastermix TaqPath™ ProAmp™ Master Mix, Applied Biosystems.
|
Número de ciclos |
Temperatura |
Tempo |
|
1 |
50ºC |
2 min |
|
1 |
95ºC |
10 min |
|
45 |
95ºC |
15 seg. |
|
60ºC |
1 min |
a) Para a validação do ensaio, o controle DETECTADO deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório;
b) O controle de EXTRAÇÃO, de REAÇÃO e NÃO DETECTADO, devem ter Cq indeterminado ou maior que o limite definido pelo fabricante do kit, pelo processo de verificação de desempenho do método ou pela literatura. Os gráficos desses controles devem apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
a) Ao analisar os resultados da corrida, o operador deve avaliar os seguintes componentes: controle DETECTADO, controle de EXTRAÇÃO, controle de REAÇÃO, background de fluorescência e gráficos de amplificação de cada amostra individualmente. Após a validação do ensaio, interpretar os resultados conforme especificações do fabricante;
b) O limiar de Cq a ser considerado DETECTADO deve ser avaliado conforme definido na verificação de desempenho da técnica, bula do kit ou conforme consta a literatura;
c) Amostras com resultado NÃO DETECTADO para o alvo devem apresentar resultado DETECTADO para o gene endógeno;
d) Qualquer amostra com resultado questionável deverá ser reanalisada;
e) Amostras positivas podem ser submetidas a sequenciamento para confirmação.
a) Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
b) Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
a) Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
b) O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
a) Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
b) Amostras com resultados DETECTADO, não devem ser descartadas sem autorização prévia da CGAL.
a) Imediatamente após a emissão do resultado poderão ser descartados, registrando-se em formulários próprios e conferidas antes do descarte.
São consideradas amostras para o diagnóstico da Síndrome de Taura:
a) epitélio cuticular;
b) brânquias;
c) pleópodes;
d) hemolinfa.
a) Para atendimento aos Programas e Controles Oficiais do MAPA os laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
b) Deverão ser obedecidos os critérios de verificação de conformidade das amostras estabelecidos no Volume I - REGRAS GERAIS.
c) As amostras deverão ser encaminhadas ao laboratório, individualmente e obedecendo a critérios de biossegurança.
a) Somente poderão ser utilizados insumos de diagnóstico que tenham registro no MAPA, segundo legislação em vigor.
b) Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados.
c) O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos.
Nota 1: Com relação às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos:
I – Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente.
II – Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 e 25ºC.
d) Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados.
e) O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios.
f) Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada.
g) Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório.
Nota 2: A utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitida quando:
I – A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos;
II – As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes;
III – O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
QUADRO 1. Sugestão de oligonucleotídeos para o diagnóstico de doenças em camarões.
|
Doença ou alvo |
Iniciadores / Sonda |
Sequência |
Concentração final na reação |
Amplicon / Genoma |
Referência |
|
Taura syndrome virus (TSV) |
TSV71.F |
5’-TTG-GGC-ACC-AAA-CGA-CAT-T-3’ |
0,3 uM |
72 pb RNA |
WOAH
Tang et al. (2004) |
|
TSV71.R |
5’-GGG-AGC-TTA-AAC-TGG-ACA-CAC-TGT-3’ |
0,3 uM |
|||
|
TSV71.S |
FAM - 5'-CAG-CAC-TGA-CGC-ACA-ATA-TTC-GAG-CAT-C-3’ - MGB NFQ |
0,1 uM |
|||
|
Elongation factor 1-α (Gene endógeno Penaeus vannamei) |
EF63.RNAshrimp F |
5’-CTC-CTC-TCG-GAC-GTT-TTG-CT-3’ |
0,3 uM |
281pb - |
Anantasomboona et al. (2008) |
|
EF63.RNAshrimp R |
5’-CCT-TGA-TCA-CAC-CCA-CAG-CTA-3’ |
0,3 uM |
|||
|
EF63.RNAshrimp S |
FAM-5'-CCG-TCT-GCT-TCA-TGT-CAC-3'-TAMRA |
0,15 uM |
a) A extração pode ser realizada de forma automatizada ou manual, através de kits de extração de ácidos nucleicos ou reagentes específicos para o tipo de material a ser analisado, seguindo as recomendações do fabricante;
b) Os kits de extração com tecnologia baseada em beads magnéticas apresentam bom desempenho na obtenção de ácidos nucleicos a partir de amostras de camarão;
c) Não utilizar reagentes após a data de validade e não misturar reagentes de lotes diferentes;
d) Adicionar as seguintes amostras controle a cada procedimento de extração: controle de EXTRAÇÃO (água ou tecido sabidamente negativo para o alvo).
a) Realizar o ensaio em duas áreas separadas: uma para o preparo do mix de reação (sala de pré-PCR ou de mix) isenta de material genético e amplicons, e outra para a transferência de DNA/RNA para placa ou microtubos (sala de PCR);
b) Antes e após o preparo do mix de reação, descontaminar a cabine e os materiais a serem utilizados com solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses, ou hipoclorito de sódio a 1%;
c) Limpar as superfícies com álcool 70º INPM;
d) As micropipetas utilizadas para o preparo do mix de reação e adição das amostras devem ser exclusivas para tais finalidades.
a) Preparar o mix de reação de acordo com protocolos validados e específicos para o agente pesquisado, em quantidade suficiente para o número de amostras a serem testadas;
b) Após o preparo do mix, adicionar o DNA/RNA nos poços da placa ou em microtubos para leitura óptica;
c) A adição de DNA/RNA e das amostras controle deve ser realizada em uma área distinta do preparo do mix;
d) Devem ser incluídos nas análises:
I. Controle DETECTADO para o alvo;
II. Controle da EXTRAÇÃO;
III. Controle de REAÇÃO ou Branco (água livre de nucleases);
IV. Controle ENDÓGENO, gene endógeno a ser amplificado para cada amostra testada;
V. Controle DETECTADO e NÃO DETECTADO do kit utilizado, se aplicável.
a) Selar a placa com adesivo óptico ou fechar a tampa dos microtubos. Verificar se há bolhas no fundo do poço e/ou gotículas na parede dos poços da placa ou tubo. Caso isto ocorra, centrifugar brevemente para reduzir as bolhas e para que o conteúdo se posicione na parte inferior da placa ou tubo;
b) Iniciar e entrar com os dados no software do termociclador (identificação das amostras e seleção dos fluoróforos), conforme especificações do fabricante;
c) Inserir a placa ou os tubos no termociclador, salvar o arquivo e iniciar a corrida, conforme ciclagem a ser ajustada de acordo com o mastermix utilizado, ver Quadro 1;
d) Ao finalizar, salvar os dados e interpretar os resultados.
Quadro 1. Ciclagem para o diagnóstico de doenças de camarão para os agentes DNA, considerando o mastermix TaqPath™ ProAmp™ Master Mix, Applied Biosystems.
|
Número de ciclos |
Temperatura |
Tempo |
|
1 |
45ºC |
10 min |
|
1 |
95ºC |
10 min |
|
45 |
95ºC |
15 seg. |
|
60ºC |
45 seg. |
a) Para a validação do ensaio, o controle DETECTADO deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório;
b) O controle de EXTRAÇÃO, de REAÇÃO e NÃO DETECTADO, devem ter Cq indeterminado ou maior que o limite definido pelo fabricante do kit, pelo processo de verificação de desempenho do método ou pela literatura. Os gráficos desses controles devem apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
a) Ao analisar os resultados da corrida, o operador deve avaliar os seguintes componentes: controle DETECTADO, controle de EXTRAÇÃO, controle de REAÇÃO, background de fluorescência e gráficos de amplificação de cada amostra individualmente. Após a validação do ensaio, interpretar os resultados conforme especificações do fabricante;
b) O limiar de Cq a ser considerado DETECTADO deve ser avaliado conforme definido na verificação de desempenho da técnica, bula do kit ou conforme consta a literatura;
c) Amostras com resultado NÃO DETECTADO para o alvo devem apresentar resultado DETECTADO para o gene endógeno;
d) Qualquer amostra com resultado questionável deverá ser reanalisada;
e) Amostras positivas podem ser submetidas a sequenciamento para confirmação.
a) Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
b) Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
a) Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
b) O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
a) Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
b) Amostras com resultados DETECTADO, não devem ser descartadas sem autorização prévia da CGAL.
a) Imediatamente após a emissão do resultado poderão ser descartados, registrando-se em formulários próprios e conferidas antes do descarte.
São consideradas amostras para a detecção do criptosporídeo Enterocytozoon hepatopenaei (EHP):
a) hepatopâncreas.
a) Para atendimento aos Programas e Controles Oficiais do MAPA os laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
b) Deverão ser obedecidos os critérios de verificação de conformidade das amostras estabelecidos no Volume I - REGRAS GERAIS.
c) As amostras deverão ser encaminhadas ao laboratório, individualmente e obedecendo a critérios de biossegurança.
a) Somente poderão ser utilizados insumos de diagnóstico que tenham registro no MAPA, segundo legislação em vigor.
b) Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados.
c) O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos.
Nota 1: Com relação às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos:
I – Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente.
II – Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 e 25ºC.
d) Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados.
e) O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios.
f) Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada.
g) Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório.
Nota 2: A utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitida quando:
I – A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos;
II – As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes;
III – O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
QUADRO 1. Sugestão de oligonucleotídeos para o diagnóstico de doenças em camarões.
|
Doença ou alvo |
Iniciadores / Sonda |
Sequência |
Concentração final na reação |
Amplicon / Genoma |
Referência |
|
Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) |
EHP-bTub.F |
5'-GAT TTG AGA AAA TTG GCG GTT AA-3' |
0,3 uM |
84 pb DNA |
Piamsomboon et al. (2019) |
|
EHP-bTub.R |
5'-TTC TGA ACA CAG AGG CGC ATA-3 |
0,3 uM |
|||
|
EHP-bTub.S |
VIC - 5'-TGA TTC CAT TTC CAC GAC TGC ACT TTT TC-3’ - TAMRA |
0,1 uM |
|||
|
Elongation factor 1-α (Gene endógeno Penaeus vannamei) |
EF63.RNAshrimp F |
5’-CTC-CTC-TCG-GAC-GTT-TTG-CT-3’ |
0,3 uM |
281pb - |
Anantasomboona et al. (2008) |
|
EF63.RNAshrimp R |
5’-CCT-TGA-TCA-CAC-CCA-CAG-CTA-3’ |
0,3 uM |
|||
|
EF63.RNAshrimp S |
FAM-5'-CCG-TCT-GCT-TCA-TGT-CAC-3'-TAMRA |
0,15 uM |
a) A extração pode ser realizada de forma automatizada ou manual, através de kits de extração de ácidos nucleicos ou reagentes específicos para o tipo de material a ser analisado, seguindo as recomendações do fabricante;
b) Os kits de extração com tecnologia baseada em beads magnéticas apresentam bom desempenho na obtenção de ácidos nucleicos a partir de amostras de camarão;
c) Não utilizar reagentes após a data de validade e não misturar reagentes de lotes diferentes;
d) Adicionar as seguintes amostras controle a cada procedimento de extração: controle de EXTRAÇÃO (água ou tecido sabidamente negativo para o alvo).
a) Realizar o ensaio em duas áreas separadas: uma para o preparo do mix de reação (sala de pré-PCR ou de mix) isenta de material genético e amplicons, e outra para a transferência de DNA/RNA para placa ou microtubos (sala de PCR);
b) Antes e após o preparo do mix de reação, descontaminar a cabine e os materiais a serem utilizados com solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses, ou hipoclorito de sódio a 1%;
c) Limpar as superfícies com álcool 70º INPM;
d) As micropipetas utilizadas para o preparo do mix de reação e adição das amostras devem ser exclusivas para tais finalidades.
a) Preparar o mix de reação de acordo com protocolos validados e específicos para o agente pesquisado, em quantidade suficiente para o número de amostras a serem testadas;
b) Após o preparo do mix, adicionar o DNA/RNA nos poços da placa ou em microtubos para leitura óptica;
c) A adição de DNA/RNA e das amostras controle deve ser realizada em uma área distinta do preparo do mix;
d) Devem ser incluídos nas análises:
I. Controle DETECTADO para o alvo;
II. Controle da EXTRAÇÃO;
III. Controle de REAÇÃO ou Branco (água livre de nucleases);
IV. Controle ENDÓGENO, gene endógeno a ser amplificado para cada amostra testada;
V. Controle DETECTADO e NÃO DETECTADO do kit utilizado, se aplicável.
a) Selar a placa com adesivo óptico ou fechar a tampa dos microtubos. Verificar se há bolhas no fundo do poço e/ou gotículas na parede dos poços da placa ou tubo. Caso isto ocorra, centrifugar brevemente para reduzir as bolhas e para que o conteúdo se posicione na parte inferior da placa ou tubo;
b) Iniciar e entrar com os dados no software do termociclador (identificação das amostras e seleção dos fluoróforos), conforme especificações do fabricante;
c) Inserir a placa ou os tubos no termociclador, salvar o arquivo e iniciar a corrida, conforme ciclagem a ser ajustada de acordo com o mastermix utilizado, ver Quadro 1;
d) Ao finalizar, salvar os dados e interpretar os resultados.
Quadro 1. Ciclagem para o diagnóstico de doenças de camarão para os agentes DNA, considerando o mastermix TaqPath™ ProAmp™ Master Mix, Applied Biosystems.
|
Número de ciclos |
Temperatura |
Tempo |
|
1 |
50ºC |
2 min |
|
1 |
95ºC |
10 min |
|
45 |
95ºC |
15 seg. |
|
60ºC |
1 min |
a) Para a validação do ensaio, o controle DETECTADO deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório;
b) O controle de EXTRAÇÃO, de REAÇÃO e NÃO DETECTADO, devem ter Cq indeterminado ou maior que o limite definido pelo fabricante do kit, pelo processo de verificação de desempenho do método ou pela literatura. Os gráficos desses controles devem apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
a) Ao analisar os resultados da corrida, o operador deve avaliar os seguintes componentes: controle DETECTADO, controle de EXTRAÇÃO, controle de REAÇÃO, background de fluorescência e gráficos de amplificação de cada amostra individualmente. Após a validação do ensaio, interpretar os resultados conforme especificações do fabricante;
b) O limiar de Cq a ser considerado DETECTADO deve ser avaliado conforme definido na verificação de desempenho da técnica, bula do kit ou conforme consta a literatura;
c) Amostras com resultado NÃO DETECTADO para o alvo devem apresentar resultado DETECTADO para o gene endógeno;
d) Qualquer amostra com resultado questionável deverá ser reanalisada;
e) Amostras positivas podem ser submetidas a sequenciamento para confirmação.
a) Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
b) Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
a) Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
b) Amostras com resultados DETECTADO, não devem ser descartadas sem autorização prévia da CGAL.
a) Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
b) Amostras com resultados DETECTADO, não devem ser descartadas sem autorização prévia da CGAL.
a) Imediatamente após a emissão do resultado poderão ser descartados, registrando-se em formulários próprios e conferidas antes do descarte.
São consideradas amostras para a detecção do material genético do Hepatopancreatic parvovirus (HPV) , agente que infecta camarões, o tecido:
a) Hepatopâncreas.
a) Para atendimento aos Programas e Controles Oficiais do MAPA os laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
b) Deverão ser obedecidos os critérios de verificação de conformidade das amostras estabelecidos no Volume I - REGRAS GERAIS.
c) As amostras deverão ser encaminhadas ao laboratório, individualmente e obedecendo a critérios de biossegurança.
a) Somente poderão ser utilizados insumos de diagnóstico que tenham registro no MAPA, segundo legislação em vigor.
b) Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados.
c) O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos.
Nota 1: Com relação às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos:
I – Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente.
II – Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 e 25ºC.
d) Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados.
e) O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios.
f) Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada.
g) Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório.
Nota 2: A utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitida quando:
I – A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos;
II – As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes;
III – O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
QUADRO 1. Sugestão de oligonucleotídeos para o diagnóstico de doenças em camarões.
|
Doença ou alvo |
Iniciadores / Sonda |
Sequência |
Concentração final na reação |
Amplicon / Genoma |
Referência |
|
Hepatopancreatic parvovirus (HPV) |
HPV.F |
5'-ACT TTG TTG GCG GCG ATA GT-3' |
0,6 uM |
92 pb DNA |
Yan et al. (2010) |
|
HPV.R |
5'-TGT CGA TGT CGT TCT GTC GTT AA-3' |
0,6 uM |
|||
|
HPV.S |
FAM - 5'-CGC AGA ACG ATC AGA GCA ATC CGA A’ - QSY |
0,6 uM |
|||
|
Elongation factor 1-α (Gene endógeno Penaeus vannamei) |
EF63.RNAshrimp F |
5’-CTC-CTC-TCG-GAC-GTT-TTG-CT-3’ |
0,3 uM |
281pb - |
Anantasomboona et al. (2008) |
|
EF63.RNAshrimp R |
5’-CCT-TGA-TCA-CAC-CCA-CAG-CTA-3’ |
0,3 uM |
|||
|
EF63.RNAshrimp S |
FAM-5'-CCG-TCT-GCT-TCA-TGT-CAC-3'-TAMRA |
0,15 uM |
a) A extração pode ser realizada de forma automatizada ou manual, através de kits de extração de ácidos nucleicos ou reagentes específicos para o tipo de material a ser analisado, seguindo as recomendações do fabricante;
b) Os kits de extração com tecnologia baseada em beads magnéticas apresentam bom desempenho na obtenção de ácidos nucleicos a partir de amostras de camarão;
c) Não utilizar reagentes após a data de validade e não misturar reagentes de lotes diferentes;
d) Adicionar as seguintes amostras controle a cada procedimento de extração: controle de EXTRAÇÃO (água ou tecido sabidamente negativo para o alvo).
a) Realizar o ensaio em duas áreas separadas: uma para o preparo do mix de reação (sala de pré-PCR ou de mix) isenta de material genético e amplicons, e outra para a transferência de DNA/RNA para placa ou microtubos (sala de PCR);
b) Antes e após o preparo do mix de reação, descontaminar a cabine e os materiais a serem utilizados com solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses, ou hipoclorito de sódio a 1%;
c) Limpar as superfícies com álcool 70º INPM;
d) As micropipetas utilizadas para o preparo do mix de reação e adição das amostras devem ser exclusivas para tais finalidades.
a) Preparar o mix de reação de acordo com protocolos validados e específicos para o agente pesquisado, em quantidade suficiente para o número de amostras a serem testadas;
b) Após o preparo do mix, adicionar o DNA/RNA nos poços da placa ou em microtubos para leitura óptica;
c) A adição de DNA/RNA e das amostras controle deve ser realizada em uma área distinta do preparo do mix;
d) Devem ser incluídos nas análises:
I. Controle DETECTADO para o alvo;
II. Controle da EXTRAÇÃO;
III. Controle de REAÇÃO ou Branco (água livre de nucleases);
IV. Controle ENDÓGENO, gene endógeno a ser amplificado para cada amostra testada;
V. Controle DETECTADO e NÃO DETECTADO do kit utilizado, se aplicável.
a) Selar a placa com adesivo óptico ou fechar a tampa dos microtubos. Verificar se há bolhas no fundo do poço e/ou gotículas na parede dos poços da placa ou tubo. Caso isto ocorra, centrifugar brevemente para reduzir as bolhas e para que o conteúdo se posicione na parte inferior da placa ou tubo;
b) Iniciar e entrar com os dados no software do termociclador (identificação das amostras e seleção dos fluoróforos), conforme especificações do fabricante;
c) Inserir a placa ou os tubos no termociclador, salvar o arquivo e iniciar a corrida, conforme ciclagem a ser ajustada de acordo com o mastermix utilizado, ver Quadro 1;
d) Ao finalizar, salvar os dados e interpretar os resultados.
Quadro 1. Ciclagem para o diagnóstico de doenças de camarão para os agentes DNA, considerando o mastermix TaqPath™ ProAmp™ Master Mix, Applied Biosystems.
|
Número de ciclos |
Temperatura |
Tempo |
|
1 |
50ºC |
2 min |
|
1 |
95ºC |
10 min |
|
45 |
95ºC |
15 seg. |
|
60ºC |
1 min |
a) Para a validação do ensaio, o controle DETECTADO deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório;
b) O controle de EXTRAÇÃO, de REAÇÃO e NÃO DETECTADO, devem ter Cq indeterminado ou maior que o limite definido pelo fabricante do kit, pelo processo de verificação de desempenho do método ou pela literatura. Os gráficos desses controles devem apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
a) Ao analisar os resultados da corrida, o operador deve avaliar os seguintes componentes: controle DETECTADO, controle de EXTRAÇÃO, controle de REAÇÃO, background de fluorescência e gráficos de amplificação de cada amostra individualmente. Após a validação do ensaio, interpretar os resultados conforme especificações do fabricante;
b) O limiar de Cq a ser considerado DETECTADO deve ser avaliado conforme definido na verificação de desempenho da técnica, bula do kit ou conforme consta a literatura;
c) Amostras com resultado NÃO DETECTADO para o alvo devem apresentar resultado DETECTADO para o gene endógeno;
d) Qualquer amostra com resultado questionável deverá ser reanalisada;
e) Amostras positivas podem ser submetidas a sequenciamento para confirmação.
a) Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
b) Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
a) Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
b) O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
a) Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
b) Amostras com resultados DETECTADO, não devem ser descartadas sem autorização prévia da CGAL.
a) Imediatamente após a emissão do resultado poderão ser descartados, registrando-se em formulários próprios e conferidas antes do descarte.
São consideradas amostras para diagnóstico da Mortalidade Oculta (CMD):
a) hepatopâncreas.
a) Para atendimento aos Programas e Controles Oficiais do MAPA os laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
b) Deverão ser obedecidos os critérios de verificação de conformidade das amostras estabelecidos no Volume I - REGRAS GERAIS.
c) As amostras deverão ser encaminhadas ao laboratório, individualmente e obedecendo a critérios de biossegurança.
a) Somente poderão ser utilizados insumos de diagnóstico que tenham registro no MAPA, segundo legislação em vigor.
b) Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados.
c) O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos.
Nota 1: Com relação às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos:
I – Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente.
II – Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 e 25ºC.
d) Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados.
e) O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios.
f) Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada.
g) Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório.
Nota 2: A utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitida quando:
I – A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos;
II – As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes;
III – O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
QUADRO 1. Sugestão de oligonucleotídeos para o diagnóstico de doenças em camarões.
|
Doença ou alvo |
Iniciadores / Sonda |
Sequência |
Concentração final na reação |
Amplicon / Genoma |
Referência |
|
Covert mortality nodavirus (CMNV) |
CMN199.F |
5'-CGA GCT AAT CCA AGC ACT TC-3' |
0,2 uM |
198 pb RNA |
Li et al. (2018) |
|
CMN199.R |
5'-ACC TGT TAG GTA CGC TAC CA-3' |
0,2 uM |
|||
|
CMNV199.S |
VIC - 5'-CGC TCA CGG CTT TGG ATA CCT T-3 - MGB NFQ |
0,2 uM |
|||
|
Elongation factor 1-α (Gene endógeno Penaeus vannamei) |
EF63.RNAshrimp F |
5’-CTC-CTC-TCG-GAC-GTT-TTG-CT-3’ |
0,3 uM |
281pb - |
Anantasomboona et al. (2008) |
|
EF63.RNAshrimp R |
5’-CCT-TGA-TCA-CAC-CCA-CAG-CTA-3’ |
0,3 uM |
|||
|
EF63.RNAshrimp S |
FAM-5'-CCG-TCT-GCT-TCA-TGT-CAC-3'-TAMRA |
0,15 uM |
a) A extração pode ser realizada de forma automatizada ou manual, através de kits de extração de ácidos nucleicos ou reagentes específicos para o tipo de material a ser analisado, seguindo as recomendações do fabricante;
b) Os kits de extração com tecnologia baseada em beads magnéticas apresentam bom desempenho na obtenção de ácidos nucleicos a partir de amostras de camarão;
c) Não utilizar reagentes após a data de validade e não misturar reagentes de lotes diferentes;
d) Adicionar as seguintes amostras controle a cada procedimento de extração: controle de EXTRAÇÃO (água ou tecido sabidamente negativo para o alvo).
a) Realizar o ensaio em duas áreas separadas: uma para o preparo do mix de reação (sala de pré-PCR ou de mix) isenta de material genético e amplicons, e outra para a transferência de DNA/RNA para placa ou microtubos (sala de PCR);
b) Antes e após o preparo do mix de reação, descontaminar a cabine e os materiais a serem utilizados com solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses, ou hipoclorito de sódio a 1%;
c) Limpar as superfícies com álcool 70º INPM;
d) As micropipetas utilizadas para o preparo do mix de reação e adição das amostras devem ser exclusivas para tais finalidades.
a) Preparar o mix de reação de acordo com protocolos validados e específicos para o agente pesquisado, em quantidade suficiente para o número de amostras a serem testadas;
b) Após o preparo do mix, adicionar o DNA/RNA nos poços da placa ou em microtubos para leitura óptica;
c) A adição de DNA/RNA e das amostras controle deve ser realizada em uma área distinta do preparo do mix;
d) Devem ser incluídos nas análises:
I. Controle DETECTADO para o alvo;
II. Controle da EXTRAÇÃO;
III. Controle de REAÇÃO ou Branco (água livre de nucleases);
IV. Controle ENDÓGENO, gene endógeno a ser amplificado para cada amostra testada;
V. Controle DETECTADO e NÃO DETECTADO do kit utilizado, se aplicável.
a) Selar a placa com adesivo óptico ou fechar a tampa dos microtubos. Verificar se há bolhas no fundo do poço e/ou gotículas na parede dos poços da placa ou tubo. Caso isto ocorra, centrifugar brevemente para reduzir as bolhas e para que o conteúdo se posicione na parte inferior da placa ou tubo;
b) Iniciar e entrar com os dados no software do termociclador (identificação das amostras e seleção dos fluoróforos), conforme especificações do fabricante;
c) Inserir a placa ou os tubos no termociclador, salvar o arquivo e iniciar a corrida, conforme ciclagem a ser ajustada de acordo com o mastermix utilizado, ver Quadro 1;
d) Ao finalizar, salvar os dados e interpretar os resultados.
Quadro 1. Ciclagem para o diagnóstico de doenças de camarão para os agentes DNA, considerando o mastermix TaqPath™ ProAmp™ Master Mix, Applied Biosystems.
|
Número de ciclos |
Temperatura |
Tempo |
|
1 |
45ºC |
10 min |
|
1 |
95ºC |
10 min |
|
45 |
95ºC |
15 seg. |
|
60ºC |
45 seg. |
a) Para a validação do ensaio, o controle DETECTADO deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório;
b) O controle de EXTRAÇÃO, de REAÇÃO e NÃO DETECTADO, devem ter Cq indeterminado ou maior que o limite definido pelo fabricante do kit, pelo processo de verificação de desempenho do método ou pela literatura. Os gráficos desses controles devem apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
a) Ao analisar os resultados da corrida, o operador deve avaliar os seguintes componentes: controle DETECTADO, controle de EXTRAÇÃO, controle de REAÇÃO, background de fluorescência e gráficos de amplificação de cada amostra individualmente. Após a validação do ensaio, interpretar os resultados conforme especificações do fabricante;
b) O limiar de Cq a ser considerado DETECTADO deve ser avaliado conforme definido na verificação de desempenho da técnica, bula do kit ou conforme consta a literatura;
c) Amostras com resultado NÃO DETECTADO para o alvo devem apresentar resultado DETECTADO para o gene endógeno;
d) Qualquer amostra com resultado questionável deverá ser reanalisada;
e) Amostras positivas podem ser submetidas a sequenciamento para confirmação.
a) Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
b) Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
a) Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
b) O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
a) Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
b) Amostras com resultados DETECTADO, não devem ser descartadas sem autorização prévia da CGAL.
a) Imediatamente após a emissão do resultado poderão ser descartados, registrando-se em formulários próprios e conferidas antes do descarte.
São consideradas amostras para diagnóstico da Doença da Cauda Branca (WTD):
a) músculo;
b) pleópodes;
c) brânquias.
a) Para atendimento aos Programas e Controles Oficiais do MAPA os laboratórios credenciados somente receberão as amostras previstas na legislação em vigor para as finalidades e ensaios previstos no seu escopo de credenciamento.
b) Deverão ser obedecidos os critérios de verificação de conformidade das amostras estabelecidos no Volume I - REGRAS GERAIS.
c) As amostras deverão ser encaminhadas ao laboratório, individualmente e obedecendo a critérios de biossegurança.
a) Somente poderão ser utilizados insumos de diagnóstico que tenham registro no MAPA, segundo legislação em vigor.
b) Todos os insumos utilizados na análise devem ser controlados e previamente testados e aprovados.
c) O laboratório deverá realizar os ensaios obedecendo às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos.
Nota 1: Com relação às temperaturas preconizadas pelo fabricante dos insumos:
I – Quando esta informação não constar na bula o laboratório deverá consultar o fabricante, mesmo que a indicação seja de realização a temperatura ambiente.
II – Quando não informado pelo fabricante, serão considerados como temperatura ambiente, valores de temperatura entre 18 e 25ºC.
d) Antes da utilização dos insumos, realizar a avaliação de todos os parâmetros referentes aos lotes e valores de ponto de corte dos critérios interpretação dos resultados.
e) O laboratório deve estabelecer um meio de avaliação apropriado para todos os insumos utilizados nos ensaios.
f) Devem ser retidos os registros dos controles dos ensaios realizados, devendo ser registrada data e responsável de todas as etapas realizadas para cada amostra analisada.
g) Os resultados encontrados para cada amostra e controles, dados dos insumos utilizados e outras informações pertinentes devem ser registrados em formulários próprios e/ou sistema informatizado do próprio laboratório.
Nota 2: A utilização de sistemas informatizados para registros apenas é permitida quando:
I – A inclusão dos dados for realizada durante a execução e leitura do ensaio, sem anotação prévia em formulários de papel. Dados transcritos não são considerados dados brutos;
II – As alterações de informações estejam prontamente disponíveis e rastreáveis, sem a necessidade de intervenção de especialistas em informática ou geração de logs ou equivalentes;
III – O dado anterior, o responsável pela alteração e a data da realização da alteração estiver prontamente disponível.
QUADRO 1. Sugestão de oligonucleotídeos para o diagnóstico de doenças em camarões.
|
Doença ou alvo |
Iniciadores / Sonda |
Sequência |
Concentração final na reação |
Amplicon / Genoma |
Referência |
|
White tail disease (WTD) - Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) |
MrNV.75.F |
5’- CAACTC GGT ATG GAA CTC AAG GT – 3’ |
0,4 uM |
75 pb RNA |
Zhang et al. (2006)
WOAH |
|
MrNV.75.R |
5’ AGG AAA TAC ACG AGC AAG AAA AGT C – 3’ |
0,4 uM |
|||
|
MrNV.75.S |
FAM – 5’ -ACC CTT CGA CCC CAG CAA TGG TG – 3’ MGB NFQ |
0,08 uM |
|||
|
Elongation factor 1-α (Gene endógeno Penaeus vannamei) |
EF63.RNAshrimp F |
5’-CTC-CTC-TCG-GAC-GTT-TTG-CT-3’ |
0,3 uM |
281pb - |
Anantasomboona et al. (2008) |
|
EF63.RNAshrimp R |
5’-CCT-TGA-TCA-CAC-CCA-CAG-CTA-3’ |
0,3 uM |
|||
|
EF63.RNAshrimp S |
FAM-5'-CCG-TCT-GCT-TCA-TGT-CAC-3'-TAMRA |
0,15 uM |
a) A extração pode ser realizada de forma automatizada ou manual, através de kits de extração de ácidos nucleicos ou reagentes específicos para o tipo de material a ser analisado, seguindo as recomendações do fabricante;
b) Os kits de extração com tecnologia baseada em beads magnéticas apresentam bom desempenho na obtenção de ácidos nucleicos a partir de amostras de camarão;
c) Não utilizar reagentes após a data de validade e não misturar reagentes de lotes diferentes;
d) Adicionar as seguintes amostras controle a cada procedimento de extração: controle de EXTRAÇÃO (água ou tecido sabidamente negativo para o alvo).
a) Realizar o ensaio em duas áreas separadas: uma para o preparo do mix de reação (sala de pré-PCR ou de mix) isenta de material genético e amplicons, e outra para a transferência de DNA/RNA para placa ou microtubos (sala de PCR);
b) Antes e após o preparo do mix de reação, descontaminar a cabine e os materiais a serem utilizados com solução descontaminante de moléculas residuais de RNAs / DNAs / amplicons /resíduos de proteínas de superfícies, entre as quais DNAses/RNAses, ou hipoclorito de sódio a 1%;
c) Limpar as superfícies com álcool 70º INPM;
d) As micropipetas utilizadas para o preparo do mix de reação e adição das amostras devem ser exclusivas para tais finalidades.
a) Preparar o mix de reação de acordo com protocolos validados e específicos para o agente pesquisado, em quantidade suficiente para o número de amostras a serem testadas;
b) Após o preparo do mix, adicionar o DNA/RNA nos poços da placa ou em microtubos para leitura óptica;
c) A adição de DNA/RNA e das amostras controle deve ser realizada em uma área distinta do preparo do mix;
d) Devem ser incluídos nas análises:
I. Controle DETECTADO para o alvo;
II. Controle da EXTRAÇÃO;
III. Controle de REAÇÃO ou Branco (água livre de nucleases);
IV. Controle ENDÓGENO, gene endógeno a ser amplificado para cada amostra testada;
V. Controle DETECTADO e NÃO DETECTADO do kit utilizado, se aplicável.
a) Selar a placa com adesivo óptico ou fechar a tampa dos microtubos. Verificar se há bolhas no fundo do poço e/ou gotículas na parede dos poços da placa ou tubo. Caso isto ocorra, centrifugar brevemente para reduzir as bolhas e para que o conteúdo se posicione na parte inferior da placa ou tubo;
b) Iniciar e entrar com os dados no software do termociclador (identificação das amostras e seleção dos fluoróforos), conforme especificações do fabricante;
c) Inserir a placa ou os tubos no termociclador, salvar o arquivo e iniciar a corrida, conforme ciclagem a ser ajustada de acordo com o mastermix utilizado, ver Quadro 1;
d) Ao finalizar, salvar os dados e interpretar os resultados.
Quadro 1. Ciclagem para o diagnóstico de doenças de camarão para os agentes DNA, considerando o mastermix TaqPath™ ProAmp™ Master Mix, Applied Biosystems.
|
Número de ciclos |
Temperatura |
Tempo |
|
1 |
45ºC |
10 min |
|
1 |
95ºC |
10 min |
|
45 |
95ºC |
15 seg. |
|
60ºC |
45 seg. |
a) Para a validação do ensaio, o controle DETECTADO deve apresentar uma curva sigmoide (em forma de S) e um Cq satisfatório;
b) O controle de EXTRAÇÃO, de REAÇÃO e NÃO DETECTADO, devem ter Cq indeterminado ou maior que o limite definido pelo fabricante do kit, pelo processo de verificação de desempenho do método ou pela literatura. Os gráficos desses controles devem apresentar traços de fluorescência na linha de base durante todo o ensaio. Esses traços não devem apresentar curva sigmoide ou um aumento gradual na fluorescência.
a) Ao analisar os resultados da corrida, o operador deve avaliar os seguintes componentes: controle DETECTADO, controle de EXTRAÇÃO, controle de REAÇÃO, background de fluorescência e gráficos de amplificação de cada amostra individualmente. Após a validação do ensaio, interpretar os resultados conforme especificações do fabricante;
b) O limiar de Cq a ser considerado DETECTADO deve ser avaliado conforme definido na verificação de desempenho da técnica, bula do kit ou conforme consta a literatura;
c) Amostras com resultado NÃO DETECTADO para o alvo devem apresentar resultado DETECTADO para o gene endógeno;
d) Qualquer amostra com resultado questionável deverá ser reanalisada;
e) Amostras positivas podem ser submetidas a sequenciamento para confirmação.
a) Os resultados deverão ser emitidos e expressos como “DETECTADO”, “NÃO DETECTADO” ou “INCONCLUSIVO”;
b) Expressar a quantidade de alíquotas positivas ou negativas dentre o total de alíquotas analisadas.
a) Os materiais descartados devem ser separados adequadamente entre resíduos químicos e biológicos;
b) O laboratório deve assegurar a biosseguridade dos resíduos gerados e seguir as legislações ambientais vigentes para o descarte.
a) Após um período mínimo de 30 dias da realização das análises, as amostras negativas poderão ser descartadas, registrando-se nos formulários próprios e conferidas antes do descarte;
b) Amostras com resultados DETECTADO, não devem ser descartadas sem autorização prévia da CGAL.
a) Imediatamente após a emissão do resultado poderão ser descartados, registrando-se em formulários próprios e conferidas antes do descarte.
BRASIL. Ministério da Agricultura e Pecuária. Secretaria de Defesa Agropecuária (SDA). Portaria SDA/MAPA nº 1110, de 13 de maio de 2024. Aprova os métodos oficiais para realização de ensaios dos programas e controles oficiais do Ministério da Agricultura e Pecuária. Diário Oficial da União: Seção 1, p. 3, 07 jun. 2024.
White spot syndrome virus (WSSV)
ANANTASOMBOONA G., POONKHUMC R., SITTIDILOKRATNAB N., FLEGELB T. W., WITHYACHUMNARNKULA B. Low viral loads and lymphoid organ spheroids are associated with yellow head virus (YHV) tolerance in whiteleg shrimp Penaeus vannamei. Developmental and Comparative Immunology (2008) 32, 613–626.
DURAND S.V. & LIGHTNER D.V. Quantitative real time PCR for the measurement of white spot syndrome virus in shrimp. J. Fish Dis., 25, 381–389, 2002.
WOAH. Infection with white spot syndrome virus. CHAPTER 2.2.8.Version (NB: Version adopted in 2023). Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals, 2023, versão online. Disponível em https://www.woah.org/fileadmin/Home/eng/Health_standards/aahm/current/2.2.08_WSSV.pdf. Acesso em: 31 de dezembro de 2025.
Necrose Infecciosa Hipodermal e Hematopoiética – Decapod hepanhamaparvovirus 1 (PStDV1 - IHHNV)
ANANTASOMBOONA G., POONKHUMC R., SITTIDILOKRATNAB N., FLEGELB T. W., WITHYACHUMNARNKULA B. Low viral loads and lymphoid organ spheroids are associated with yellow head virus (YHV) tolerance in whiteleg shrimp Penaeus vannamei. Developmental and Comparative Immunology (2008) 32, 613–626.
TANG K.F.J. & LIGHTNER D.V. Detection and quantification of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus in penaeid shrimp by real-time PCR. Dis. Aquat. Org., 44, 79–85, 2001.
WOAH. Infection with infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus. CHAPTER 2.2.4.Version (NB: Version adopted in 2023). Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals, 2023, versão online. Disponível em https://www.woah.org/fileadmin/Home/eng/Health_standards/aahm/current/2.2.04_IHHN.pdf. Acesso em: 31 de dezembro de 2025.
Doença da Cabeça Amarela - Yellow head virus (YHV)
ANANTASOMBOONA G., POONKHUMC R., SITTIDILOKRATNAB N., FLEGELB T. W., WITHYACHUMNARNKULA B. Low viral loads and lymphoid organ spheroids are associated with yellow head virus (YHV) tolerance in whiteleg shrimp Penaeus vannamei. Developmental and Comparative Immunology (2008) 32, 613–626.
Mionecrose Infecciosa - Infectious myonecrosis virus (IMNV)
ANANTASOMBOONA G., POONKHUMC R., SITTIDILOKRATNAB N., FLEGELB T. W., WITHYACHUMNARNKULA B. Low viral loads and lymphoid organ spheroids are associated with yellow head virus (YHV) tolerance in whiteleg shrimp Penaeus vannamei. Developmental and Comparative Immunology (2008) 32, 613–626.
ANDRADE T.P.D., SRISUVAN T., TANG K.F.J. & LIGHTNER D.V. (2007). Real-time reverse transcription polymerase chain reaction assay using TaqMan probe for detection and quantification of infectious myonecrosis virus (IMNV). Aquaculture, 264, 9–15.
WOAH.Infection with infectious myonecrosis virus. CHAPTER 2.2.5.Version (NB: Version adopted in 2023). Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals, 2023, versão online. Disponível em https://www.woah.org/fileadmin/Home/eng/Health_standards/aahm/current/2.2.05_IMN.pdf. Acesso em: 31 de dezembro de 2025.
Síndrome da Necrose Hepatopancreática Aguda - (AHPND)
ANANTASOMBOONA G., POONKHUMC R., SITTIDILOKRATNAB N., FLEGELB T. W., WITHYACHUMNARNKULA B. Low viral loads and lymphoid organ spheroids are associated with yellow head virus (YHV) tolerance in whiteleg shrimp Penaeus vannamei. Developmental and Comparative Immunology (2008) 32, 613–626.
HAN J.E., TANG K.F.J., PANTOJA C.R., WHITE B.L. & LIGHTNER D.V. qPCR assay for detecting and quantifying a virulence plasmid in acute hepatopancreatic necrosis disease (AHPND) due to pathogenic Vibrio parahaemolyticus. Aquaculture, 442, 12–15, 2015.
WOAH.Acute hepatopancreatic necrosis disease. CHAPTER 2.2.1.Version (NB: Version adopted in 2023). Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals, 2023, versão online. Disponível em https://www.woah.org/fileadmin/Home/eng/Health_standards/aahm/current/2.2.01_AHPND.pdf. Acesso em: 31 de dezembro de 2025.
Hepatopancreatite necrosante - Hepatobacter penaei (NHPB)
ANANTASOMBOONA G., POONKHUMC R., SITTIDILOKRATNAB N., FLEGELB T. W., WITHYACHUMNARNKULA B. Low viral loads and lymphoid organ spheroids are associated with yellow head virus (YHV) tolerance in whiteleg shrimp Penaeus vannamei. Developmental and Comparative Immunology (2008) 32, 613–626.
ARANGUREN L.F., TANG K.F.J. & LIGHTNER D.V. Quantification of the bacterial agent of necrotizing hepatopancreatitis (NHP-B) by real-time PCR and comparison of survival and NHP load of two shrimp populations. Aquaculture, 307, 187–192, 2010.
WOAH.Infection with Hepatobacter penaei (Necrotising hepatopancreatitis). CHAPTER 2.2.3.Version (NB: Version adopted in 2023). Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals, 2023, versão online. Disponível em https://www.woah.org/fileadmin/Home/eng/Health_standards/aahm/current/2.2.03_NHP.pdf. Acesso em: 31 de dezembro de 2025.
Decapod iridescent virus 1 (DIV1)
ANANTASOMBOONA G., POONKHUMC R., SITTIDILOKRATNAB N., FLEGELB T. W., WITHYACHUMNARNKULA B. Low viral loads and lymphoid organ spheroids are associated with yellow head virus (YHV) tolerance in whiteleg shrimp Penaeus vannamei. Developmental and Comparative Immunology (2008) 32, 613–626.
QIU, L.; CHEN, M.M.; WAN, X.Y.; ZHANG, Q.L.; LI, C.; DONG, X.; YANG, B.; HUANG, J. Detection and quantification of shrimp hemocyte iridescent virus by TaqMan probe based real-time PCR. J. Invertebr. Pathol. 2018, 154, 95–101.
Taura syndrome virus (TSV)
ANANTASOMBOONA G., POONKHUMC R., SITTIDILOKRATNAB N., FLEGELB T. W., WITHYACHUMNARNKULA B. Low viral loads and lymphoid organ spheroids are associated with yellow head virus (YHV) tolerance in whiteleg shrimp Penaeus vannamei. Developmental and Comparative Immunology (2008) 32, 613–626.
TANG K.F.J., WANG J. & LIGHTNER D.V. (2004). Quantitation of Taura syndrome virus by real-time RT-PCR with a TaqMan assay. J. Virol. Methods, 115, 109–114.
WOAH. Infection with Taura syndrome virus. CHAPTER 2.2.7.Version (NB: Version adopted in 2023). Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals, 2023, versão online. Disponível em https://www.woah.org/fileadmin/Home/eng/Health_standards/aahm/current/2.2.07_TS.pdf. Acesso em: 31 de dezembro de 2025.
Enterocytozoon hepatopenaei (EHP)
ANANTASOMBOONA G., POONKHUMC R., SITTIDILOKRATNAB N., FLEGELB T. W., WITHYACHUMNARNKULA B. Low viral loads and lymphoid organ spheroids are associated with yellow head virus (YHV) tolerance in whiteleg shrimp Penaeus vannamei. Developmental and Comparative Immunology (2008) 32, 613–626.
PIAMSOMBOON P., CHOI S-K., HANGGONO B., NURAINI Y.L., WATI F., TANG. K.F.J., PARK S., KWAK D., RHEE M.H., HAN J.E., KIM H.H. Quantification of Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) in Penaeid Shrimps from Southeast Asia and Latin America Using TaqMan Probe-Based Quantitative PCR. Pathogens 2019, 8, 233; doi:10.3390/pathogens8040233
Hepatopancreatic parvovirus (HPV)
ANANTASOMBOONA G., POONKHUMC R., SITTIDILOKRATNAB N., FLEGELB T. W., WITHYACHUMNARNKULA B. Low viral loads and lymphoid organ spheroids are associated with yellow head virus (YHV) tolerance in whiteleg shrimp Penaeus vannamei. Developmental and Comparative Immunology (2008) 32, 613–626.
YAN D.C., TANG K.F.J., LIGHTNER D.V. A real-time PCR for the detection of hepatopancreatic parvovirus (HPV) of penaeid shrimp. Journal of Fish Diseases 2010, 33, 507–511.
Covert mortality nodavirus (CMNV)
ANANTASOMBOONA G., POONKHUMC R., SITTIDILOKRATNAB N., FLEGELB T. W., WITHYACHUMNARNKULA B. Low viral loads and lymphoid organ spheroids are associated with yellow head virus (YHV) tolerance in whiteleg shrimp Penaeus vannamei. Developmental and Comparative Immunology (2008) 32, 613–626.
LI X-P., WAN W-Y., XU T-T., HUANG J. and ZHANG Q-L. (2018). Development and validation of a TaqMan RT-qPCR for the detection of convert mortality nodavirus (CMNV). J. Virol. Methods, 262, 65–71.
Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV)
ANANTASOMBOONA G., POONKHUMC R., SITTIDILOKRATNAB N., FLEGELB T. W., WITHYACHUMNARNKULA B. Low viral loads and lymphoid organ spheroids are associated with yellow head virus (YHV) tolerance in whiteleg shrimp Penaeus vannamei. Developmental and Comparative Immunology (2008) 32, 613–626.
ZHANG H, WANG J, YUAN J, LI L, ZHANG J, BONAMI JR, SHI Z. Quantitative relationship of two viruses (MrNV and XSV) in white-tail disease of Macrobrachium rosenbergii. Dis Aquat Organ. 2006 Jul 11;71(1):11-7.
WOAH. Infection with Macrobrachium rosenbergii nodavirus (White tail disease). CHAPTER 2.2.6. Version (NB: Version adopted in 2017). Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals, 2021, versão online. Disponível em https://www.woah.org/fileadmin/Home/eng/Health_standards/aahm/current/2.2.06_WTD.pdf. Acesso em: 31 de dezembro de 2025.
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| Versão | Conteúdo alterado | Data | Motivo |
|---|---|---|---|
| 1 | - | 11/02/2026 | Elaboração do documento |