¶ Manual de Métodos Oficiais para Análise de Produtos de Origem Animal - Métodos Microbiológicos
¶ Folha de Resumo
© 2024 Ministério da Agricultura e Pecuária. Todos os direitos reservados. É permitida a reprodução parcial ou total desta obra, desde que citada a fonte e que não seja para venda ou qualquer fim comercial. A responsabilidade pelos direitos autorais de textos e imagens desta obra é do autor.
Ano 2024
Elaboração, distribuição, informações:
Ministério da Agricultura e Pecuária
Secretaria de Defesa Agropecuária - SDA
Departamento de Serviços Técnicos - DTEC
Esplanada dos Ministérios, Bloco D, Anexo, Ala B, 4º andar, sala 433
CEP: 70043-900, Brasília - DF
www.agricultura.gov.br
e- mail: cgal@agro.gov.br
Central de Relacionamento: 0800 704 1995
Equipe técnica:
- Aldemir Reginato Ribeiro – LFDA/RS
- Lilian Cristina da Silva Magalhães Costa – LFDA/PA
- Katarina Mendonça Ribeiro – LFDA/PE
- Kátia Patuska Ferreira – LFDA/GO
- Suzana Horta Fonseca – LFDA/MG
- Virna Clemente – LFDA/SP
- Wanderson Clay Porcino Silva – SEFAC/CQL/CGAL
¶ Folha de rosto
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Macroprocesso: Laboratórios |
Objetivo: Estabelecer os métodos oficiais de ensaios para análise microbiológica de amostras de produtos de origem animal destinados aos laboratórios oficiais e credenciados da Rede Nacional de Laboratórios Agropecuários. |
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Processo: Análises Laboratoriais |
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Entrega: Segurança e qualidade de alimentos |
Público alvo e demais interessados: Laboratórios oficiais ou credenciados do Ministério da Agricultura e Pecuária (Mapa) |
Versão do documento: 2 |
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Setor responsável e responsabilidades A Coordenação Geral de Laboratórios Agropecuários do Departamento de Serviços Técnicos é responsável pela elaboração, atualização e envio para aprovação deste manual, tendo responsabilidade quanto aos procedimentos descritos no documento. |
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¶ 1. Métodos normalizados
¶ 1.1 Água de abastecimento industrial e gelo
| Determinação | Técnica | Método |
|---|---|---|
| Coliformes totais | Membrana filtrante | ISO 9308-1 |
| Clostridium perfringens | Membrana filtrante | ISO 14189 |
| Enterococcus spp. | Membrana filtrante | ISO 7899-2 |
| Escherichia coli | Membrana filtrante | ISO 9308-1 |
| Microrganismos heterotróficos estritos e não viáveis | Contagem por inoculação em profundidade | SMWW.2882.188 |
| Microrganismos viáveis a 36 °C | Contagem por inoculação em profundidade | ISO 6222 |
| Microrganismos viáveis a 22 °C | Contagem por inoculação em profundidade | ISO 6222 |
| Pseudomonas aeruginosa | Membrana filtrante | ISO 16266 |
¶ 1.2 Carnes e produtos cárneos
| Determinação | Técnica | Método |
|---|---|---|
| Bacillus cereus | Contagem por inoculação em superfície | ISO 7932 |
| Campylobacter spp. | Contagem por inoculação em superfície | AFNOR BIO 12/43-04/20 |
| Campylobacter spp. | Contagem por inoculação em superfície | ISO 10272-2 |
| Clostridium perfringens | Contagem por inoculação em profundidade | ISO 15213-2 |
| Coliformes termotolerantes a 45 °C | Contagem por inoculação em profundidade | Contagem de Coliformes Termotolerantes e Coliformes Totais em alimentos, neste manual |
| Coliformes termotolerantes a 45 °C | Contagem por inoculação em superfície | AFNOR 3M 01/02-09/89C |
| Coliformes termotolerantes a 45 °C | Enumeração por Número Mais Provável (NMP) | APHA chapter 9. |
| Detecção de Salmonella Typhimurium e Salmonella Enteritidis | Detecção por reação em cadeia de polimerase | AOAC PTM 121001 |
| Coliformes totais | Enumeração por Número Mais Provável (NMP) | ISO 4831 |
| Detecção de Salmonella Typhimurium e Salmonella Enteritidis | Sorotipificação | ISO 6579-3 |
| Enterobacteriaceae | Contagem por inoculação em profundidade | ISO 21528-2 |
| Enterobacteriaceae | Contagem por inoculação em superfície | AFNOR 3M 01/06-09/97 |
| Escherichia coli | Contagem por inoculação em profundidade | ISO 16649-2 |
| Escherichia coli | Contagem por inoculação em superfície | AOAC 998,08 |
| Escherichia coli | Enumeração por Número Mais Provável (NMP) | ISO 7251 |
| Escherichia coli | Enumeração por Número Mais Provável (NMP) | ISO 16649-3 |
| Esterilidade comercial | Incubação da amostra | Teste de Esterilidade Comercial para Alimentos de Baixa Acidez - pH > 4,6 neste manual |
| Listeria monocytogenes | Detecção e isolamento | ISO 11290-1 |
| Listeria monocytogenes | Detecção e isolamento | MLG 8 |
| Listeria monocytogenes | Detecção presuntiva por amplificação do DNA e bioluminescência | AFNOR 3M 01/15-09/16 |
| Listeria monocytogenes | Detecção presuntiva por amplificação do DNA e bioluminescência | AOAC 2016,08 |
| Listeria monocytogenes | Detecção presuntiva por reação em cadeia de polimerase | AFNOR QUA 18/05-07/08 |
| Listeria monocytogenes | Detecção presuntiva por reação imunoenzimática | AFNOR BIO 12/11-03/04 |
| Listeria monocytogenes | Detecção presuntiva por reação imunoenzimática | AOAC 2004,02 |
| Mesófilos aeróbios viáveis a 30 °C | Contagem por inoculação em profundidade | ISO 4833-1 |
| Mesófilos aeróbios viáveis a 30 °C | Contagem por inoculação em superfície | AFNOR 3M 01/01-09/89 |
| Salmonella spp. | Detecção e isolamento | ISO 6579-1 |
| Salmonella spp. | Detecção e isolamento | MLG 4 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por amplificação do DNA e bioluminescência | AOAC 2013,09 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por amplificação do DNA e bioluminescência | AFNOR 3M 01/16-11/16 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por amplificação do DNA e bioluminescência | AOAC 2016,01 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por reação em cadeia de polimerase | AFNOR QUA 18/03-11/02 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por reação imunoenzimática | AFNOR BIO 12/16-09/05 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por reação imunoenzimática | AFNOR BIO 12/32-10/11 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por reação imunoenzimática | AOAC 2011.03 |
| Sete principais Escherichia coli produtoras de toxina Shiga (STECs) | Detecção e isolamento | MLG 5C |
| Staphylococcus coagulase positiva | Contagem por inoculação em superfície | AFNOR 3M 01/09-04/03 |
| Staphylococcus aureus | Contagem por inoculação em superfície | AOAC 2003.11 |
| Staphylococcus coagulase positiva | Contagem por inoculação em superfície | ISO 6888-1 |
| Staphylococcus coagulase positiva | Enumeração por Número Mais Provável (NMP) | ISO 6888-3 |
¶ 1.3 Leite e produtos lácteos
| Determinação | Técnica | Método |
|---|---|---|
| Bacillus cereus | Contagem por inoculação em superfície | ISO 7932 |
| Bactérias acidófilas específicas | Contagem por inoculação em profundidade | IDF 117 ISO 7889 |
| Bolores e leveduras | Contagem por inoculação em profundidade | IDF 94 ISO 6611 |
| Coliformes termotolerantes a 45 °C | Contagem por inoculação em profundidade | Contagem de Coliformes Termotolerantes e Coliformes Totais em alimentos, neste manual |
| Coliformes termotolerantes a 45 °C | Contagem por inoculação em superfície | AFNOR 3M 01/02-09/89C |
| Coliformes termotolerantes a 45 °C | Enumeração por Número Mais Provável (NMP) | APHA chapter 9. |
| Coliformes totais a 30°C | Contagem por inoculação em profundidade | ISO 4832 |
| Coliformes totais a 30°C | Contagem por inoculação em superfície | AOAC 991.14 |
| Coliformes totais a 30°C | Enumeração por Número Mais Provável (NMP) | ISO 4831 |
| Enterobacteriaceae | Contagem por inoculação em profundidade | ISO 21528-2 |
| Enterobacteriaceae | Contagem por inoculação em superfície | AFNOR 3M 01/06-09/97 |
| Enterotoxinas estafilocócicas | Detecção presuntiva por reação imunoenzimática | AOAC 2007,06 |
| Escherichia coli | Contagem por inoculação em profundidade | ISO 16649-2 |
| Escherichia coli | Contagem por inoculação em superfície | AOAC 998,08 |
| Escherichia coli | Enumeração por Número Mais Provável (NMP) | ISO 7251 |
| Listeria monocytogenes | Detecção e isolamento | ISO 11290-1 |
| Listeria monocytogenes | Detecção presuntiva por amplificação do DNA e bioluminescência | AFNOR 3M 01/15-09/16 |
| Listeria monocytogenes | Detecção presuntiva por amplificação do DNA e bioluminescência | AOAC 2016,08 |
| Listeria monocytogenes | Detecção presuntiva por reação em cadeia de polimerase | AFNOR QUA 18/05-07/08 |
| Listeria monocytogenes | Detecção presuntiva por reação imunoenzimática | AFNOR BIO 12/11-03/04 |
| Listeria monocytogenes | Detecção presuntiva por reação imunoenzimática | AOAC 2004,02 |
| Mesófilos aeróbios viáveis a 30 °C | Contagem por inoculação em profundidade | ISO 4833-1 |
| Mesófilos aeróbios viáveis a 30 °C | Contagem por inoculação em superfície | AFNOR 3M 01/01-09/89 |
| Mesófilos aeróbios viáveis a 30 °C | Contagem por inoculação em superfície | ISO 4833-2 |
| Salmonella spp. | Detecção e isolamento | ISO 6579-1 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por reação em cadeia de polimerase | AFNOR QUA 18/03-11/02 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por reação imunoenzimática | AFNOR BIO 12/16-09/05 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por reação imunoenzimática | AFNOR BIO 12/32-10/11 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por reação imunoenzimática | AOAC 2011.03 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por amplificação do DNA e bioluminescência | AFNOR 3M 01/16-11/16 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por amplificação do DNA e bioluminescência | AOAC 2016,01 |
| Staphylococcus coagulase positiva | Contagem por inoculação em superfície | AFNOR 3M 01/09-04/03 |
| Staphylococcus coagulase positiva | Contagem por inoculação em superfície | ISO 6888-1 |
| Staphylococcus coagulase positiva | Enumeração por Número Mais Provável (NMP) | ISO 6888-3 |
¶ 1.4 Mel e produtos apícolas
| Determinação | Técnica | Método |
|---|---|---|
| Bolores e leveduras | Contagem por inoculação em profundidade | IDF 94 ISO 6611 |
| Coliformes termotolerantes a 45 °C | Enumeração por Número Mais Provável (NMP) | APHA chapter 9. |
| Salmonella spp. | Detecção e isolamento | ISO 6579-1 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por amplificação do DNA e bioluminescência | AFNOR 3M 01/16-11/16 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por reação em cadeia de polimerase | AFNOR QUA 18/03-11/02 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por reação imunoenzimática | AFNOR BIO 12/16-09/05 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por reação imunoenzimática | AOAC 2011.03 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por reação imunoenzimática | AFNOR BIO 12/32-10/11 |
¶ 1.5 Ovos e derivados
| Determinação | Técnica | Método |
|---|---|---|
| Bolores e leveduras | Contagem por inoculação em superfície | ISO 21527-1 |
| Coliformes termotolerantes a 45 °C | Enumeração por Número Mais Provável (NMP) | APHA chapter 9. |
| Enterobacteriaceae | Contagem por inoculação em profundidade | ISO 21528-2 |
| Enterobacteriaceae | Contagem por inoculação em superfície | AFNOR 3M 01/06-09/97 |
| Listeria monocytogenes | Detecção e isolamento | ISO 11290-1 |
| Listeria monocytogenes | Detecção presuntiva por reação em cadeia de polimerase | AFNOR QUA 18/05-07/08 |
| Listeria monocytogenes | Detecção presuntiva por reação imunoenzimática | AFNOR BIO 12/11-03/04 |
| Listeria monocytogenes | Detecção presuntiva por reação imunoenzimática | AOAC 2004,02 |
| Mesófilos aeróbios viáveis a 30 °C | Contagem por inoculação em profundidade | ISO 4833-1 |
| Mesófilos aeróbios viáveis a 30 °C | Contagem por inoculação em superfície | AFNOR 3M 01/01-09/89 |
| Mesófilos aeróbios viáveis a 30 °C | Contagem por inoculação em superfície | ISO 4833-2 |
| Salmonella spp. | Detecção e isolamento | ISO 6579-1 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por amplificação do DNA e bioluminescência | AFNOR 3M 01/16-11/16 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por amplificação do DNA e bioluminescência | AOAC 2016,01 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por reação em cadeia de polimerase | AFNOR QUA 18/03-11/02 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por reação imunoenzimática | AFNOR BIO 12/16-09/05 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por reação imunoenzimática | AFNOR BIO 12/32-10/11 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por reação imunoenzimática | AOAC 2011.03 |
| Staphylococcus aureus | Detecção e isolamento | ISO 6888-3 |
| Staphylococcus coagulase positiva | Contagem por inoculação em superfície | AFNOR 3M 01/09-04/03 |
| Staphylococcus coagulase positiva | Contagem por inoculação em superfície | ISO 6888-1 |
| Staphylococcus coagulase positiva | Enumeração por Número Mais Provável (NMP) | ISO 6888-3 |
¶ 1.6 Pescados e produtos da pesca
| Determinação | Técnica | Método |
|---|---|---|
| Bacillus cereus | Contagem por inoculação em superfície | ISO 7932 |
| Coliformes termotolerantes a 45 °C | Contagem por inoculação em profundidade | Contagem de Coliformes Termotolerantes e Coliformes Totais em alimentos, neste manual |
| Coliformes termotolerantes a 45 °C | Contagem por inoculação em superfície | AFNOR 3M 01/02-09/89C |
| Escherichia coli | Contagem por inoculação em profundidade | ISO 16649-2 |
| Escherichia coli | Contagem por inoculação em superfície | AOAC 998,08 |
| Escherichia coli | Enumeração por Número Mais Provável (NMP) | ISO 7251 |
| Escherichia coli | Enumeração por Número Mais Provável (NMP) | ISO 16649-3 |
| Esterilidade comercial | Incubação da amostra | Teste de Esterilidade Comercial para Alimentos de Baixa Acidez - pH > 4,6 neste manual |
| Listeria monocytogenes | Detecção e isolamento | ISO 11290-1 |
| Listeria monocytogenes | Detecção presuntiva por amplificação do DNA e bioluminescência | AFNOR 3M 01/15-09/16 |
| Listeria monocytogenes | Detecção presuntiva por amplificação do DNA e bioluminescência | AOAC 2016,08 |
| Listeria monocytogenes | Detecção presuntiva por reação em cadeia de polimerase | AFNOR QUA 18/05-07/08 |
| Listeria monocytogenes | Detecção presuntiva por reação imunoenzimática | AFNOR BIO 12/11-03/04 |
| Listeria monocytogenes | Detecção presuntiva por reação imunoenzimática | AOAC 2004,02 |
| Salmonella spp. | Detecção e isolamento | ISO 6579-1 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por amplificação do DNA e bioluminescência | AFNOR 3M 01/16-11/16 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por amplificação do DNA e bioluminescência | AOAC 2013,09 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por amplificação do DNA e bioluminescência | AOAC 2016,01 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por reação em cadeia de polimerase | AFNOR QUA 18/03-11/02 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por reação imunoenzimática | AFNOR BIO 12/16-09/05 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por reação imunoenzimática | AFNOR BIO 12/32-10/11 |
| Salmonella spp. | Detecção presuntiva por reação imunoenzimática | AOAC 2011.03 |
| Staphylococcus coagulase positiva | Contagem por inoculação em superfície | ISO 6888-1 |
| Staphylococcus coagulase positiva | Contagem por inoculação em superfície | AFNOR 3M 01/09-04/03 |
| Vibrio colerae | Detecção e isolamento | ISO 21872-1 |
| Vibrio parahaemolyticus | Enumeração por Número Mais Provável (NMP) | Número Mais Provável de Vibrio parahaemolyticus neste manual |
| Vibrio parahaemolyticus | Detecção e isolamento | ISO 21872-1 |
¶ 2. Contagem de Coliformes Termotolerantes e Coliformes Totais em alimentos
¶ Princípio
Prova presuntiva: baseia-se na inoculação das diluições desejadas das amostras sob teste em ágar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA) e posterior contagem das colônias suspeitas. O ágar cristal violeta vermelho neutro bile apresenta em sua composição sais biliares e cristal violeta, responsáveis pela inibição de microrganismos Gram positivos e vermelho neutro, um indicador de pH que revela a fermentação da lactose pelos microrganismos presentes. A adição de sobrecamada visa à prevenção do crescimento e do espraiamento de colônias na superfície do ágar.
Prova confirmativa para coliformes totais: a confirmação da presença de coliformes totais é feita por meio da inoculação das colônias suspeitas em caldo verde brilhante bile 2% lactose e posterior incubação a (35 ± 1)°C. A presença de gás nos tubos de Durham evidencia a fermentação da lactose presente no meio. O caldo verde brilhante bile 2% lactose apresenta em sua composição bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante) responsáveis pela inibição de microrganismos Gram positivos.
Prova confirmativa para coliformes termotolerantes: a confirmação da presença de coliformes termotolerantes é feita por meio da inoculação das colônias suspeitas em caldo EC e posterior incubação em temperatura seletiva de (45,0 ± 0,2)°C, em banho-maria com agitação ou circulação de água. A presença de gás nos tubos de Durham evidencia a fermentação da lactose presente no meio. O caldo EC apresenta em sua composição uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante impedindo a sua acidificação. A seletividade é devido a presença de sais biliares responsáveis pela inibição de microrganismos Gram positivos.
¶ Campo de aplicação
Contagem de coliformes totais e coliformes termotolerantes em amostras de matérias-primas, alimentos e rações, devendo ser utilizado quando o limite máximo tolerado for igual ou superior a 100 UFC/g ou mL.
¶ Materiais e equipamentos
- Vidrarias e equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos;
- Banho-maria com movimentação de água (agitação ou circulação).
¶ Meios de cultura, reagentes e soluções
- Insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos;
- Ágar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA);
- Caldo verde brilhante bile 2% lactose;
- Caldo EC;
- Solução salina peptonada 0,1%.
¶ Preparo da amostra
- Após seu recebimento no laboratório as amostras devem ser mantidas até o momento do início da análise de acordo com norma ISO específica.
- Pesar 25 g ± 5% ou pipetar 25 mL ± 5% da amostra.
- Adicionar 225 mL de solução salina peptonada 0,1%.
- Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em “stomacher”.
Esta é a diluição 10-1.
¶ Procedimentos da análise
¶ Procedimentos de controle
Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório.
¶ Prova presuntiva
A partir da diluição inicial (10-1), efetuar as demais diluições desejadas em solução salina peptonada 0,1%. No caso de produtos líquidos a inoculação pode ser realizada a partir da diluição 100.
Sempre utilizar mais de uma placa, seja uma duplicata da mesma diluição, seja duas ou mais de diluições diferentes.
Inocular 1 mL de cada diluição desejada em placas de Petri esterilizadas. Adicionar a cada placa cerca de 15 mL de VRBA previamente fundido e mantido a 46°C–48°C em banho-maria. Homogeneizar cuidadosamente e deixar em repouso até total solidificação do meio. Adicionar, sobre cada placa, cerca de 10 mL de VRBA previamente fundido e mantido a 46°C–48°C em banho-maria, formando uma segunda camada de meio. Deixar solidificar.
Após completa solidificação do meio, incubar as placas em posição invertida em temperatura de (35 ± 1)°C por 18 a 24 horas.
As contagens deverão ser realizadas imediatamente após o período de incubação das placas. Na impossibilidade de realizar a contagem imediatamente após o período de incubação, manter as placas sob refrigeração em temperatura de 4°C a 7°C por um período não superior a 24 horas. Esse procedimento não deve tornar-se uma prática rotineira.
As colônias deverão ser contadas com o auxílio de contador de colônias, o qual deverá:
- estar equipado com placa de vidro ou acrílico, com diâmetro compatível com o das placas utilizadas, dividido milimetricamente em quadrantes com 1 cm2 de área e com iluminação artificial uniforme;
- ter capacidade para aumento de 1 a 2 vezes, com dispositivo de regulagem de altura para melhor ajuste do foco, podendo ainda dispor de sistema eletrônico ou manual de registro das contagens; e
- estar localizado em local onde não haja incidência direta de luz sobre a plataforma de apoio da placa, para evitar possíveis enganos na identificação das colônias.
Utilizar o estereoscópio para observação de características morfológicas das colônias, para diferenciar microrganismos de partículas da amostra ou do meio e para seleção e isolamento de colônias.
Verificar sempre a proporcionalidade dos resultados obtidos nas diluições sucessivas.
Selecionar placas que contenham entre 15 e 150 colônias.
Contar as colônias que apresentarem morfologia típica de coliformes, ou seja, colônias róseas com 0,5 a 2 mm de diâmetro rodeadas ou não por uma zona de precipitação da bile presente no meio. Anotar os resultados de contagem.
Contar separadamente colônias típicas e atípicas e submeter 3 a 5 colônias de cada uma às provas confirmativas.
¶ Provas confirmativas
¶ Coliformes totais
Inocular cada uma das colônias típicas e atípicas selecionadas em tubos contendo caldo verde brilhante bile 2% lactose. Incubar os tubos a (35 ± 1)°C por 24 h a 48 h.
A presença de coliformes totais é confirmada pela formação de gás (mínimo 1/10 do volume total do tubo de Durham) ou efervescência quando agitado gentilmente. Anotar o resultado obtido para cada colônia, bem como a diluição utilizada.
Observação: A leitura pode ser feita após 24 horas de incubação, porém, só serão válidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo deverão ser reincubados por mais 24 horas.
¶ Coliformes termotolerantes
Inocular as culturas suspeitas de coliformes termotolerantes em tubos contendo caldo EC. Incubar os tubos a (45,0 ± 0,2)°C por 24 a 48 horas em banho maria com agitação.
A presença de coliformes termotolerantes é confirmada pela formação de gás (mínimo 1/10 do volume total do tubo de Durham) ou efervescência quando agitado gentilmente. Anotar o resultado obtido para cada tubo, bem como a diluição utilizada.
Observação: A leitura pode ser feita após 24 horas de incubação, porém, só serão válidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo deverão ser reincubados por mais 24 horas.
¶ Expressão dos resultados
Para alimentos comercializados no MERCOSUL os resultados da contagem de coliformes termotolerantes correspondem à determinação “coliformes a 45°C”.
A aplicação de procedimentos de controle durante o processo analítico visa à garantia da confiabilidade do resultado final, assegurando a sua repetibilidade, precisão e exatidão.
A precisão e a exatidão do método também dependerão da correta observação e aplicação dos procedimentos padronizados estabelecidos para a área analítica.
A garantia da validade dos resultados da contagem estará assegurada quando os resultados dos controles indicarem não haver qualquer falha em nenhuma etapa do processo analítico.
Para o cálculo final das contagens de coliformes totais e termotolerantes, proceder de acordo com o estabelecido na ISO específica.
Expressar o resultado em UFC/g ou mL.
¶ Bibliografia
BRASIL. Ministério da Agricultura e do Abastecimento. Regulamentos técnicos de identidade e qualidade de leite e produtos lácteos. Ministério da Agricultura e do Abastecimento/ Secretaria de Defesa Animal/ Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal/ Divisão de Normas Técnicas. Brasília, D.F. Série Regulamentação Técnica de Identidade e Qualidade de Produtos de Origem Animal; n.2, 1997, 77p.
International Commission on Microbiological Specifications for Foods. Microorganismos de los Alimentos - Técnicas de Análisis Microbiológico. International Commission on Microbiological Specifications for Foods. V.1. 2. ed. Acribia, Zaragoza, Espanha.
Hitchins, A. D.; Feng, P.; Watkins W. D.; Rippey S. R.; Chandler L. A. Escherichia coli and the Coliform bacteria. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponível em: http://www.cfsan.fda.gov.
Kornacki, J. L.; Johnson, J. L. Enterobacteriaceae, Coliforms and Escherichia coli as Quality and Safety Indicators. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p. 69-82.
¶ 3. Número Mais Provável de Vibrio parahaemolyticus
¶ Princípio
¶ Provas presuntivas
Enriquecimento em caldo seletivo: Inoculação em meio de cultura de enriquecimento seletivo caldo glicose sal Teepol (GSTB) ou caldo Horie arabinose violeta de etila (HAEB), em que a presença de Vibrio parahaemolyticus é evidenciada pela turvação do meio após a incubação. Em sua composição, o meio GSTB apresenta teepol, solução aquosa de sulfatos de sódio alcalinos primários que atuam na membrana citoplasmática de microrganismos Gram positivos, inibindo o seu crescimento e formalina que funciona como um agente antimicrobiano. Como o Vibrio parahaemolyticus é halófilo obrigatório, os dois meios contém 3% de cloreto de sódio.
Isolamento em ágar tiossulfato citrato sacarose sais biliares (TCBS): Isolamento se realiza em ágar TCBS, meio seletivo altamente alcalino que contém elevada concentração de tiossulfato e citrato de sódio, responsáveis pela inibição do crescimento das enterobactérias presentes. A bile e o colato de sódio inibem os enterococos. Como indicador de pH, o meio possui o azul de timol e o azul de bromotimol que alteram a cor do meio para amarelo quando da formação de ácido pelos microrganismos que fermentam a sacarose contida no meio.
¶ Provas de identificação
A identificação de Vibrio parahaemolyticus é feita por meio de provas bioquímicas, sorológicas, morfológicas e tintoriais.
¶ Campo de aplicação
Determinação do número mais provável de Vibrio parahaemolyticus em amostras de amostras de pescado e derivados.
¶ Materiais e equipamentos
Vidraria e equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos.
¶ Meios de cultura, reagentes e soluções
Insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos;
- Ágar Müeller-Hinton sal 3%;
- Ágar nutriente sal 3%;
- Ágar gelatina sal 3%;
- Ágar soja triptona sal 3%;
- Ágar tiossulfato citrato sacarose sais biliares (TCBS);
- Ágar ferro três açúcares (TSI) sal 3% ou Ágar Kligler sal 3%;
- Ágar motilidade sal 3
- Caldo glicose sal teepol (GSTB) ou Caldo Horie arabinose violeta de etila (HAEB);
- Caldo peptonado sem sal;
- Caldo peptonado sal 3%, 6%, 8% e 10%;
- Caldo ONPG sal 3%;
- Caldo vermelho de fenol manitol sal 3%;
- Caldo vermelho de fenol sacarose sal 3%;
- Caldo vermelho de fenol arabinose sal 3%;
- Caldo vermelho de fenol arginina sal 3%;
- Caldo vermelho de fenol lisina sal 3%;
- Meio O/F (Hugh-Leifson) sal 3%;
- Solução salina peptonada 0,1% sal 3%;
- Solução fisiológica (NaCl 0,85%);
- Agente vibriostático O 129 10 μg;
- Agente vibriostático O 129 150 μg;
- Arabinose;
- L-arginina;
- L-lisina;
- Manitol;
- Sacarose;
- Óleo mineral ou parafina líquida estéreis;
- Reativo para Oxidase (oxalato de p-amino-dimetilanilina ou N,N,N’,N’-tetrametil-p-fenileno-diamina);
- Teepol;
- O-nitrofenil-β-D-galactopiranosídeo ou p-nitrofenil-β-D-galactosídeo;
- Etanol 96%;
- Reagentes para coloração de Gram.
¶ Preparo da amostra
Após seu recebimento no laboratório as amostras devem ser mantidas até o momento do início da análise de acordo com norma ISO específica.
- Pesar 50 g da amostra;
- Adicionar 450 mL de Caldo peptonado sal 3%;
- Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em “stomacher”.
Esta é a diluição 10-1.
¶ Procedimento da análise
¶ Procedimentos de controle
Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório.
¶ Provas presuntivas
¶ Inoculação em caldo de enriquecimento seletivo
A partir da diluição inicial (10-1), efetuar as demais diluições desejadas em Caldo peptonado sal 3% (no mínimo mais duas diluições). Inocular volumes de 1 mL de cada uma das diluições desejadas em séries de 3 tubos contendo GSTB ou caldo HAEB. Incubar os tubos a (36 ± 1)°C por 18 horas a 24 horas.
A presença de turvação do meio indica a suspeita da presença de Vibrio parahaemolyticus. Anotar o número de tubos de cada série que apresentaram turvação.
¶ Isolamento em ágar tiossulfato citrato sais biliares (TCBS)
A partir de cada tubo de GSTB ou HAEB que apresentar turvação, sem agitá-lo e com auxílio de uma alça de níquel-cromo, de platina ou descartável estéril, retirar uma alçada do crescimento da superfície e estriá-la sobre a superfície seca de ágar tiossulfato citrato sacarose sais biliares (TCBS). Incubar as placas em posição invertida a 36 ± 1 °C por 24 horas.
Verificar o aparecimento de colônias arredondadas, opacas, de cor azul esverdeada, com 2 a 3 mm de diâmetro, típicas de Vibrio parahaemolyticus. Quando não houver colônias suspeitas, o resultado será negativo para o tubo de origem.
¶ Provas preliminares para identificação de Vibrio parahaemolyticus
De cada placa, selecionar de 2 a 3 colônias típicas e transferí-las simultaneamente para tubos contendo caldo peptonado sal 3% e ágar nutriente sal 3% inclinado. Incubar a (36 ± 1)°C por 18 a 24 horas.
¶ Coloração de Gram
A partir do cultivo mantido em ágar nutriente sal 3%, proceder à coloração de Gram de acordo com as instruções descritas na seção Procedimentos de Coloração.
O Vibrio parahaemolyticus se apresenta como bastonetes retos ou curvos Gram negativos. Em culturas antigas, pode se apresentar em forma de cocobacilos.
¶ Crescimento com 8% de sal e sem sal
A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, transferir, com auxílio de alça de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, uma alçada para um tubo contendo caldo peptonado sem sal e caldo peptonado sal 8%. Incubar os tubos a (36 ± 1)°C por 18 a 24 horas.
Após o período de incubação, verificar a presença de turvação indicativa da ocorrência de crescimento. O Vibrio parahaemolyticus não cresce no meio sem sal e cresce no meio com 8% de sal.
¶ Prova da oxidase
A partir do cultivo mantido em ágar nutriente sal 3%, usando palitos de madeira, de plástico descartáveis, pipetas Pasteur, ou alça de platina, realizar a prova de oxidase espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase ou sobre tiras de papel para teste de oxidase, comercialmente disponíveis.
Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Após este tempo, podem ocorrer reações falso-positivas. O aparecimento de cor azul (quando é usado o reativo N,N,N’,N’-tetrametil-p-fenileno-diamina) ou de cor vermelha intensa (quando o reativo usado é o oxalato de p-amino-dimetilanilina) é indicativo de reação positiva. O Vibrio parahaemolyticus é oxidase positiva.
Obs: Não utilizar alças de níquel-cromo ou alças de aço para realizar a prova de oxidase, pois traços de óxido de ferro na superfície flambada podem produzir reação falso-positiva.
¶ Caldo vermelho de fenol sacarose sal 3%
A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, inocular, com auxílio de alça de níquel-cromo, um tubo contendo caldo vermelho de fenol sacarose sal 3%. Cobrir o meio com 2 a 3 mL de óleo mineral ou parafina líquida, estéreis. Incubar a (36 ± 1)°C por 18 a 24 horas.
Após o período de incubação, observar a mudança de coloração do meio, de vermelho para amarelo, devido à fermentação da sacarose e produção de ácido. O Vibrio parahaemolyticus não altera a coloração do meio, pois não é capaz de fermentar a sacarose.
¶ Ágar ferro três açúcares sal 3% (TSI) ou Ágar Kligler ferro sal 3%
A partir do cultivo mantido no ágar nutriente sal 3% inclinado, com auxílio de agulha de platina ou níquel-cromo, inocular, mediante picada central em toda a profundidade do ágar e estriando a superfície inclinada, tubos com ágar TSI sal 3% ou ágar Kligler ferro sal 3%. Incubar a (36 ± 1)°C por 24 horas.
O Vibrio parahaemolyticus apresenta base ácida (amarela), sem gás, sem produção de e bisel alcalino (vermelho).
¶ Teste ONPG
A partir da cultura em TSI, inocular uma alçada espessa em tubo contendo 0,5 mL de caldo ONPG sal 3%. Incubar em banho-maria a (36 ± 1)°C, durante 2 horas. Examinar os tubos, verificando o aparecimento ou não de cor amarela, indicativa de reação positiva. Se o caldo permanecer incolor, a reação é negativa. O Vibrio parahaemolyticus é ONPG negativo.
¶ Provas adicionais para identificação de Vibrio parahaemolyticus
As colônias que apresentarem comportamento compatível com Vibrio parahaemolyticus nas provas preliminares deverão ser submetidas às provas adicionais.
¶ Teste do crescimento a 42 °C
A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxílio de alça de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, inocular um tubo contendo caldo peptonado sal 3%. Incubar a (42 ± 1)°C por 24 horas.
Após o período de incubação, observar a presença de turvação dos meios. O víbrio parahaemolyticus cresce à temperatura de 42°C.
¶ Ágar gelatina sal 3%
A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxílio de alça de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, inocular uma placa de Petri contendo ágar gelatina sal 3% (cada placa pode ser dividida em até seis setores e cada cultivo pode ser inoculado no centro de cada setor). Incubar as placas a (36 ± 1)°C por 18 a 24 horas.
Colocar as placas em refrigeração por alguns minutos antes e então realizar a leitura, o que facilita a visualização do halo. O aparecimento de um halo opaco ao redor do crescimento indica a presença da gelatinase. O Vibrio parahaemolyticus é gelatinase positiva.
¶ Teste da motilidade
A partir da cultura mantida no ágar nutriente sal 3% inclinado, com auxílio de agulha de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, através de picada central, inocular um tubo contendo ágar motilidade sal 3%. Incubar a (36 ± 1)°C por 24 horas.
Um crescimento bacteriano difuso ao redor da picada caracteriza motilidade positiva. O Vibrio parahaemolyticus apresenta motilidade positiva.
¶ Prova de Hugh-Leifson glicose (OF)
A partir do cultivo mantido em ágar nutriente sal 3%, inocular com auxílio de agulha de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, dois tubos contendo meio OF glicose (Hugh-Leifson) sal 3%. Cobrir um dos tubos com 2 a 3 mL de óleo mineral ou parafina líquida, estéril. Incubar a (36 ± 1)°C por 18 a 24 horas.
Após o período de incubação, verificar a viragem de cor dos meios de verde para amarelo e a presença de bolhas de gás nos meios. A cor amarela nos dois tubos significa fermentação da glicose. A presença de cor amarela somente no tubo sem óleo mineral significa utilização oxidativa da glicose. O Vibrio parahaemolyticus fermenta a glicose sem produção de gás, ou seja, os dois tubos devem apresentar coloração amarela.
¶ Descarboxilação da lisina
A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxílio de alça de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, inocular um tubo contendo Caldo vermelho de fenol lisina sal 3%. Inocular também um tubo contendo meio base (sem adição do aminoácido) que servirá de controle. Cobrir os tubos com 2 a 3 mL de óleo mineral ou parafina líquida, estéril. Incubar a (36 ± 1)°C por, no máximo, quatro dias, juntamente com um tubo de Caldo vermelho de fenol lisina sal 3% não inoculado, que servirá de controle negativo.
Examinar os tubos todos os dias. Durante o período de incubação, a cor do meio passa para amarela devido à fermentação da glicose, e, ocorrendo a descarboxilação da lisina, o meio retorna à cor púrpura devido à produção de aminas primárias e dióxido de carbono. O tubo controle, sem aminoácido, deve virar para amarelo e assim permanecer. O Vibrio parahaemolyticus descarboxila a lisina.
¶ Hidrólise da arginina
A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxílio de alça de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, inocular um tubo contendo caldo arginina sal 3%. Inocular também um tubo contendo o meio base (sem adição do aminoácido) que servirá de controle. Cobrir os tubos com 2 a 3 mL de óleo mineral ou parafina líquida, estéril. Incubar a (36 ± 1)°C por, no máximo, quatro dias, juntamente com um tubo de caldo arginina sal 3% não inoculado, que servirá de controle negativo.
Examinar os tubos todos os dias. Durante o período de incubação, a cor do meio passa para amarela devido à fermentação da glicose, ocorrendo hidrólise da arginina o meio retorna a cor púrpura devido à produção de aminas primárias e dióxido de carbono. O tubo controle, sem aminoácido, deve virar para amarelo e assim permanecer. O Vibrio parahaemolyticus não hidrolisa a arginina.
¶ Prova da fermentação do manitol e arabinose
A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxílio de alça de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, inocular um tubo contendo caldo vermelho de fenol manitol sal 3% e outro tubo contendo caldo vermelho de fenol arabinose sal 3%. Cobrir o meio com 2 a 3 mL de óleo mineral ou parafina líquida, estéril. Incubar a (36 ± 1)°C por 24 horas.
Após o período de incubação, observar a mudança de coloração dos meios de vermelho para amarelo, devido à fermentação dos açúcares e consequente produção de ácido. 99% das cepas de Vibrio parahaemolyticus fermentam o manitol. 50% das cepas de Vibrio parahaemolyticus fermentam a arabinose.
¶ Teste do halofilismo
A partir do cultivo mantido em caldo peptonado sal 3%, com auxílio de alça de níquel-cromo, platina ou descartável estéril, inocular tubos contendo caldo peptonado sal 6% e 10%. Incubar a (36 ± 1)°C por 24 horas.
Após o período de incubação, observar a presença de turvação nos meios. O Vibrio parahaemolyticus cresce a 6% de sal e não cresce, ou apresenta crescimento discreto, a 10% de sal.
¶ Sensibilidade do agente vibriostático O/129
Esta prova é utilizada como diferencial entre Vibrio parahaemolyticus e V. vulnificus.
Embeber um “swab” previamente esterilizado com a cultura suspeita mantida em caldo peptonado sal 3% e inocular uma placa contendo ágar Müeller-Hinton sal 3% ou ágar soja triptona sal 3%, espalhando bem o inóculo, de forma a obter um crescimento o mais homogêneo possível. Deixar as placas absorverem o inóculo. Colocar um disco do agente vibriostático O/129 com concentração de 10 μg e um disco de concentração de 150 μg. Incubar as placas a (36 ± 1)°C por 24 horas.
O Vibrio parahaemolyticus é resistente à concentração de 10 μg de agente vibriostático O/129 enquanto o V. vulnificus é sensível. Todos os vibrios são sensíveis à concentração de 150 μg do agente O/129.
¶ Expressão dos resultados
Serão consideradas como positivas para Vibrio parahaemolyticus as culturas que apresentarem os seguintes resultados nas provas adicionais de identificação:
- Motilidade positiva
- Hugh Leifson (OF) glicose fermentativo
- Descarboxilação da lisina positiva
- Hidrólise da arginina negativa
- Crescimento a 42°C positivo
- Fermentação do manitol positivo
- Fermentação da arabinose positivo
- Resistente no teste de Sensibilidade ao Agente Vibriostático O/129 a 10 μg
- Sensível no teste de Sensibilidade ao Agente Vibriostático O/129 a 150 μg
- Crescimento com formação de halo no teste Ágar gelatina sal 3%
- Halofilismo (6% sal) positivo
- Halofilismo (8% sal) positivo
- Halofilismo (10% sal) negativo ou crescimento discreto
A partir da combinação de tubos com resultado positivo em cada série, calcular o Número Mais Provável de acordo com a tabela da norma ISO específica, compatível com o número de séries, tubos e massas utilizados. Expressar o valor obtido em NMP/g.
¶ Bibliografia
Elliot, E. L.; Kaysner, C. A.; Jackson, L. e Cebule, T. A. V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus and Others víbrio spp. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponível em: https://www.fda.gov/food/foodscienceresearch/laboratorymethods/ucm2006949.htm.
MacFaddin, J. F. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. 3ed.
Lippincott Williams & Wilkins (Ed.), Philadelphia. 2000. p. 160-169.
¶ 4. Teste de Esterilidade Comercial para Alimentos de Baixa Acidez - pH > 4,6
¶ Princípio
Pré-incubação: baseia-se na incubação das amostras nas temperaturas de (36 ± 1)°C pelo período de 10 dias e a (55 ± 1)°C pelo período de 5 a 7 dias, objetivando a detecção de crescimento bacteriano com formação de gás, evidenciado pelo tufamento da embalagem e na verificação de possíveis microfugas.
Semeadura e incubação: baseia-se na utilização de meios líquidos não seletivos com capacidade de promover o crescimento de microrganismos por meio da incubação em aerobiose e anaerobiose, em temperaturas ideais para o desenvolvimento de microrganismos mesófilos e termófilos.
Coloração pelo método de Gram e de esporos: baseia-se na observação microscópica das características morfológicas e tintoriais dos microrganismos presentes e de seus esporos.
Prova da Catalase: baseia-se na verificação da capacidade do microrganismo em teste produzir a enzima catalase, que decompõe o peróxido de hidrogênio, liberando oxigênio, o que é evidenciado por meio da formação de borbulhas.
Prova da termofilia estrita: baseia-se na verificação da germinação e crescimento dos esporos nas temperaturas de (36 ± 1)°C e (55 ± 1)°C para certificação da exigência absoluta de elevada temperatura para seu desenvolvimento. A germinação dos esporos a (36 ± 1)°C indica a capacidade mesofílica do microrganismo. O crescimento a (36 ± 1)°C e a (55 ± 1)°C indica a capacidade termofílica facultativa do microrganismo. O crescimento somente a (55 ± 1)°C indica a capacidade termofílica estrita do microrganismo.
¶ Campo de aplicação
Verificação da eficácia do processo de esterilização em amostras de alimentos comercialmente estéreis de baixa acidez.
¶ Materiais e equipamentos
- Vidraria e equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos;
- Abridores metálicos estéreis;
- Pinças estéreis.
¶ Meios de cultura, reagentes e soluções
- Insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos;
- Caldo de carne cozida (CCC) ou Caldo Tarozzi;
- Caldo glicose triptona;
- Ágar glicose triptona;
- Ágar nutriente;
- Ágar nutriente com sulfato de manganês;
- Ágar para esporulação;
- Ágar cérebro-coração (ABHI);
- Corantes para a coloração de esporos;
- Corantes para a coloração de Gram;
- Peróxido de hidrogênio 3%;
- Vaspar ou vaselina ou óleo mineral ou parafina líquida.
¶ Preparo da amostra
Após seu recebimento no laboratório as amostras devem ser mantidas até o momento do início da análise de acordo com norma ISO específica.
No recebimento de amostras de conservas enlatadas, verificar a integridade das embalagens, observando se estão amassadas, levemente tufadas ou com microfugas aparentes. Quando forem observadas quaisquer dessas alterações, proceder conforme estabelecido na seção Amostras tufadas.
Amostras visualmente normais devem ser pré incubadas, após a realização dos procedimentos abaixo:
- Retirar cuidadosamente a cinta de identificação;
- Lavar a lata com água e detergente, usando esponja;
- Secar com flanela limpa e seca;
- Identificar a amostra com o número de protocolo do laboratório;
- Recolocar a cinta de identificação usando fita adesiva para prendê-la na amostra.
¶ Procedimento da análise
¶ Pré-incubação
Forrar a prateleira das estufas com papel filtro e incubar as amostras de forma que a recravação fique em contato com o papel filtro. Incubar em estufa a (36 ± 1)°C por 10 dias e a (55 ± 1)°C por um período de 5 a 7 dias.
Após o período de pré-incubação verificar se os recipientes não sofreram tufamento. Verificar se o papel filtro apresenta manchas que possam evidenciar a presença de microfugas ou vazamentos.
Amostras sem alteração: registrar como “sem alteração” quando não se observar qualquer alteração dos recipientes.
Amostras que sofreram alteração durante a pré-incubação: registrar como “com alteração” quando qualquer alteração for detectada. Ao final da pré-incubação, quando o papel filtro sobre o qual ficaram incubadas as latas estiver manchado, evidenciando a presença de microfugas, descrever a alteração.
Eventualmente, se houver demanda específica, submeter a respectiva amostra à análise de aeróbios e anaeróbios, mesófilos ou termófilos, de acordo com a temperatura da pré-incubação. Proceder conforme descrito na seção Amostras tufadas para a análise destas amostras.
¶ Procedimentos de controle
Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório.
¶ Amostras tufadas
As amostras que derem entrada no laboratório com evidências de tufamento e estiverem acompanhadas de ofício com solicitação de análise especial serão analisadas imediatamente, devendo ser preparadas conforme as instruções descritas abaixo:
- Fazer desinfecção da embalagem com algodão embebido em solução desinfetante e em seguida com etanol 70% ou etanol 70 ° GL;
- Deixar secar;
- Posicionar a lata com borda não codificada para cima e costura lateral voltada para o lado oposto ao analista;
- Colocar um chumaço de algodão embebido em solução desinfetante, previamente aprovada pelos testes do laboratório, no local onde será iniciada a abertura da embalagem. Esse procedimento tem o objetivo de proteger o ambiente e o analista contra uma possível contaminação proveniente do alimento em análise pela expulsão de gases e/ou líquidos presentes no recipiente no momento do rompimento da hermeticidade. Outros cuidados como o uso de luvas, máscara, toucas, etc. também deverão ser adotados.
- Usando um abridor de latas metálico, previamente esterilizado, abrir um pequeno orifício sob o chumaço de algodão;
- Deixar em repouso sem retirar a proteção de algodão sobre o orifício até que a pressão interna do produto esteja equilibrada com a externa;
- Com outro abridor estéril, abrir cuidadosamente a lata e transferir porções do conteúdo, tomadas do lado oposto ao local do orifício inicialmente feito, para os meios de cultivo indicados;
- Após a retirada das alíquotas estabelecidas pela metodologia específica, fechar cuidadosamente a lata e acondicioná-la em saco plástico autoclavável, fechando-o com fita adesiva. A amostra, assim embalada, deverá ser imediatamente descartada conforme norma específica do laboratório.
As amostras alteradas que chegarem desacompanhadas de ofício com solicitação específica não serão analisadas. Fazer constar no Certificado Oficial de Análise a informação do motivo da não aceitação.
Não flambar os recipientes tufados. Os mesmos deverão ser somente desinfetados com algodão embebido em solução desinfetante.
Manter registros das condições das amostras no momento da sua recepção no laboratório.
¶ Inoculação das amostras
Utilizando a amostra incubada a (36 ± 1)°C, retirar alíquotas de cerca de 1 a 2 gramas ou mililitros e semear em quatro tubos contendo caldo de carne cozida ou caldo Tarozzi, e também em quatro tubos contendo caldo glicose triptona.
Após a inoculação das amostras, acrescentar, assepticamente, sobre o caldo de carne cozida ou caldo Tarozzi uma camada de aproximadamente 2 cm de vaspar ou vaselina ou óleo mineral ou parafina líquida, estéril, previamente fundido.
¶ Incubação
Incubar dois tubos de cada meio nas temperaturas de (36 ± 1)°C e (55 ± 1)°C por 120 horas (5 dias).
¶ Leitura e interpretação
Verificar, nos tubos contendo caldo de carne cozida ou caldo Tarozzi, a formação de gás, a turvação do meio e possível alteração na aparência da carne do meio, sinais indicativos de crescimento bacteriano.
Os clostrídios sacarolíticos produzem ácido e gás com odor “ácido”, sem a digestão da carne cozida, mas com consequente avermelhamento da mesma.
Os clostrídios proteolíticos degradam a proteína em aminoácidos, com a precipitação da tirosina na forma de cristais brancos, produzindo um odor fétido de compostos sulfurados com consequente enegrecimento da carne cozida e turvação do caldo.
Verificar, nos tubos com caldo glicose triptona, se ocorreu turvação e/ou formação de película na superfície do caldo, alterações que indicam crescimento bacteriano. Considerar como negativo o teste para a esterilidade comercial quando não se observar nenhuma das alterações citadas acima e os controles corresponderem aos resultados esperados.
Dar sequência ao teste quando forem observadas quaisquer das alterações citadas acima e os controles corresponderem aos resultados esperados.
¶ Confirmação de tubos com crescimento positivo ou suspeito
Os tubos suspeitos de apresentarem crescimento devem ser repicados por estriamento em placas de ABHI, conforme segue:
- Quando o tubo suspeito for o de caldo glicose triptona incubado a (36 ± 1)°C (aeróbios mesófilos) repicar concomitantemente para duas placas com ABHI. Incubar uma destas placas a (55 ± 1)°C e a outra a (36 ± 1)°C por 24 a 48 horas.
- Quando o tubo suspeito for o de caldo glicose triptona incubado a (55 ± 1)°C (aeróbios termófilos) repicar para uma placa com ABHI. Incubar a (55 ± 1)°C por 24 a 48 horas.
- Quando o tubo suspeito for o de caldo de carne cozida (ou de caldo Tarozzi), incubado a (36 ± 1)°C (anaeróbio mesófilo) ou a (55 ± 1)°C (aeróbios termófilos), repicar para uma placa com ABHI. Incubar por 24 a 48 horas, na mesma temperatura de incubação usada para o tubo de origem ((36 ± 1)°C ou (55 ± 1)°C), em anaerobiose.
¶ Leitura
Após a incubação, verificar o crescimento de microrganismos nas placas. O não crescimento indicará resultado negativo para o teste de esterilidade comercial. Quando for verificado crescimento nas placas, repicar as culturas obtidas para tubos com ágar estoque inclinado e incubar nas mesmas condições das placas de origem. Após incubação, realizar os testes complementares.
¶ Testes complementares
¶ Coloração de Gram
A partir das colônias que crescerem nas placas, preparar esfregaço e corar pelo método de Gram, conforme instruções constantes n seção Procedimentos de coloração.
Quando for verificada a presença de bastonetes Gram positivos nos tubos incubados em anaerobiose, a realização da prova de catalase é necessária para a diferenciação entre Bacillus sp (catalase positiva) e Clostridium sp (catalase negativa). Registrar no resultado final a morfologia dos cultivos celulares isolados observada.
¶ Prova da catalase
Com auxílio de alça de platina, palito de madeira, bastão de vidro ou Pipeta de Pasteur estéril, transferir a cultura para uma lâmina de vidro contendo uma gota de peróxido de hidrogênio a 3%.
A não formação de borbulhas indica prova negativa para catalase. A formação de borbulhas indica prova positiva para catalase. No caso da presença de bastonetes Gram positivos, resultados de catalase negativos indicam a presença de Clostridium sp e resultados positivos indicam a presença de Bacillus sp.
Quando for detectada a presença de Clostridium sp, guardar as culturas para testes complementares, caso sejam necessários.
¶ Prova da termofilia estrita
Quando forem detectados bastonetes termófilos, realizar prova para confirmação de termofilia estrita do microrganismo isolado.
A partir dos tubos com caldo glicose triptona positivos incubados a (55 ± 1)°C, repicar maciçamente para tubos contendo ágar nutriente inclinado com sulfato de manganês (ou ágar para esporulação). Incubar a (55 ± 1)°C de 2 a 10 dias.
A partir do segundo dia, verificar a presença de esporos por meio da aplicação da técnica para coloração de esporos, conforme instruções constantes na seção Procedimentos de coloração.
Quando forem detectadas culturas esporuladas, preparar suspensão de esporos, lavando o crescimento obtido no tubo com ágar nutriente/sulfato de manganês com 1 mL de água destilada ou deionizada estéril.
Inativar as formas vegetativas por meio da aplicação de um choque térmico a 80 °C por 15 minutos na suspensão preparada de 1 mL.
Inocular 0,1 mL do lavado, após o choque térmico, em dois tubos contendo caldo glicose triptona. Incubar um tubo a (36 ± 1)°C e outro a (55 ± 1)°C por 2 a 4 dias.
Verificar o crescimento de microrganismos, evidenciado pela turvação do caldo. O crescimento bacteriano somente no tubo incubado a (55 ± 1)°C determina a termofilia estrita do microrganismo isolado. O crescimento bacteriano nos dois tubos determina a termofilia facultativa do microrganismo isolado.
Registrar no resultado final a característica mesofílica ou termofílica do microrganismo isolado.
¶ Confirmação de microrganismos “flat sour” (opcional)
A partir das culturas obtidas nas placas de ABHI, provenientes dos tubos positivos de caldo glicose triptona incubados a (55 ± 1)°C, repicar para a superfície seca de 2 placas com ágar glicose triptona. Incubar uma das placas a (36 ± 1)°C por 72 horas e a outra a (55 ± 1)°C por 48 horas em câmara úmida.
O crescimento de colônias amarelas, regulares, com diâmetro de aproximadamente 2 a 3 mm, rodeadas de zona de clarificação também amarela, nas placas incubadas a (55 ± 1)°C, com núcleo opaco e o não crescimento naquelas incubadas a (36 ± 1)°C, confirmará a presença de Bacillus stearothermophilus (renomeado – Geobacillus stearothermophilus), microrganismo responsável pela deterioração “flat sour”.
¶ Expressão dos resultados
¶ Pré-incubação
Expressar no campo referente à emissão do resultado para prova de pré-incubação, nas temperaturas requeridas, o resultado como “sem alteração” quando não se observar qualquer alteração ou anormalidade no recipiente e nas características físicas e/ou sensoriais da amostra, e como “com alteração” quando for observada qualquer alteração ou anormalidade no recipiente ou nas características físicas e/ou sensoriais da amostra. Nesse caso, descrever o tipo de alteração observado.
¶ Pesquisa de aeróbios e anaeróbios termófilos e mesófilos
Expressar nos campos referentes à emissão dos resultados para as pesquisas de aeróbio e anaeróbio mesófilo e termófilo, o resultado como “negativa”, quando não for observado qualquer desenvolvimento de microrganismos no teste aplicado e como “positiva” quando for observada a presença de microrganismos.
Sempre que possível, fazer constar do resultado final as observações feitas ao microscópio.
¶ Bibliografia
BRASIL. Ministério da Agricultura e do Abastecimento - Secretaria de Defesa Animal - Departamento Nacional de Defesa Animal - Coordenação Geral de Laboratório Animal - Métodos de Análise Microbiológica para Alimentos - Teste de Esterilidade Comercial. Brasília, D.F. 1991/1992 - 2ª Revisão, p. 111 - 113.
Deibel K. E.; Jantschke, M. Canned Foods - Tests for Commercial Sterility. In: In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p. 577-588.
Denny C. B; Parkinson, N. G. Canned Foods - Tests for cause of spoilage. In: In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.583-600.
DSMZ - Deutsche SammLung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. Bacterial Nomenclature Up-to-Daté-(Approved Lists, Validation Lists).Nov.2002.Braunschweig, Germany. Disponível em: http://www.dsmz.de/bactnom/bactname.htm
¶ 5. Pesquisa de Paenibacillus larvae subsp. Larvae
¶ Preparo da Amostra
O aquecimento da amostra a 45 ◦C visa diminuir a viscosidade, permitir a distribuição homogênea dos esporos e facilitar a manipulação. A diluição com solução salina tamponada, além de viabilizar a concentração dos esporos pela centrifugação que se segue, contribui para bloquear parcialmente a ação inibidora de crescimento bacteriano, exercida por substâncias presentes no mel.
¶ Centrifugação
Visa concentrar os esporos presentes na amostra por meio de centrifugação a 3.000 x g por 30 minutos (g = 0,0000118 x raio do rotor em cm x rpm2 ).
¶ Choque Térmico
Por meio do aquecimento, a 80 °C por 10 min, do sedimento da amostra obtido por centrifugação, obtém-se a eliminação das formas vegetativas de bactérias que podem interferir no crescimento de Paenibacillus larvae e dificultar a seleção de colônias.
¶ Isolamento e Seleção
Baseia-se na semeadura sobre a superfície seca de ágar Paenibacillus larvae (ABL), meio composto por ágar estoque, ágar soja triptona, ágar Cereus (PEMBA) - base, suplementado com emulsão de gema de ovo, ácido nalidíxico e ácido pipemídico. A emulsão de gema de ovo promove a multiplicação de P.larvae e permite a diferenciação de microrganismos pela reação da lecitinase. A presença de 0,1% de peptona, associada ao piruvato de sódio (presentes no PEMBA), evidencia a precipitação da lecitina da gema do ovo, provocada por espécies de Bacillus que possuem essa propriedade. O manitol, carboidrato presente no meio, não é fermentado pelo Paenibacillus larvae. O indicador de pH presente no meio é o azul de bromotimol. O ácido nalidíxico atua inibindo total ou parcialmente o crescimento de P. alvei, B. megaterium, P.larvae subsp. pulvifaciens, P. polymyxa e B. pumilus. O ácido pipemídico atua prevenindo o crescimento de B. circulans, B. subtilis, B. licheniformis, B. cereus, B. mycoides, P.larvae subsp. pulvifaciens e P. apiarius.
¶ Provas confirmativas
Baseiam-se na observação das características morfológicas e tintoriais, na observação da capacidade de decompor a caseína, na incapacidade de produzir catalase, no crescimento escasso em ágar nutriente isento de extrato de levedura e no crescimento típico no ágar leite com tiamina (ALT).
¶ Bibliografia
BRASIL. Portaria no 248, de 30 dezembro de 1998. Aprova as metodologias para pesquisa de Bacillus larvae em mel. Diário Oficial da União: seção 1, Brasília, DF, n.2, p. 13-15, 5 jan. 1999.
¶ 6. Procedimentos de Coloração
¶ Objetivo
As técnicas de coloração usadas em microbiologia se destinam à observação de estruturas morfológicas como esporos, flagelos e forma das células, diferenciando microrganismos.
¶ Preparação do esfregaço
Para sucesso na observação, é necessário que o esfregaço seja bem feito, apresentando-se em monocamadas, suficientemente concentrado de forma a facilitar a visualização.
A secagem dos esfregaços deve ocorrer ao ar. Depois de secos, os esfregaços podem ser fixados com calor, passando rapidamente 2 a 3 vezes através da chama de bico de Bunsen.
¶ Coloração de Gram
A coloração de Gram utiliza características diferenciais das células bacterianas. Estas características diferenciais se referem à estrutura da parede celular dos microrganismos. Os microrganismos que contêm altos teores de ácido teicóico em sua parede celular se coram, pela coloração de Gram, em azul intenso e são chamados de “Gram positivos”. Os microrganismos que contém lipopolissacarídeos na membrana externa somente se coram com o contracorante, mostrando-se da cor do mesmo (vermelho), e são denominados “Gram negativos”.
¶ Reagentes
- Solução cristal violeta;
- Solução de lugol (iodo iodeto de potássio);
- Solução descorante de etanol-acetona:
Adicionar 10 mL de acetona a 100 mL de etanol 95% . Misturar.
- Solução contracorante de Safrina O.
¶ Procedimento de coloração de Gram modificado por Hucker
Originalmente, a coloração descrita por Christian Gram usava violeta de genciana, que é uma mistura de cristal violeta com outros componentes. Hucker modificou o método substituindo a violeta genciana pelo cristal violeta puro, que é muito estável e permite uma melhor diferenciação dos microrganismos.
- Cobrir o esfregaço com cristal violeta por 1 minuto;
- Retirar o excesso de cristal violeta;
- Cobrir com lugol por 1 minuto;
- Escorrer e lavar suavemente em água;
- Descorar com álcool-acetona ou etanol 95% por 1 a 5 segundos (até que a maior parte do cristal violeta seja removido);
- Lavar delicadamente em água;
- Adicionar solução de contracorante - safranina O - por 30 segundos;
- Lavar delicadamente em água;
- Deixar secar no ambiente.
¶ Coloração de gram para anaeróbios
Esta coloração se baseia na substituição da safranina por arbol fucsina, que é mais efetiva para a coloração de alguns anaeróbios Gram negativos e Legionella. O aumento do tempo de exposição ao contracorante (carbol fucsina) permite uma maior penetração do mesmo dentro destas células, o que as tornará mais facilmente visíveis. Para anaeróbios o descorante usado é o etanol.
¶ Procedimento de coloração
- Corar o esfregaço por 30 segundos com cristal violeta;
- Retirar o excesso de cristal violeta;
- Cobrir com lugol por 30 segundos;
- Escorrer e lavar com água corrente (fluxo suave);
- Descorar com etanol 95% por 30 segundos;
- Lavar com água corrente (fluxo suave);
- Adicionar solução de contracorante carbol fucsina por 1 minuto ou mais (solução aquosa de fucsina básica 0,8% (m/v));
- Deixar secar em ambiente.
¶ Técnicas de coloração para flagelos
Os flagelos são organelas das bactérias responsáveis pela motilidade, os quais possuem, em sua constituição, moléculas proteicas denominadas “flagelinas”. O flagelo é formado por milhares de monômeros polimerizados de flagelina ordenados de maneira a formar um único flagelo.
Algumas dificuldades podem ser encontradas quando se deseja demonstrar este tipo de estrutura em uma bactéria:
- A produção de flagelos nas bactérias não é contínua e é dependente de vários fatores como temperatura, substrato, estágio do crescimento, etc.;
- Os flagelos podem ser acidentalmente removidos da bactéria pela pipetagem ou homogeneização muito vigorosa;
- O flagelo se despolimeriza facilmente, isto é, se dissocia em monômeros de flagelina com frequência (quando a temperatura alcança mais de 60 °C, quando o pH se torna muito ácido (pH 4,0) e quando a célula está em presença de álcalis, de ureia e de solventes orgânicos);
- É necessária a aplicação de técnicas para aumentar o diâmetro dos flagelos, de forma a torná-los visíveis pelas técnicas microscópicas usualmente adotadas em laboratórios microbiológicos. O ácido tânico contido no corante se ligará ao flagelo, tornando-o mais grosso. A demonstração do flagelo ocorrerá devido à ligação do corante ao ácido tânico.
¶ Reagentes
- Solução A:
Misturar 0.5 g de Fucsina certificada para coloração de flagelo a 50 mL de etanol 95%. Deixar em repouso de um dia para o outro para dissolução.
- Solução B
Adicionar a 100 mL de água destilada, 0.75 g de cloreto de sódio e 1,5 g de ácido tânico.
- Solução corante
Misturar vigorosamente as soluções A e B. A mistura de corantes pode ser usada até 2 meses após o preparo, se mantida sob refrigeração. Poderá se formar um precipitado. O precipitado não deve ser homogeneizado com o restante da solução durante procedimento de coloração.
¶ Procedimento de coloração
- Preparar cultura da bactéria em estudo sobre a superfície de ágar infusão de cérebro ou em ágar soja triptona (com ou sem sangue), incubando em temperatura e tempo adequados;
- Transferir delicadamente uma alçada do crescimento para tubo contendo cerca de 3 mL de água destilada. Inverter o tubo uma vez para homogeneizar a suspensão. Colocar uma gota desta suspensão sobre uma lâmina e deixar secar ao ar;
- Cobrir a lâmina com o corante e deixar por 5 minutos, até que um brilho metálico esverdeado cubra metade da área. Não deixar o corante secar sobre a lâmina;
- Retirar o corante enxaguando com água;
- Secar;
- Observar ao microscópio com objetiva de imersão.
¶ Técnica de coloração para esporos (Wirtz-Conklin)
A parede dos esporos constitui uma barreira eficaz contra a entrada e a saída de materiais do esporo. O tempo prolongado de exposição ao corante verde malaquita, associado ao aquecimento, permite o rompimento desta barreira obtendo-se, então, o esporo corado em verde intenso. Como contracorante é utilizada a safranina, que cora outras estruturas em rosa, facilitando a diferenciação dos esporos.
¶ Reagentes
- Solução de Verde malaquita 5%;
- Solução de trabalho de Safranina O.
¶ Procedimento de coloração
- Preparar esfregaço e fixar pelo calor;
- Cobrir o esfregaço com o corante verde malaquita 5%;
- Aquecer água em um béquer até começar a sair vapor. Colocar a lâmina sobre este béquer, mantendo o corante aquecido por 5 minutos. Alternativamente, cobrir a lâmina com verde malaquita e aproximar o máximo possível de uma chama de bico de Bünsen e deixar até que desprenda vapor. Afastar do fogo e após 1 a 2 minutos repetir a operação por 3 a 4 vezes;
- Lavar suavemente com água. Evitar o choque térmico que poderá quebrar a lâmina;
- Contracorar com solução de safranina O por 30 segundos;
- Lavar e secar;
- Observar ao microscópio com objetiva de imersão.
¶ Coloração para corpúsculos de inclusão cristalina
A detecção de corpúsculos de inclusão cristalina é uma das provas usadas para caracterizar algumas variedades de Bacillus thuringiensis, sendo utilizada como prova diferencial de Bacillus cereus. Os corpúsculos de inclusão cristalina de algumas variedades de Bacillus thuringiensis são cristais tetragonais de toxina, abundantes em culturas velhas (3-4 dias), que somente são liberados após a lise do esporângio.
Dois métodos estão descritos para esta finalidade: coloração a quente, com solução de fucsina básica 0,5%, e coloração a frio, com solução corante à base de azul de Coomasie.
Alternativamente pode ser utilizada a coloração de Wirst-Konklin (verde malaquita) para corar os corpúsculos de inclusão cristalina. Os corpúsculos de inclusão cristalina do Bacillus thuringiensis se apresentam como estruturas tetragonais de cor rosa, enquanto os esporos se coram em verde.
¶ Reagentes
- Ágar nutriente;
- Álcool metílico;
- Solução corante de Azul de Coomasie;
- Solução de fucsina básica 0,5%.
¶ Coloração com fucsina básica
- Repicar a cultura em ágar nutriente inclinado;
- Incubar a (30 ± 1)°C por 24 horas e posteriormente em ambiente por 2 a 3 dias;
- Preparar esfregaço em lâmina de vidro limpa;
- Secar ao ar e fixar rapidamente passando sobre uma chama de bico de Bunsen;
- Mergulhar em álcool metílico, deixando em contato por 30 segundos. Retirar e deixar secar ao ar.
- Corar com solução de fucsina básica 0,5% a quente, aproximar o máximo possível de uma chama de bico de Bunsen e deixar até que desprenda vapor. Afastar do fogo e após 1 a 2 minutos repetir a operação;
- Esperar cerca de 30 segundos para que a lâmina esfrie e
- Observar ao microscópio com objetiva de imersão.
Os corpúsculos de inclusão cristalina do Bacillus thuringiensis se apresentam como pequenos discos de bordas convexas (em forma de grão de lentilha) de cor rosa intensa.
¶ Coloração com azul de Coomasie
- Repicar a cultura em ágar nutriente inclinado;
- Incubar a (30 ± 1)°C por 24 horas e, posteriormente, em ambiente por 3 a 4 dias;
- Preparar esfregaço em lâmina de vidro limpa;
- Secar ao ar e fixar rapidamente passando sobre uma chama de bico de Bunsen;
- Cobrir o esfregaço com a solução corante de Azul de Coomasie por 3 minutos;
- Escorrer e lavar suavemente com água corrente;
- Secar;
- Observar ao microscópio com objetiva de imersão.
Os corpúsculos de inclusão cristalina do Bacillus thuringiensis se apresentam como estruturas tetragonais de cor azul intensa.
¶ Coloração de Gram – carbol-fucsina modificada por Hucker para campylobacter
¶ Reagentes
- Carbol-fucsina 0,3%;
- Etanol 95%;
- Lugol;
- Solução Corante Cristal violeta-oxalato de amônio para coloração de Campylobacter.
¶ Procedimento de coloração
- Preparar esfregaço dos cultivos suspeitos;
- Deixar secar ao ar e fixar delicadamente passando sobre uma chama de bico de Bunsen;
- Corar pelo método de Gram modificado por Hucker;
- Corar por 1 minuto com cristal violeta oxalato de amônio;
- Lavar com água;
- Cobrir com lugol por 1 minuto;
- Lavar com água;
- Descorar com etanol 95% até que saia todo o corante;
- Lavar com água;
- Contracorar com carbol fucsina por 10 a 20 segundos;
- Lavar com água;
- Secar e examinar em microscópio de campo claro com objetiva de imersão.
Todos os cultivos de Campylobacter se apresentam como bastonetes Gram negativos, curvos ou espiralados, com arranjo típico em forma de asa de gaivota.
¶ Bibliografia
Acuff, G. R. Media, Reagents, and Stains. In: Compendium of Method for the Microbiological Examination of Foods, American Public Health Association. 3. ed. Washington DC. Carl Vanderzant & Don F. Splittsoesser, 1992, p. 1093-1208.
BRASIL. Ministério da Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrária. Secretaria de Defesa Agropecuária. Departamento de Defesa Animal. Manual de métodos microbiológicos para alimentos. Coordenação Geral de Laboratório Animal. 1991/1992 2ª revisão. 136p.
Bryce, J. R.; Poelma, P. L. Microscopic Examination of Foods and Care and Use of the Microscope. In: Bacteriological Analytical Manual. 8.ed. Food and Drug Administration. AOAC International, Gaithersburg, USA. 1995. p. 2,01-2,06.
Clarridge, J. E.; Mullins, J. M. Microscopy and Staining. In: Clinical and Pathogenic Microbiology, Howard, B. J. et all. 2nd Ed. Mosby. St. Louis, 1994, p. 101-115.
Harmon, S. M.; Goepfert, J. M.; Bennett, R. W. Bacillus cereus. In: Compendium of Method for the Microbiological Examination of Foods, American Public Health Association. 3ª. ed. Washington DC. Carl Vanderzant & Don F.Splittsoesser, 1992, p. 593-604.
Hunt, J. M.; Abeyta, C. Campylobacter. In: Bacteriological Analytical manual. 8 ed.Food and Drug Administration. AOAC International, Gaithersburg, USA. 1995. p. 7,01 - 7.27.
Shimanuki, H.; Knox, D. A.; Furgala, B.; Caron, D. M.; Williams, J. L. Diseases and Pests of Honey Bees. In: The Hive and the Honey Bee. J. M. Graham (Ed). Dadant & Sons . Hamilton, Illinois. 1992. P.1083-1150.
¶ 7. Meios de Cultura, Reagentes e Soluções
Como medida de segurança, as substâncias componentes dos meios de cultura, das soluções e dos reagentes incluídas neste Manual estão sinalizados com uma letra, indicando o grupo de risco ao qual pertencem, sendo:
N = nocivo;
I = irritante;
T = tóxico;
H = hidropoluente;
P = perigoso para o meio ambiente;
C = corrosivo;
O = oxidante;
F = inflamável;
E = explosivo;
M = mutagênico;
Co = comburente.
Recomenda-se que, antes da manipulação e descarte das referidas substâncias, sejam consultadas fichas próprias ou manuais de segurança, visando o reconhecimento dos principais riscos inerentes e das medidas indispensáveis para prevenir ou evitar à ocorrência de acidentes e minimizar os danos à saúde do usuário e ao meio ambiente.
Meios de cultura desidratados fornecidos por diferentes fabricantes podem apresentar pequenas diferenças em suas composições. Observar atentamente a quantidade necessária de meio desidratado, em gramas por litro de meio a ser preparado, o modo de preparo, o tempo e a temperatura de esterilização em cada caso.
Ao adquirir meios de cultura, observar atentamente a formulação, comparando-a com aquela indicada neste manual. Às vezes, as diferentes marcas utilizam diferentes termos para uma mesma substância. Por exemplo, os termos triptona e tripticase referem-se à peptona de caseína obtida por digestão tríptica ou pancreática. Assim, os produtos ágar tripticase soja, ágar soja triptona, Caso ágar (antigo Casoy) referem-se a um produto que contem peptona de caseína (obtida por digestão tríptica ou pancreática) e peptona de farinha de soja.
As soluções preparadas por meio da dissolução do reativo em álcool etílico, seguida ou não da adição de água destilada/deionizada, neste manual serão denominadas como “solução alcóolica”. Ex.: α-naftol solução alcóolica 5%.
As soluções preparadas por meio da dissolução do reativo em água destilada/deionizada, neste manual serão denominadas como “solução aquosa”. Ex.: Novobiocina solução aquosa 4%.
As soluções preparadas por meio da dissolução do reativo em meio alcalino ou ácido, neste manual serão acompanhadas da indicação do diluente usado para sua preparação. Ex.: Ácido nalidixico solução 2% em NaOH 0.1 mol L−1, α-naftilamina solução 0,5% em ácido acético 5 mol L−1.
Onde houver a indicação “Esterilizar por Filtração” utilizar filtro com membrana de 0.22 μm previamente preparado e esterilizado.
¶ 7.1 Meios de cultura
¶ Ágar cérebro-coração (ABHI)
Pesar o ágar cérebro-coração (ABHI) de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporção indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado e adicionar o volume de água destilada/ deionizada correspondente. Aquecer até completa dissolução. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especifica do laboratório. Distribuir volumes de acordo com a necessidade e tampar. Identificar e datar. Autoclavar a (121 ± 1)°C por 15 minutos. Armazenar adequadamente.
A composição básica do ágar cérebro-coração deverá ser a seguinte, por litro de meio:
- Infusão de cérebro de carneiro - 12,5 g;
- Infusão de coração - 5,0 g;
- Proteose-peptona - 10,0 g;
- Cloreto de sódio - 5,0 g;
- D-glicose - 2,0 g;
- Ágar - 15,0 g;
- pH 7,4 ± 0,2.
¶ Ágar cereus (PEMBA)
 |
(H) - Hidropoluente |
Pesar o meio desidratado de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporção indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado e adicionar o volume de água destilada/ deionizada correspondente. Deixar em repouso por 15 minutos. Aquecer até completa dissolução. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especifica do laboratório. Distribuir volumes de 90 mL em frascos. Autoclavar a (121 ± 1)°C por 15 minutos.
A composição básica do ágar cereus (PEMBA) base deverá ser a seguinte, por litro de meio:
- Peptona - 1.0 g;
- Manitol - 10,0 g;
- Cloreto de sódio - 2,0 g;
- Sulfato de magnésio - 0.1 g;
- Fosfato de sódio dibásico - 2.5 g;
- Fosfato de potássio monobásico - 0.25 g;
- Azul de bromotimol - 0.12 g;
- Piruvato de sódio - 10,0 g;
- Ágar - 14,0 g;
- pH 7,2 ± 0,2.
No momento da utilização, adicionar a 90 mL de ágar base fundido e resfriado a 49-50°C: 10 mL de emulsão de gema de ovo a 50% e 1 mL de sulfato de polimixina B(H) a 0,1% esterilizada por filtração. Homogeneizar, tomando o cuidado para não formar espuma, e distribuir cerca de 15 mL em placas estéreis. Deixar solidificar em superfície plana. Identificar e datar. Manter as placas sob refrigeração, protegidas de modo a evitar desidratação.
Antes do uso, secar as placas a 45-50°C por cerca de 15 minutos, abertas e invertidas, apoiando a base com a superfície do ágar invertido sobre a borda da tampa da placa ou em fluxo laminar expondo a superfície pelo tempo necessário para a completa secagem.
¶ Ágar com extrato de levedura
Pesar, separadamente, os componentes do ágar com extrato de levedura conforme a formulação abaixo de acordo com o volume de meio a ser preparado. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de água destilada/ deionizada correspondente. Deixar em repouso por 15 minutos. Aquecer até completa dissolução. Verificar necessidade de ajuste de pH, conforme norma especifica do laboratório. Distribuir volumes de acordo com a necessidade, tampar e identificar adequadamente. Autoclavar a (121 ± 1)°C por 15 minutos.
A composição básica do ágar com extrato de levedura deverá ser a seguinte, por litro de meio:
Ágar - 20,0 g;
Extrato de levedura - 10,0 g;
pH 7,4 ± 0,2.
¶ Ágar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA)
|
|
(N*) - nocivo por ingestão, por contato com os olhos e pele (N) - nocivo por ingestão (I) - pode causar lesões oculares graves (H) - hidropoluente (P) - a longo prazo, pode causar efeitos negativos no meio ambiente aquático |
Pesar o ágar cristal violeta vermelho neutro bile de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporção indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado e adicionar o volume de água destilada/ deionizada correspondente. Deixar repousar por 15 minutos. Aquecer até completa dissolução. Normalmente não e necessário esterilizar este meio, porém, se for preciso, este meio pode ser autoclavado a (121 ± 1)°C por 5 minutos.
A composição básica de ágar cristal violeta vermelho neutro bile deverá ser a seguinte, por litro de meio:
- Peptona de carne - 7,0 g;
- Extrato de levedura - 3,0 g;
- Lactose - 10,0 g;
- Cloreto de sódio - 5,0 g;
- Sais biliares nº 3 - 1,5 g;
- Vermelho neutro (N*) - 0,03 g;
- Cristal violeta (N/I/H/P) - 0,002 g;
- Ágar - 15,0 g
- pH 7,4 ± 0,2.
¶ Ágar estoque
Pesar, separadamente, os ingredientes de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporção indicada em sua formulação. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de água destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por 15 minutos. Aquecer até completa dissolução. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especifica do laboratório. Distribuir em tubos volumes que permitam a formação de um bisel longo. Identificar e datar. Autoclavar a (121 ± 1)°C por 15 minutos. Após autoclavação, deixar os tubos solidificarem em posição inclinada.
Quando o meio for destinado à estocagem de culturas referenciais, distribuir em tubos pequenos com tampa de rosca ou em frascos tipo penicilina, deixando solidificar em posição vertical. Armazenar adequadamente.
A composição básica do ágar estoque deverá ser a seguinte, por litro de meio:
- Peptona bacteriológica - 13,8 g;
- Extrato de levedura - 6,0 g;
- Extrato de carne - 12.2 g;
- Cloreto de sódio - 10,0 g;
- Fosfato de sódio dibásico - 2,0 g;
- Ágar - 15,0 g;
- pH 7,4 ± 0,2.
¶ Ágar ferro três açúcares (TSI)
Pesar o ágar TSI de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporção indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de água destilada/ deionizada correspondente. Deixar repousar por cerca de 15 minutos. Aquecer até completa dissolução. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especifica do laboratório. Distribuir volume compatível com o tubo disponível, capaz de formar uma base de ± 3,0 cm de altura e, sobre ela, um bisel de 2 a 3 cm quando inclinado. Identificar e datar. Autoclavar a 121 ± 1 °C por 15 minutos. Armazenar adequadamente.
A composição básica do ágar TSI deverá ser a seguinte, por litro de meio:
- Extrato de carne - 3,0 g;
- Extrato de levedura - 3,0 g;
- Peptona de caseína - 15,0 g;
- Peptona de carne - 5,0 g;
- Lactose - 10,0 g;
- Sacarose - 10,0 g;
- D-Glicose - 1,0 g;
- Citrato de amônio e ferro - 0,5 g;
- Cloreto de sódio - 5,0 g;
- Tiossulfato de sódio - 0,3 g;
- Vermelho de fenol - 0,024 g;
- Ágar - 12,0 g;
- pH 7,4 ± 0,2.
¶ Ágar ferro três açúcares (TSI) sal 3%
Proceder conforme o indicado pelo fabricante para o preparo do Ágar TSI, acrescentando 25 g de cloreto de sódio a cada litro de meio preparado.
A composição básica do ágar gelatina deverá ser a seguinte, por litro de meio:
- Peptona de carne - 5,0 g;
- Extrato de carne - 3,0 g;
- Gelatina - 120,0 g;
- pH 6,9 ± 0,2.
¶ Ágar leite com tiamina (ALT)
Dissolver o ágar com extrato de levedura, preparado conforme o item anterior, e deixar em banho-maria até atingir entre 45°C e 50 °C. Em um Erlenmeyer estéril, com capacidade mínima de 500 mL, misturar a cada 300 mL de ágar com extrato de levedura, 100 mL de leite UHT desnatado e 6 mL de solução de tiamina 0,1% esterilizada por filtração. Após homogeneização, distribuir cerca de 20 mL assepticamente em placas estéreis deixando solidificar em superfície plana.
A composição básica do ágar leite com tiamina (ALT) deverá ser a seguinte, por litro de meio:
- Ágar com extrato de levedura - 300 mL;
- Leite UHT desnatado - 100 mL;
- Tiamina cloridrato sol. a 0,1% - 6 mL.
¶ Ágar motilidade sal 3%
Pesar, separadamente, os ingredientes de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporção indicada em sua formulação. Transferir para recipiente adequado e adicionar o volume de água destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por 15 minutos. Aquecer até completa dissolução. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especifica do laboratório. Distribuir em tubos. Identificar e datar. Autoclavar a 121 ± 1 °C por 15 minutos. Deixar solidificar o meio em posição vertical.
A composição básica de ágar motilidade sal 3% deverá ser a seguinte, por litro de meio:
- Peptona de carne - 8,6 g;
- Cloreto de sódio - 30,0 g;
- Ágar - 3,0 g;
- pH 7,0 ± 0,2.
¶ Ágar Müller-Hinton sal 3%
Pesar o ágar Müller-Hinton de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporção indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de água destilada/deionizada correspondente. Deixar repousar por 15 minutos. Aquecer, sob agitação, até completa dissolução. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especifica do laboratório. Distribuir volumes de 100 mL em frascos apropriados. Autoclavar a (121 ± 1)°C por 15 minutos. A composição básica do ágar Müller-Hinton sal 3% deverá ser a seguinte, por litro de meio:
- Infusão de carne bovina - 300,0 g;
- Peptona de caseína acida - 17,5 g;
- Cloreto de sódio - 30,0 g;
- Amido - 1,5 g;
- Ágar - 17,0 g;
- pH 7,3 ± 0,2.
¶ Ágar nutriente
Pesar o ágar nutriente de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporção indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de água destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por 15 minutos. Aquecer até completa dissolução do ágar. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especifica do laboratório. Distribuir alíquotas de 10 mL em tubos apropriados. Autoclavar a (121 ± 1)°C por 15 minutos. Após autoclavagem, deixar solidificar em posição inclinada, de forma a obter um bisel longo. Identificar, datar e armazenar adequadamente.
A composição básica do ágar nutriente deverá ser a seguinte, por litro de meio:
- Peptona - 5,0 g;
- Extrato de carne - 1,0 g;
- Extrato de levedura - 2,0 g;
- Cloreto de sódio - 5,0 g;
- Ágar - 15,0 g;
- pH 7,4 ± 0,2.
¶ Ágar nutriente com sulfato de manganês
Preparar o ágar nutriente e adicionar 300 mg de sulfato de manganês a cada litro de meio. Fundir o meio e deixar resfriar em banho-maria até 45-50 °C. Distribuir cerca de 10 mL em tubos. Deixar solidificar de forma inclinada, de maneira a obter um bisel maior ou igual a 4 cm. Identificar, datar e armazenar adequadamente.
¶ Ágar nutriente isento de extrato de levedura
Pesar o ágar nutriente de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporção indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de água destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por 15 minutos. Aquecer até completa dissolução do ágar. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especifica do laboratório. Distribuir alíquotas de 10 mL em tubos apropriados. Autoclavar a (121 ± 1)°C por 15 minutos. Após autoclavagem, deixar solidificar em posição inclinada, de forma a obter um bisel longo. Identificar, datar e armazenar adequadamente.
A composição básica do ágar nutriente isento de extrato de levedura deverá ser a seguinte, por litro de meio:
- Peptona de carne - 5,0 g;
- Extrato de carne - 1,0 g;
- Cloreto de sódio - 5,0 g;
- Ágar - 15,0 g;
- pH 7,4 ± 0,2.
¶ Ágar nutriente sal 3%
Preparar conforme descrito para o ágar nutriente e adicionar 25 g de cloreto de sódio, por litro de meio. Fundir o meio e deixar resfriar em banho-maria até 45-50 °C. Distribuir em placas ou tubos, conforme a necessidade. Identificar, datar e armazenar adequadamente.
¶ Ágar para esporulação
Pesar o ágar para esporulação de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporção indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de água destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por cerca de 15 minutos. Aquecer até completa dissolução. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especifica do laboratório. Distribuir volumes de acordo com a necessidade. Identificar e datar. Esterilizar a (121 ± 1)°C por 20 minutos. Armazenar adequadamente.
A composição básica do ágar para esporulação deverá ser a seguinte, por litro de meio:
- Polipeptona - 15,0 g;
- Extrato de levedura - 3,0 g;
- Amido solúvel - 3,0 g;
- Sulfato de manganês - 0,1 g;
- Tioglicolato de sódio - 1,0 g;
- Fosfato de sódio dibásico - 11,0 g;
- Ágar - 15,0 g;
- pH 7,8 ± 0,1.
¶ Ágar soja triptona (TSA)
Pesar o meio desidratado de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporção indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado e adicionar o volume de água destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por 15 minutos. Aquecer até completa dissolução. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especifica do laboratório. Distribuir volumes de 100 mL em frascos adequados. Autoclavar a (121 ± 1)°C por 15 minutos.
A composição básica do ágar soja triptona deverá ser a seguinte, por litro de meio:
- Triptona (peptona de caseína-digestão tríptica ou pancreática) - 15,0 g;
- Peptona de farinha de soja - 5,0 g;
- Cloreto de sódio - 5,0 g;
- Ágar - 15,0 g;
- pH 7,3 ± 0,2.
¶ Ágar soja triptona (TSA) sal 3%
Preparar o ágar soja triptona e adicionar 25 g de cloreto de sódio para cada litro de meio.
¶ Ágar tiossulfato-citrato-sacarose-sais biliares (TCBS)
Pesar o ágar tiossulfato-citrato-sais biliares-sacarose (TCBS) de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporção indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de água destilada/deionizada correspondente. Deixar em repouso por cerca de 15 minutos. Aquecer até completa dissolução. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especifica do laboratório. Não autoclavar. Distribuir, assepticamente, volumes de 15 mL em placas de Petri previamente esterilizadas. Antes do uso, secar a superfície do meio, colocando as placas semiabertas e invertidas em estufa a 45-50 °C por cerca de 15 minutos.
A composição básica de ágar tiossulfato-citrato-sais biliaressacarose deverá ser a seguinte, por litro de meio:
- Extrato de levedura - 5,0 g;
- Peptona de carne - 5,0 g;
- Peptona de caseína - 5,0 g;
- Tiossulfato de sódio - 10,0 g;
- Citrato de sódio - 10,0 g;
- Bile - 5,0 g;
- Sacarose - 20,0 g;
- Colato de sódio - 3,0 g;
- Cloreto de sódio - 10,0 g;
- Citrato férrico - 1,0 g;
- Azul de bromotimol - 0,04 g;
- Azul de timol - 0,04 g;
- Ágar - 15,0 g;
- pH 8,6 ± 0,2.
¶ Caldo cérebro-coração tiamina (BHI-T)
Pesar o meio caldo cérebro-coração (BHI), de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporção indicada pelo fabricante. Antes do uso, adicionar, em cada tubo com 10 mL, 0,2 mL de solução aquosa de tiamina a 0,01%, esterilizada por filtração.
¶ Caldo de carne cozida (CCC)
Em cada tubo selecionado para uso, distribuir 10 mL de água destilada/deionizada e 1 g do granulado (ou conforme a indicação do fabricante). Identificar e datar. Autoclavar a (121 ± 1)°C por 15 minutos. Armazenar adequadamente.
A composição básica do caldo de carne cozida deverá ser a seguinte por litro de meio:
- Músculo cardíaco de boi - 454,0 g;
- Proteose peptona - 20,0 g;
- D-Glicose - 2,0 g;
- Cloreto de sódio - 5,0 g;
- pH 7,4 ± 0,1.
¶ Caldo EC
Pesar o caldo EC de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporção indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de água destilada/deionizada correspondente. Agitar até completa dissolução. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma específica do laboratório. Distribuir volumes de 10 mL em tubos de ensaio previamente preparados com tubos de Durham invertidos. Identificar e datar. Autoclavar a (121 ± 1)°C por 15 minutos.
A composição básica de caldo EC deverá ser a seguinte, por litro de meio:
- Peptona - 20,0 g;
- Lactose - 5,0 g;
- Bile bovina - 1,5 g;
- Cloreto de sódio - 5,0 g;
- Fosfato de potássio dibásico - 4,0 g;
- Fosfato de potássio monobásico - 1,5 g;
- pH 6,9 ± 0,2.
¶ Caldo experimental para anaeróbios segundo R. F. Corseuil (caldo Rogert)
Pesar separadamente os seguintes ingredientes:
- Peptona - 20,0 g;
- Extrato de levedura - 5,0 g;
- Extrato de carne - 3,0 g;
- Glicose - 12,5 g;
- Cloreto de sódio - 5,0 g;
- L-cisteína - 20,0 g;
Transferir para recipiente adequado, adicionando 500 mL de Caldo de fígado. Adicionar 500 mL de água destilada/deionizada. Agitar até completa dissolução. Verificar a necessidade de ajuste do pH para 7,6 ± 0,2, conforme norma especifica do laboratório. Autoclavar a (121 ± 1)°C por 20 minutos.
Obs. Para preparar o caldo de figado, ferver durante uma hora o fígado bovino moído na proporção de 500 g para cada litro de água. Filtrar em papel filtro, fracionar em alíquotas de 500 mL e congelar até a sua utilização. Pode-se substituir o extrato de carne e a água destilada por caldo de carne, previamente preparado da mesma forma que o caldo de fígado, utilizando-se músculo bovino.
¶ Caldo glicose-sal 3%-teepol (GSTB)
Pesar o meio caldo glicose sal 3%-teepol, de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporção indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de água destilada/deionizada correspondente. Homogeneizar até completa dissolução. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especifica do laboratório. Distribuir 10 mL em tubos com tampa de rosca. Identificar e datar. Autoclavar a (121 ± 1)°C por 15 minutos. Armazenar adequadamente.
A composição básica do caldo glicose-sal 3%-teepol deverá ser a seguinte, por litro de meio:
- Extrato de carne - 3,0 g;
- Peptona - 10,0 g;
- Cloreto de sódio - 30,0 g;
- Glicose - 5,0 g;
- Violeta de Metila - 0,002 g;
- Teepol - 4 mL
- pH 8,8 ± 0,2.
¶ Caldo glicose triptona (caldo dextrose triptona)
Pesar o meio glicose triptona, de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporção indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de água destilada/deionizada correspondente. Homogeneizar até completa dissolução. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especifica do laboratório. Distribuir volumes de 10 mL em tubos com tampa de rosca. Identificar e datar. Autoclavar a (121 ± 1)°C por 15 minutos. Armazenar adequadamente.
A composição básica do caldo dextrose triptona deverá ser a seguinte, por litro de meio:
- Triptona - 10,0 g;
- Glicose - 5,0 g;
- Extrato de carne - 5,0 g;
- pH 6,7 ± 0,2.
¶ Caldo Horie arabinose violeta de etila (HAEB)
Pesar separadamente os seguintes ingredientes:
- Peptona - 5,0 g;
- Cloreto de sódio - 30,0 g;
- Extrato de carne - 3,0 g;
- Violeta de etila - 0,001 g;
- Azul de bromotimol - 0,03 g;
Transferir para recipiente adequado. Adicionar 900 mL de água destilada/deionizada. Agitar até completa dissolução. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especifica do laboratório. Autoclavar a (121 ± 1)°C por 15 minutos. Preparar separadamente 100 mL de uma solução aquosa a 5% de arabinose, esterilizar por filtração e adiciona-la assepticamente aos 900 mL do caldo. Distribuir assepticamente 10 mL em tubos estéreis de 15 x 180 mm.
¶ Caldo ONPG sal 3%
Preparar a solução de água peptonada 1% de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporção indicada pelo fabricante ou compondo a formulação de acordo com as orientações contidas neste capítulo. Adicionar 25,0 g de cloreto de sódio por litro de meio. Autoclavar a (121 ± 1)°C por 15 minutos. Esfriar e reservar. Para o preparo do Caldo ONPG sal 3%, misturar assepticamente 25 mL da solução ONPG em 75 mL da água peptonada-sal 3%.
¶ Caldo peptonado sem sal
Pesar, em recipiente apropriado, 10,0 g de Peptona (ou triptona). Dissolver em 1 L de água destilada/deionizada. Agitar até a completa dissolução. Verificar a necessidade de ajuste do pH em 7,4 ± 0,2, conforme norma especifica do laboratório. Distribuir volumes de 10 mL em tubos de ensaio. Identificar e datar. Autoclavar a (121 ± 1)°C por 15 minutos. Armazenar adequadamente.
¶ Caldo peptonado sal (3%, 6%, 8% ou 10%)
Pesar, em recipiente apropriado, 10,0 g de Peptona (ou triptona) e a quantidade de cloreto de sódio necessária para atingir-se a concentração desejada. Dissolver em 1 L de Água destilada/deionizada. Agitar até a completa dissolução. Verificar a necessidade de ajuste do pH em 7,4 ± 0,2, conforme norma especifica do laboratório. Distribuir volumes de 10 mL em tubos de ensaio. Identificar e datar. Autoclavar a (121 ± 1)°C por 15 minutos. Armazenar adequadamente.
¶ Caldo verde brilhante bile lactose 2%
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(N) - nocivo por ingestão |
Pesar o caldo Verde brilhante bile lactose 2%, de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporção indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado e adicionar o volume de água destilada/deionizada correspondente. Agitar até completa dissolução. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especifica do laboratório. Distribuir volumes de 10 mL em tubos de ensaio com tubos de Durham invertidos. Autoclavar a (121 ± 1)°C por 15 minutos.
A composição básica de caldo Verde brilhante-bile 2%-lactose deverá ser a seguinte, por litro de meio:
- Peptona - 10,0 g;
- Lactose - 10,0 g;
- Bile bovina - 20,0 g;
- Verde brilhante (N) - 0,0133 g;
- pH 7,4 ± 0,2.
¶ Caldo vermelho de fenol - base (para fermentação de carboidratos)
Pesar o caldo vermelho de fenol - base de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporção indicada pelo fabricante. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de água destilada/deionizada correspondente. Agitar até completa dissolução. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especifica do laboratório. Distribuir volumes de 90 mL em frascos. Autoclavar a (121 ± 1)°C por 15 minutos ou esterilizar por filtração após a adição da solução de carboidrato.
A composição básica de caldo vermelho de fenol base deverá ser a seguinte, por litro de meio:
- Proteose peptona - 10,0 g;
- Extrato de carne - 1,0 g;
- Cloreto de sódio - 5,0 g;
- Vermelho de fenol - 0,018 g;
- pH 7,4 ± 0,2.
Adicionar aos frascos com 90 mL de meio autoclavado e resfriado a 45-50°C, 10 mL de solução de carboidrato esterilizada por filtração; caso se opte por não autoclavar o meio base, adicionar a solução de carboidrato e esterilizar a mistura por filtração. As soluções de carboidratos deverão estar em concentração final de 5,0 a 10,0 g·L⁻¹ de meio. Distribuir em tubos, de acordo com a necessidade. Tampar e identificar os tubos. Manter sob refrigeração até o momento do uso.
¶ Caldo Vermelho de fenol sal 3%
Preparar o caldo vermelho de fenol base de acordo com o indicado, adicionando 30 g de cloreto de sódio por litro de meio.
¶ Caldo vermelho de fenol sal 3%-lisina
Preparar o caldo vermelho de fenol-sal de acordo com o indicado. Adicionar 1 mL de solução de lisina a 10% esterilizada por filtração a cada tubo com 10 mL de meio básico.
¶ Meio gelatina
Pesar o ágar gelatina, de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporção indicada pelo fabricante ou compondo a formulação. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de água destilada/deionizada correspondente. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especifica do laboratório. Deixar em repouso por cerca de 15 minutos. Aquecer até completa dissolução. Distribuir volumes de acordo com a necessidade. Identificar e datar. Autoclavar a (121 ± 1)°C por 15 minutos. Armazenar adequadamente.
A composição básica do ágar gelatina deverá ser a seguinte, por litro de meio:
- Peptona de carne - 5,0 g;
- Extrato de carne - 3,0 g;
- Gelatina - 120,0 g;
- pH 6,9 ± 0,1.
¶ Meio gelatina sal 3%
Preparar o ágar gelatina de acordo com o item anterior, adicionando 30 g de cloreto de sódio por litro de meio.
¶ Meio O/F (Hugh-Leifson) sal 3%
Pesar o meio OF glicose de acordo com o volume de meio a ser preparado, respeitando a proporção indicada pelo fabricante, adicionando 30 g de cloreto de sódio por litro de meio a ser preparado. Transferir para recipiente adequado. Adicionar o volume de água destilada/deionizada correspondente. Deixar repousar por 15 minutos. Aquecer, sob agitação, até completa dissolução do meio. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especifica do laboratório. Distribuir volumes de 4 mL em tubos de ensaio. Autoclavar a (121 ± 1)°C por 15 minutos.
A composição básica de meio OF glicose deverá ser a seguinte, por litro de meio:
- Triptona - 2,0 g;
- Cloreto de sódio - 5,0 g;
- Fosfato de potássio dibásico - 0,3 g;
- Azul de bromotimol - 0,08 g;
- Glicose - 10,0 g;
- Ágar - 2,0 g;
- pH 6,8 ± 0,2.
¶ Preparo de reagentes e soluções
¶ Ácido nalidíxico solução 0,1% em PBS pH 7,2
Transferir 10 mL da solução de ácido nalidixico 1% para balão volumétrico de capacidade para 100 mL e completar o volume com tampão fosfato pH 7,2. Esterilizar por filtração.
Distribuir em alíquotas de 20 mL, em frascos de vidro estéreis identificados e datados. Manter a −20 °C por até 6 meses. Manter uma das alíquotas sob refrigeração, para uso diário. Usar 1 mL desta solução para cada 100 mL de ágar ABL.
¶ Ácido nalidíxico solução 1% em NaOH 0,1 mol·L-1
Pesar 1.0 g de ácido nalidixico (N), colocar em balão volumétrico de 100 mL e adicionar solução de NaOH 0,1 mol·L−1, agitando para dissolução, até completar o volume. Distribuir em frasco plástico identificado e datado, e manter protegido da luz.
¶ Ácido pipemídico solução 0,2% em PBS pH 7,2
Transferir 10 mL da solução de ácido pipemidico 2% para balão volumétrico de capacidade 100 mL e completar o volume com tampão fosfato pH 7,2. Esterilizar por filtração.
Distribuir em alíquotas de 20 mL, em frasco de vidro estéril identificado e datado. Manter a −20 °C por até 6 meses. Manter uma das alíquotas sob refrigeração, para uso diário. Usar 1 mL desta solução para cada 100 mL de ágar ABL.
¶ Ácido pipemídico solução 2% em NaOH 0,1 mol·L-1
Pesar 2,0 g de ácido pipemídico e adicionar NaOH 0.1 mol·L−1 até que se dissolva completamente. Transferir para balão volumétrico de capacidade para 100 mL e completar o volume com NaOH 0,1 mol·L−1.
Distribuir em frasco plástico identificado e datado, e manter protegido da luz, sob refrigeração.
¶ Emulsão de gema de ovo 50%
Não havendo emulsão comercialmente disponível, escolher ovos com casca perfeita e lavar com água morna. Secar, imergir em etanol a 70 ° GL durante cerca de 10 minutos ou em solução de ácido peracético a 0,02% por cerca de 15 minutos. Secar com toalha estéril. Quebrar a casca assepticamente e separar a gema da clara, transferindo a gema para frasco estéril. Adicionar o mesmo volume de solução salina 0,85%. Misturar bem, até a completa homogeneização da solução. Pasteurizar a emulsão obtida durante 30 minutos a (63 ± 2)°C em banho-maria, com agitação suave e frequente.
Realizar o controle de esterilidade da emulsão de gema de ovo conforme abaixo especificado:
- Inocular 0,1 mL da emulsão de gema de ovo em um tubo contendo caldo BHI;
- Incubar a (36 ± 1)°C por 48 horas;
- Após incubação, repicar com alça para a superfície seca de ágar Baird Parker e PCA;
- Incubar a (36 ± 1)°C por 48 horas.
- Verificar a presença de crescimento bacteriano.
Em caso de crescimento, descartar a emulsão.
¶ Peróxido de hidrogênio solução aquosa 3% (10V)
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(C) - Corrosivo. Provoca queimaduras (I) - Extremamente irritante às vias respiratórias e olhos (E) - Potencialmente explosivo |
O peroxido de hidrogênio 3% pode ser adquirido em farmácias ou pode-se preparar a solução 3% a partir de peroxido de hidrogênio (C/I/E) 20V ou 100V conforme abaixo:
- A partir de peroxido de hidrogênio 100V (30%): pesar 10 g do peroxido e diluir para 100 mL com água destilada/ deionizada.
- Peroxido de hidrogênio 20V (6%): medir em proveta 50 mL do peroxido e completar o volume a 100 mL com água destilada/ deionizada.
Identificar e datar. Manter sob refrigeração, protegida da luz.
¶ Reativo para Oxidase I - N,N,N’,N’-tetrametil-p-fenilenodiamina
Dissolver 0,5 g de N,N,N’,N’-tetrametil-p-fenilenodiamina em 50 mL de água destilada/deionizada. Distribuir volumes de 5 mL em frascos de cor âmbar ou envoltas em papel alumínio. Identificar e datar. Manter a −20 °C. A alíquota em utilização deve ser mantida sob refrigeração, protegida da luz.
Não utilizar o reativo se este apresentar coloração azul.
¶ Reativo para Oxidase II - Oxalato de p-amino-dimetilanilina
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(N) - nocivo por ingestão (H) - hidropoluente |
Pesar 0,5 g de oxalato de p-amino-dimetilanilina (N/H), em recipiente apropriado. Adicionar 50 mL de água destilada/deionizada. Agitar até completa dissolução. Distribuir volumes de 5 mL em frascos de cor âmbar ou envoltas em papel alumínio. Identificar e datar. Manter a −20 °C. A alíquota em utilização deve ser mantida sob refrigeração, protegida da luz.
Não utilizar o reativo se este apresentar coloração vermelha ou marrom.
¶ Soluções de carboidratos
Para as provas de fermentação de carboidratos, recomenda-se o uso das soluções nas concentrações de 5,0 g ou 10,0 g por litro de meio.
Arabinose 10%; Glicose 10%; Manitol 10%; Maltose 10%; Rafinose 10%; Ramnose 5%; Sacarose 10% ou Xilose 5%:
Dissolver 5,0 ou 10,0 g do carboidrato desejado em 100 mL água destilada/deionizada. Esterilizar por filtração. Distribuir volumes de 10 ou 20 mL em frascos estéreis. Identificar e datar adequadamente. Manter sob refrigeração.
¶ Solução carbol-fucsina 0,3%
Dissolver 0,3 g de fucsina básica em 10 mL de etanol. Adicionar a uma solução de 5,0 mL de fenol (cristais fundidos) em 95 mL de água destilada.
¶ Solução contracorante de safrina O
Preparar uma solução estoque adicionando 2.5 mL de Safranina O a 100 mL de Etanol 95%.
Para a solução de trabalho, adicionar 10 mL da Solução estoque de Safranina O a 90 mL de água destilada.
¶ Solução corante azul de Coomasie
A 100 mL de água destilada, adicionar 50 mL de metanol, 7 mL de ácido acético glacial e 0,25 g de Azul de Coomasie.
¶ Solução corante cristal violeta
Dissolver 2 g de Cristal Violeta (90-95% de pureza) em 20 mL de etanol 95%. Filtrar em papel de filtro. Adicionar a uma solução de 0,2 g de oxalato de amônio em 80 mL de água destilada. Deixar em repouso por 24 horas, filtrando em seguida. Estocar em frasco âmbar.
¶ Solução corante cristal violeta-oxalato de amônio para coloração de Campylobacter
Misturar uma solução de 2,0 g de Cristal Violeta (90-95% de pureza) em 200 mL de etanol 95% a uma solução de 8,0 g de oxalato de amônio em 800 mL de etanol 95%. Deixar em repouso por uma noite ou mais em temperatura ambiente. Filtrar em filtro de papel grosso.
¶ Solução de lugol (iodo iodeto de potássio)
Adicionar a 300 mL de água destilada, 1 g de cristais de iodo (ou iodo ressublimado) e 2 g de iodeto de potássio. Misturar e deixar em repouso até dissolução.
¶ Solução de verde malaquita 5%
Adicionar 2,5 g de Verde malaquita a 50 mL de água destilada. Misturar e deixar em repouso de um dia para o outro para dissolução.
¶ Solução salina 0,85%
Pesar 8,5 g de cloreto de sódio. Transferir para um recipiente adequado. Adicionar 1 L de água destilada/deionizada. Agitar com auxilio de bastão de vidro até dissolução. Verificar a necessidade de ajuste de pH, conforme norma especifica do laboratório. Distribuir de forma a garantir o volume desejado após a autoclavação. Autoclavar a (121 ± 1)°C por 15 minutos. Identificar, datar e armazenar adequadamente.
¶ Solução salina fosfatada tamponada pH 7,2 (PBS)
¶ Preparo das soluções estoque:
Solução fosfato de potássio monobásico (KH₂PO₄) 0,15 mol·L−1: Dessecar o KH₂PO₄ a 110°C por uma hora. Pesar 20,41 g do sal e dissolver em água deionizada. Completar o volume para 1000 mL em balão volumétrico.
Solução fosfato de sódio dibásico (Na₂HPO₄) 0,15 mol·L−1: Dessecar o Na₂HPO₄ a 130°C por duas horas. Pesar 21,29 g do sal e dissolver em água deionizada. Completar o volume para 1000 mL em balão volumétrico.
A composição básica da solução salina fosfatada tamponada deverá ser a seguinte, por litro:
- Cloreto de sódio - 1,7 g;
- Solução fosfato de potássio monobásico 0,15 mol·L−1 - 24 mL;
- Solução de fosfato de sódio dibásico 0,15 mol·L−1 - 76 mL;
- Água destilada/deionizada - q.s.p. 1000 mL;
- pH 7,2 ± 0,2.
Distribuir volumes conforme a necessidade. Autoclavar a (121 ± 1)°C por 15 minutos.
¶ Solução salina peptonada 0,1%
Pesar, separadamente, 8,5 g de cloreto de sódio e 1,0 g de peptona. Transferir para recipiente adequado e adicionar 1000 mL de água destilada/deionizada. Agitar com auxilio de bastão de vidro até dissolução. Verificar a necessidade de ajuste do pH em 7,0 ± 0,2, conforme norma especifica do laboratório. Distribuir de forma a garantir o volume desejado após a autoclavação. Identificar e datar. Autoclavar a (121 ± 1)°C por 15 minutos. Armazenar adequadamente.
¶ Solução salina peptonada 0,1%-sal 3%
Seguir o procedimento para preparo da Solução salina peptonada 0,1%, adicionando 30 g de cloreto de sódio por litro de solução.
¶ Tiamina cloridrato solução 0,01%
Pesar 100 mg de tiamina e transferir para o balão volumétrico de capacidade para 100 mL e completar o volume com água destilada/deionizada. Transferir 5 mL da solução de solução 0,1% para um balão volumétrico de capacidade para 50 mL e completar o volume com água destilada/deionizada. Esterilizar por filtração. Distribuir em frascos estéreis. Manter protegida da luz, em refrigeração por até três meses.
¶ 8. Disposições Gerais
As sugestões para aprimoramento ou possíveis correções deste documento devem ser direcionadas ao Departamento responsável, para alinhamento das melhores práticas de mercado, legislação vigente e/ou regulamentações, que não tenham sido contempladas na versão vigente.
¶ 9. Histórico de revisões
Publicação em formato wiki, disponível no repositório de manuais da SDA, conforme preconizado pela Portaria SDA/MAPA nº 1110, 13 de maio de 2024.
Em 09.08.2024, inclusão do método de Pesquisa de Paenibacillus larvae subsp. Larvae.