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Ano 2025
Elaboração, distribuição, informações:
Ministério da Agricultura e Pecuária
Secretaria de Defesa Agropecuária - SDA
Departamento de Serviços Técnicos - DTEC
Esplanada dos Ministérios, Bloco D, Anexo, Ala B, 4º andar, sala 433
CEP: 70043-900, Brasília - DF
https://www.gov.br/agricultura/pt-br
e- mail: cgal@agro.gov.br
Central de Relacionamento: 0800 704 1995
Equipe Técnica:
Fabrício Pedrotti (AFFA - Coordenador-Geral CGAL/DTEC)
Marcos Vinícius de Santana Leandro Júnior (AFFA - Coordenador CDL/CGAL/DTEC) - Revisão
Carolina Ribeiro Figueiredo (Chefe NGBIO - LFDA-GO) - Elaboração e Revisão
Maria da Glória Trindade (AFFA - LFDA-GO) - Elaboração e Revisão
Nilson César Castanheira Guimarães (AFFA - CDL/CGAL/DTEC) - Revisão
Regina Melo Sartori Coelho (AFFA - CDL/CGAL/DTEC) - Elaboração e Revisão
Roseli Chela Fenille (Coordenadora LFDA-GO) - Revisão
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Macroprocesso: Laboratórios |
Objetivo: Estabelecer diretrizes com foco nas metodologias de análise a serem utilizadas na área de diagnóstico fitossanitário destinados aos laboratórios oficiais e credenciados da Rede Nacional de Laboratórios Agropecuários. |
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Processo:
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Entrega:
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Público alvo e demais interessados: Laboratórios oficiais e credenciados do Ministério da Agricultura e Pecuária (MAPA) |
Versão do documento: 1 |
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Setor responsável e responsabilidades A Coordenação Geral de Laboratórios Agropecuários do Departamento de Serviços Técnicos é responsável pela elaboração, atualização e envio para aprovação deste manual, tendo responsabilidade quanto aos procedimentos descritos no documento. |
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O laboratório deve operar um sistema de gestão em conformidade com os requisitos da ISO/IEC nº 17025, mantendo uma política da qualidade formalizada, bem como manuais, procedimentos e registros continuamente atualizados. Como parte desse sistema, é fundamental implementar uma abordagem estruturada de gerenciamento de riscos, identificando e tratando riscos relacionados à imparcialidade, confidencialidade, competência técnica, equipamentos e insumos.
Auditorias internas devem ser conduzidas periodicamente, com escopo abrangente que contemple todas as atividades laboratoriais, incluindo a revisão crítica dos métodos empregados e dos resultados obtidos. Para o tratamento de não conformidades, deve-se dispor de um procedimento definido para a identificação, análise de causa, implementação de ações corretivas e verificação da eficácia das medidas adotadas. Complementarmente, o laboratório deve adotar uma estratégia de melhoria contínua, com revisões críticas periódicas do sistema de gestão e análise sistemática de indicadores de desempenho.
As metodologias de diagnóstico utilizadas devem estar alinhadas aos seguintes padrões: os EPPO Standards – PM 7 Diagnostics, emitidos pela Organização Europeia e Mediterrânea para a Proteção das Plantas (EPPO), e os Padrões Internacionais para Medidas Fitossanitárias (ISPMs), adotados pelo Comitê de Medidas Fitossanitárias da Convenção Internacional para a Proteção de Plantas (CIPV). Nos casos em que forem adotadas metodologias não normalizadas, é obrigatória a obtenção de autorização prévia do Ministério da Agricultura e Pecuária (MAPA), acompanhada da devida validação da metodologia proposta.
De modo geral, quando se utiliza um teste confirmatório, recomenda-se que ele adote, preferencialmente, um princípio biológico distinto daquele usado na triagem inicial. No caso de testes moleculares, a confirmação deve ser realizada com um segundo teste que tenha como alvo uma região genômica diferente. Essa abordagem é especialmente relevante em situações críticas, como na detecção de praga em área de primeira ocorrência, primeira detecção de praga no laboratório, e identificação de praga em produto regulamentado originado de país onde essa praga é oficialmente considerada ausente.
Como requisito fundamental, os testes adotados devem apresentar resultados repetíveis e reprodutíveis. Além disso, devem demonstrar sensibilidade analítica, especificidade analítica e seletividade adequadas, assegurando a detecção confiável do alvo, a ausência de reações cruzadas com não-alvos e a robustez frente às variações na matriz.
Outros aspectos também devem ser considerados na escolha do método, como: facilidade de execução, disponibilidade de equipamentos, exigência de capacitação técnica, tempo necessário e custo do ensaio. Deve-se ainda verificar a recomendação de uso de testes combinados, conforme indicado nos fluxogramas técnicos disponibilizados por normas internacionais aplicáveis.
A qualificação da equipe técnica é outro aspecto essencial para a confiabilidade das análises. Os profissionais envolvidos nas atividades de diagnóstico devem possuir formação específica, capacitação contínua e experiência compatível com os métodos empregados. Devem ser mantidos registros atualizados sobre qualificação, treinamentos realizados e participação em testes de proficiência internos e externos.
As instalações laboratoriais devem dispor de infraestrutura adequada ao nível de biossegurança requerido, assegurando a segregação de atividades e evitando riscos de contaminação cruzada.
Em relação aos equipamentos, é obrigatória a utilização de instrumentos calibrados, verificados e devidamente mantidos, com critérios de aceitação e aplicados controles internos de qualidade para o uso de equipamentos críticos. No que diz respeito aos materiais e reagentes, recomenda-se a utilização de insumos com grau de pureza adequado para diagnósticos moleculares ou microbiológicos, mantendo-se registros detalhados de lote, validade, condições de armazenamento e uso.
O recebimento das amostras deve seguir critérios estabelecidos pela autoridade competente ou definidos em protocolos oficiais, assegurando-se a rastreabilidade desde o recebimento, com documentação clara sobre a origem, identificação e integridade das amostras. A rastreabilidade completa deve ser mantida ao longo de todo o processo, abrangendo amostras, procedimentos, operadores, equipamentos e resultados. Para isso, é necessário implementar um sistema seguro de registros, com cópias de segurança regulares e controle de acesso a dados críticos.
Por fim, o controle de qualidade dos ensaios deve incluir o uso de controles positivos, negativos e ambientais, especialmente em ensaios moleculares. A performance dos métodos deve ser avaliada periodicamente, preferencialmente por meio de ensaios interlaboratoriais e/ou programas de proficiência.
Este manual possui vigência indeterminada e será revisado sempre que necessário pela Coordenação-Geral de Laboratórios Agropecuários do Departamento de Serviços Técnicos (CGAL/DTEC).
A gestão do documento é responsabilidade da CGAL/DTEC, que prestará suporte ao público-alvo. Dúvidas ou sugestões quanto à aplicação devem ser encaminhadas ao departamento responsável.
A publicação e atualização das versões na plataforma oficial da SDA estão sob responsabilidade da Secretaria, representada pelo DTEC.
Estabelecer e harmonizar os métodos oficiais para análise de diagnóstico fitossanitário na Rede Nacional de Laboratórios Agropecuários do Sistema Unificado de Atenção à Sanidade Agropecuária (SUASA), garantindo a harmonização técnica e a conformidade dos métodos com padrões internacionais reconhecidos.
Antes e após o processamento, as bancadas devem ser limpas com solução desnaturante de ácido nucleico, e, se necessário, realizar pulverização de água no ambiente para decantar moléculas em suspensão. O operador deve utilizar jaleco e luvas sem talco, sendo recomendado o uso de máscara e protetor auricular quando necessário. Durante a abertura da amostra, deve-se avaliar e registrar seu estado geral, incluindo integridade e possíveis contaminantes, com registro fotográfico. A amostra deve ser armazenada em condições adequadas conforme sua natureza. Para detecção por técnicas moleculares, toda amostra deve ser homogeneizada e caso não haja necessidade de pesagem, devem ser retirados fragmentos ou alíquotas suficientes para obter um volume entre 0,2 e 0,5 mL, quando aplicável. O processamento deve ser realizado individualmente, preferencialmente em cabine de segurança biológica Classe II, mínimo A1, desde que não haja compostos tóxicos/voláteis. Os microtubos utilizados devem ser identificados com o número da amostra e uma letra ou número, e armazenados em freezer para posterior extração de DNA.
Aplicável a amostras como grãos, líquidos, granulados, entre outras. Homogeneizar manualmente em sacos plásticos, invertendo pelo menos 20 vezes. Amostras líquidas ou acondicionadas em pequenos recepientes podem ser homogeneizadas na própria embalagem.
Amostras com partículas superiores a 1 mm devem ser submetidas à pulverização. No caso de sementes tratadas, estas devem ser lavadas com água corrente, secas ao ar ou em estufa a temperatura entre 30 °C e 55 °C antes do processamento. Iniciar a moagem com pequena porção da amostra para ambientação do equipamento, descartando esse material em seguida. Processar completamente a amostra. Homogeneizar a amostra e novamente processar separadamente duas alíquotas para a obtenção de uma camada fina aderida às paredes do copo do processador. De cada alíquota pesar entre 200 e 250 mg em microtubos devidamente identificados. Utilizar preferencialmente 4 microtubos por amostras e no mínimo dois. Após o processamento, pulverizar o ambiente com água e, se necessário, limpar a cabine e aspirar o chão para remover resíduos.
Quando requerido na metodologia, estimar o peso correspondente com base na média do peso de três subamostras, por exemplo: com 10 grãos/sementes cada subamostra. Caso a amostra não atinja o peso necessário, deve-se triturar toda a amostra, reservando no mínimo 10 unidades e registrar essa condição no relatório. O excedente da amostra, quando houver, deve ser homogeneizado e armazenado adequadamente pelo período estabelecido no procedimento de manuseio de itens de ensaio. O peso estimado admite uma tolerância de ± 10%, correspondente a porção da amostra que será processada para análise.
Retirar no mínimo quatro porções aleatórias da amostra ou, caso não esteja homogênea, processar todo o volume. Reservar uma porção da amostra homogeneizada para eventual rextração, se necessário.
Abrir a amostra com cuidado. Quando necessário, concentrá-la por evaporação em banho-maria até aproximadamente 25% do volume original ou utilizando o concentrador SpeedVac a cerca de 40 °C por no mínimo 20 minutos.
Retirar tecido representativo da amostra, selecionando fragmentos de tecido intermediário entre o tecido sadio e o tecido externo com sintomas característicos da doença. Utilizar um volume máximo de 0,5 mL em microtubo de 2mL e dois microtubos por amostra. O tecido pode ser fragmentado em nitrogênio líquido, podendo ser utilizado disruptor de tecido com beads, ou macerado diretamente no tampão de extração. Amostras processadas com nitrogênio líquido podem ser armazenadas no freezer até a extração.
Separar partes do inseto, como pata, antena ou cabeça, e remover o álcool residual com papel absorvente. Para análises de detecção de patógenos em vetor, utilizar o inseto inteiro no microtubo.
Adicionar o espécime ao microtubo, centrifugar (30 s, ≥5.000 x g) e armazenar no freezer.
Após o processamento, as amostras seguem para a extração de ácido nucleico conforme metodologia validada para cada tipo de amostra. O controle da extração deve ser registrado no sistema da qualidade.
Todos os procedimentos devem ser realizados em ambiente separado da homogeneização, da PCR e da análise pós-PCR, preferencialmente em cabine de segurança biológica Classe II, mínimo B1, no caso de uso de solventes orgânicos ou produtos voláteis e tóxicos. Preparar um Controle de Extração (CE) por extração. Se houver mais de uma extração no mesmo dia, diferenciar as identificações nos microtubos dos controles. O Controle Ambiental (CA) deve conter 50 a 100 µL de água ou outro eluente, mantido aberto durante todo o procedimento. Quando solicitado, insetos devem ser resgatados em microtubos com álcool ≥ 90%, identificados com o número da amostra e com todas as partes do indivíduo reunidas em um único tubo.
Após a extração, quando necessário, realizar a quantificação e diluição do ácido nucleico. Armazenar as amostras a ≤ –20 °C, exceto quando indicado o uso de temperaturas mais baixas, como no caso de RNA, que deve ser mantido a < –75 °C. Evitar congelamento e descongelamento repetido da solução inicial.
Os métodos abaixo foram validados na unidade laboratorial do Ministério da Agricultura e Pecuária, podendo ser utilizados como referência. Outras marcas de kits e extratores poderão ser utilizados após validação.
Método utilizado para extração de ácido nucleico em amostras como grãos e sementes.
Figura 1: Extração de ácido nucleico através do método CTAB Básico, fase 1.
Figura 2: Precipitação do CTAB, fase 2 (opcional). Esta fase se faz necessária quando se visualizar uma camada com aspecto de gordura acima do sobrenadante comum em amostras ricas em proteínas e polissacarídeos, como grãos de soja, linhaça, entre outros.
Figura 3: Precipitação do ácido nucleico, fase 3.
Método de extração utilizado para extrair o ácido nucleico de amostras de folhas, isolados de agentes patogênicos e insetos.
Figura 4: Extração de ácido nucleico através do método CTAB modificado, fase 1.
Nota 1: Certos alimentos podem formar três fases após centrifugação. Se isso acontecer, passe pela fase superior com a pipeta de transferência e retire uma única parte da alíquota do meio (fase clara). Se na fase superior formou-se uma película semissólida (como por exemplo observado com o chocolate), perfurar a película com a pipeta e transferir apenas uma alíquota da fase mais clara.
Nota 2: Para obtenção de um ácido nucleico com menor concentração de inibidores, pode-se incubar à temperatura ambiente, sem agitação, na etapa do clorofórmio por um período de 4 a 24 horas. Essa etapa pode ser realizada para as amostras de grãos/sementes de soja, linhaça, entre outros.
Nota 3: Amostras de ácido nucleico que apresentam inibição devem ser reextraídas a partir da fase de adição do tampão PB.
Figura 5: Extração de ácido nucleico através de kit com coluna para tecido vegetal, grãos/sementes e isolados de agentes patogênicos (Referência: DNeasy Mericon Food – Qiagen) .
Figura 6: Extração de ácido nucleico através de kit com coluna para inseto (Referência: DNeasy Mericon Food – Qiagen).
Figura 7: Extração de ácido nucleico através do kit com coluna (Referência: DNeasy Blood & Tissue – Qiagen).
Figura 8: Extração de RNA através de kit com coluna (Referência: RNeasy® Mini – Qiagen).
Método de extração utilizado para extração de ácido nucleico de diversos tipos de matriz.
Figura 9: Extração de Ácido nucleico (DNA/RNA), Kit Maxwell® RSC PureFood GMO and Authentication (Referência: Sistema Maxwell, Promega).
Quando necessário, as amostras extraídas são quantificadas utilizando espectrofotometria ou fluorimetria.
A quantificação é realizada com base na absorbância dos ácidos nucleicos, especialmente em 260 nm. O equipamento faz leituras nos comprimentos de onda 230, 260, 280 e 320 nm para cálculo da concentração e pureza. A concentração é calculada usando a equação de Beer-Lambert, com fatores específicos para cada tipo de ácido nucleico (DNA fita dupla, fita simples, RNA).
Para análise:
A quantificação por fluorimetria utiliza a fluorescência emitida pela amostra, proporcional à concentração do ácido nucleico.
Para análise:
O método deve ser desenvolvido sob condições assépticas, preferencialmente em cabine de segurança biológica Classe II, mínimo A1, desde que não haja compostos tóxicos/voláteis. Todos os utensílios e micropipetas utilizados para a PCR devem ser exclusivos para este fim e devem estar livres do ácido nucleico e enzimas que o degradam ou qualquer contaminante. Devem ser usadas, sempre que possível, ponteiras com filtros e luvas descartáveis sem talco, estéreis, e devem ser trocadas sempre que houver possibilidade de contaminação. Deve-se usar a quantidade de ácido nucleico por reação da PCR, conforme relatório de verificação de desempenho do método. Pode-se utilizar a diluição do ácido nucleico conforme resultado da quantificação ou uma outra diluição (por exemplo 1:10 ou 1:4) de solução de ácido nucleico não quantificado, ou ainda, o ácido nucleico não quantificado, desde que os resultados da PCR se adequem aos critérios de aceitabilidade.
Preconiza-se o uso de material de referência e controles adequados e dentro de uma dinâmica estabelecida para o método analítico selecionado e a amostra teste analisada. Sempre que necessário, a ausência de compostos inibidores de PCR deve ser comprovada. Para a análise de sequência de um gene alvo numa amostra teste, devem ser utilizados protocolos descritos nos relatórios de verificação de métodos do laboratório.
A PCR convencional é utilizada para análise qualitativa, detectando a presença ou ausência de uma sequência específica de ácido nucleico na amostra.
Antes da análise, ligar o equipamento e selecionar o programa correspondente. Verificar se as condições de amplificação (tempo e temperatura) estão de acordo com o método validado.
Separar e organizar as amostras de ácido nucleico utilizando um rack apropriado, seguindo o mapa previamente registrado (em formulário impresso ou sistema on-line).
Nota: Sempre que possível, incluir os controles de extração (CE) e ambientais (CA) na mesma reação para maior confiabilidade na detecção de contaminações.
Realizar a limpeza da câmara de adição do ácido nucleico. Planejar e registrar o mapa da placa com as posições de amostras e controles aplicáveis (positivo, reação, extração, ambiental e negativo).
Após a amplificação, o produto pode ser:
Para a eletroforese ou corrida seca em E-gel, seguir os procedimentos descritos no manual do equipamento.
A PCR em tempo real pode ser utilizado para análise qualitativa, detectando a presença ou ausência de uma sequência específica de ácido nucleico na amostra.
Antes da análise, ligar o equipamento e selecionar o programa correspondente. Verificar se as condições de amplificação (tempo e temperatura) estão de acordo com o método validado.
Separar e organizar as amostras de ácido nucleico utilizando um rack apropriado, seguindo o mapa previamente registrado (em formulário impresso ou sistema on-line).
Nota: Sempre que possível, incluir os controles de extração (CE) e ambientais (CA) na mesma reação para maior confiabilidade na detecção de contaminações.
Planejar e registrar o mapa da placa (impresso ou no sistema on-line).
Na câmara de segurança biológica, adicionar o mix e as amostras nos tubos ou microplacas ópticas, manualmente ou por pipetagem automatizada. Selar com adesivo óptico incolor, no caso das microplacas, centrifugar brevemente e inserir no termociclador.
Nota: Não escrever nas tampas dos microtubos ou adesivos das microplacas que serão inseridos no equipamento.
Após a corrida:
Resultados inesperados devem ser investigados e, se necessário, medidas corretivas adotadas, como nova extração ou limpeza do ambiente.
A interpretação dos resultados deve considerar os seguintes critérios:
Em alguns sistemas, a validação do método pode indicar a ocorrência de amplificação inespecífica após determinado ciclo. Nestes casos, deve-se considerar o Ct limite validado como referência para a tomada de decisão.
A PCR digital é indicada para aplicações que exigem a detecção de quantidades muito pequenas de ácido nucleico ou uma quantificação precisa da sequência alvo, sendo a análise baseada na detecção do número absoluto de cópias de ácido nucleico. Para a realização das análises, devem ser seguidas as instruções descritas no manual do fabricante do equipamento. O registro dos dados pode ser realizado no formulário específico ou diretamente no sistema on-line.
Esta metodologia descreve os métodos de sequenciamento Sanger para geração de barcodes e de Sequenciamento de Nova Geração (NGS) para geração de metabarcodes pela técnica de primer fusion, com o objetivo de identificação de espécies.
Aplicável para determinar a sequência de bases nucleotídicas em fragmentos de ácido nucleico gerados por PCR, o procedimento requer condições assépticas. Reagentes devem ser armazenados e manuseados em ambiente sem contato com ácido nucleico ou enzimas que o degradem. Utensílios e micropipetas devem ser exclusivos e livres de contaminantes. Utilizar ponteiras com filtro e luvas estéreis sem talco, trocando-as sempre que necessário. Quando aplicável, comprovar a ausência de inibidores de PCR. Kits fluorescentes devem ser protegidos da luz. Operar equipamentos conforme manuais, verificando a finalização de programas térmicos corretamente. Procedimentos devem ser realizados preferencialmente em cabines de segurança biológica limpas e operadas adequadamente.
O método utiliza uma fita de ácido nucleico como molde para gerar fragmentos de diferentes tamanhos por incorporação aleatória de ddNTPs marcados. A separação ocorre por eletroforese capilar e as sequências (A, C, T, G, N) são obtidas por leitura óptica. Preferencialmente, utilizam-se protocolos validados disponíveis na base Barcodes of Life.
A amplificação segue protocolo pré-definido. O produto pode ser purificado (opcional) com ExoSAP-IT ou reagente equivalente, puro ou diluído. Reação de sequenciamento é feita com BigDye, utilizando mix apropriado e programa de ciclagem. Produtos são purificados preferencialmente com Sephadex G50, eluídos em placas de PCR, secos, ressuspensos com Hi-Di Formamida, selados e desnaturados antes da corrida no Genetic Analyzer.
Permite sequenciamento paralelo de várias moléculas de ácido nucleico com o uso de primers fusion. Requer plano de corrida no Ion Torrent Suíte e importação para o Ion Chef e Ion S5 para obtenção dos resultados.
Para acesso aos protocolos normalizados, utilizar os seguintes endereços eletrônicos:
Esses links dão acesso aos protocolos atualizados de diagnóstico para pragas regulamentadas.
A utilização de metodologias não previstas nas normas internacionais deve ser previamente autorizada pelo MAPA.
A solicitação para autorização deverá conter:
A validação de métodos deve ser realizada para assegurar que o método proposto é adequado para o uso pretendido, fornecendo resultados confiáveis e rastreáveis. A validação dos métodos deve atender aos requisitos estabelecidos no OEPP/EPPO Bulletin PM 7/98.
Como mencionado na NORMA ISO/IEC 17025, o laboratório deve registrar os resultados obtidos e o procedimento utilizado para a validação de métodos. Métodos que são publicados com todas as informações sobre suas características de desempenho são considerados como “Métodos totalmente validados”, referidos como métodos normalizados (standard methods) pela ISO 17025 (EPPO, 2014).
O processo geral para a validação de métodos para diagnóstico fitossanitário envolve os seguintes passos:
A comparação de um teste (A) com um teste validado (B) é um meio alternativo de validação que pode ser útil em certas situações. Esta comparação apenas demonstra que o método A é tão bom quanto o método B com relação aos critérios de desempenho. A extensão do processo de validação é sempre um balanço entre custos, riscos e o que é tecnicamente possível. Quando for necessário algum desvio dos procedimentos aqui descritos, dependendo da combinação entre organismo fitopatogênico/matriz, as razões para o desvio devem ser documentadas.
Para informações complementares ver o link.
Sempre que o laboratório realizar modificações significativas em um método previamente validado, deve ser conduzido um processo formal de validação do novo método ou da versão modificada, a fim de comprovar sua adequação ao uso pretendido. Alterações consideradas menores — como ajustes de volumes, reagentes equivalentes ou mudanças de marca de consumíveis — requerem avaliação técnica criteriosa, com base no julgamento profissional da equipe responsável, para decidir se uma verificação de desempenho é necessária. Independentemente do grau da alteração, é obrigatória a autorização prévia do Responsável Técnico (RT) da unidade e o devido registro documental da decisão tomada e das evidências técnicas que a sustentam.
Os resultados de validação ou verificação de desempenho realizados pelo próprio laboratório, em especial os dados relacionados à reprodutibilidade, bem como os resultados obtidos em testes de proficiência ou comparações interlaboratoriais, oferecem subsídios importantes para a avaliação da robustez do método — isto é, sua capacidade de manter desempenho consistente mesmo diante de variações controladas nos reagentes ou nas condições de execução.
Adicionalmente, dados sobre sensibilidade e especificidade diagnóstica podem ser obtidos por meio da comparação com métodos de referência ou métodos alternativos validados, fortalecendo a confiança no método adotado.
Sensibilidade analítica: Analisar pelo menos três séries de amostras fortificadas com uma gama de 101-106 células do organismo alvo por mL, preferencialmente, por meio de suspensões de células diluídas da bactéria alvo no extrato da amostra. Determinar o menor nível de densidade celular que fornece um resultado positivo. Se resultados consistentes não forem obtidos após três séries, então diluições adicionais devem ser preparadas e testadas. A sensibilidade analítica refere-se a um conjunto específico de parâmetros os quais devem ser definidos e padronizados, por exemplo, marca de reagentes para PCR (em particular DNA polimerase) e condições de ciclagem da PCR.
Especificidade analítica: Analisar strains da bactéria alvo cobrindo a diversidade genética, diferentes origens geográficas e hospedeiros e um conjunto de bactérias não alvo, em particular aquelas associadas com a amostra. Utilizar suspensões de células de culturas purificadas a aproximadamente 106 células por mL. Para bactérias não alvo, a concentração de ácido nucleico deve ser alta o suficiente para maximizar a possibilidade de reação cruzada, mas permanecendo realística. Em adição, os resultados podem ser confirmados por comparação in silico das sequências de primers e sondas a sequências de uma biblioteca genômica.
Seletividade: Se relevante, determinar se as variações existentes na amostra (por exemplo, usando diferentes hospedeiros da mesma família, diferentes cultivares da espécie hospedeira) afetam a performance do método.
Repetibilidade: Analisar pelo menos três replicatas de amostras fortificadas com baixa concentração do organismo alvo. Se resultados consistentes não forem obtidos, replicatas adicionais devem ser preparadas e testadas.
Reprodutibilidade: Da mesma forma que estabelecido para repetibilidade, mas, se possível, com diferentes técnicos, em diferentes dias, e com diferentes instrumentos, quando relevante.
Sensibilidade analítica: Preparar um número relativo de indivíduos. Este número varia dependendo do gênero, espécie e estágio de desenvolvimento. Determine o número mínimo de indivíduos ou partes de indivíduo a ser detectado. Realizar pelo menos três experimentos. Se dados consistentes não forem obtidos após três séries, séries adicionais devem ser preparadas e testadas. A sensibilidade analítica refere a parâmetros específicos do teste os quais devem ser definidos e padronizados, como por exemplo, marca dos reagentes de PCR (em particular DNA polimerase) e condições de ciclagem de PCR.
Especificidade analítica: Analisar (a) uma gama de organismos alvos, cobrindo a diversidade genética, diferentes origens geográficas e hospedeiros e (b) organismos não alvos relevantes, em particular aqueles associados com as amostras. Para organismos não-alvos, a concentração de ácido nucleico deve ser alta o suficiente para maximizar a possibilidade de reação cruzada e ainda assim, permanecer realista. Em adição, os resultados podem ser confirmados por comparação in silico das sequências de primers e sondas a sequências de uma biblioteca genômica.
Seletividade: Não aplicável para insetos e ácaros previamente isolados da matriz. Se relevante, determinar se variações na amostra afeta o desempenho do método.
Repetibilidade: Analisar pelo menos três repetições da amostra em baixa concentração. Se resultados consistentes não forem obtidos, amostras adicionais devem ser isoladas.
Reprodutibilidade: Da mesma forma que estabelecido para repetibilidade, mas, se possível, com diferentes técnicos, em diferentes dias, e com diferentes instrumentos, quando relevante.
Sensibilidade analítica: Determinar a quantidade mínima do alvo (por exemplo, número de conídios ou peso do material infectado no material saudável) do qual uma quantidade detectável do DNA alvo pode ser obtida. Realizar pelo menos três experimentos com diluições seriais, preferencialmente em DNA de planta hospedeira. Se resultados consistentes não forem obtidos após três séries, diluições adicionais devem ser preparadas e testadas. A sensibilidade analítica refere-se a um conjunto específico de parâmetros os quais devem ser definidos e padronizados, por exemplo, marca dos reagentes de PCR (em particular DNA polimerase) e condições de ciclagem de PCR.
Especificidade analítica: Se relevante, analisar (a) uma gama de organismos cobrindo a diversidade genética, diferentes origens geográficas e hospedeiros e (b) relevantes organismos não alvos (por exemplo, fungos com relacionamento filogenético próximo) que podem estar presentes na amostra. Para organismos não-alvos, a concentração de ácido nucleico deve ser alta o suficiente para maximizar a possibilidade de reação cruzada e ainda assim, permanecer realista. Em adição, os resultados podem ser confirmados por comparação in silico das sequências de primers e sondas a sequências de uma biblioteca genômica.
Seletividade: Determinar se variações na amostra (por exemplo, usando diferentes cultivares da planta hospedeira) afeta o desempenho do método.
Repetibilidade: Analisar pelo menos três repetições da amostra em baixa concentração. Se resultados consistentes não forem obtidos, amostras adicionais devem ser isoladas.
Reprodutibilidade: Da mesma forma que estabelecido para repetibilidade, mas, se possível, com diferentes técnicos, em diferentes dias, e com diferentes instrumentos, quando relevante.
Sensibilidade analítica: Preparar um número de indivíduos. Este número pode variar dependendo do gênero, espécie e estágio de desenvolvimento. Determine o número mínimo de indivíduos ou parte de indivíduos a ser detectado ou identificado. Realizar pelo menos três experimentos. Se resultados consistentes não forem obtidos, amostras adicionais devem ser preparadas e testadas. A sensibilidade analítica refere-se a um conjunto específico de parâmetros os quais devem ser definidos e padronizados, por exemplo, marca dos reagentes de PCR (em particular DNA polimerase) e condições de ciclagem de PCR.
Especificidade analítica: Analisar (a) uma gama de organismos cobrindo a diversidade genética, diferentes origens geográficas e hospedeiros e (b) relevantes organismos não alvos que podem estar presentes na amostra. Para organismos não-alvos, a concentração de ácido nucleico deve ser alta o suficiente para maximizar a possibilidade de reação cruzada e ainda assim, permanecer realista. Em adição, os resultados podem ser confirmados por comparação in silico das sequências de primers e sondas a sequências de uma biblioteca genômica.
Seletividade: Não aplicável para nematoides se eles tiverem sido extraídos previamente da matriz. No entanto, se métodos baseados em PCR forem utilizados como método de detecção, determinar se variações na amostra (exemplo, tipo de solo, planta) afetam o desempenho do método.
Repetibilidade: Analisar pelo menos três repetições de uma amostra com baixa concentração do alvo. Se resultados consistentes não forem obtidos, amostras adicionais devem ser isoladas.
Reprodutibilidade: Da mesma forma que estabelecido para repetibilidade, mas, se possível, com diferentes técnicos, em diferentes dias, e com diferentes instrumentos, quando relevante.
Sensibilidade analítica (sensibilidade relativa): Em função do fato de que a concentração de viroses, viroides, fitoplasmas e outros microrganismos não cultiváveis nunca é conhecida, determinar a diluição máxima de DNA/RNA detectada. Realizar pelo menos três experimentos com diluições seriais. Se resultados consistentes não forem obtidos, séries adicionais devem ser preparadas e testadas. A sensibilidade analítica refere-se a um conjunto específico de parâmetros os quais devem ser definidos e padronizados, por exemplo, marca dos reagentes de PCR (em particular DNA polimerase) e condições de ciclagem de PCR.
Especificidade analítica: Analisar (a) uma gama de organismos cobrindo a diversidade genética, diferentes origens geográficas e hospedeiros e (b) organismos não alvos relevantes que podem estar presentes na amostra. Para organismos não-alvos, a concentração de ácido nucleico deve ser alta o suficiente para maximizar a possibilidade de reação cruzada e ainda assim, permanecer realista. Em adição, os resultados podem ser confirmados por comparação in silico das sequências de primers e sondas a sequências de uma biblioteca genômica.
Seletividade: Se relevante, determinar se variações na amostra (por exemplo, usando diferentes cultivares da planta hospedeira) afetam o desempenho do método.
Repetibilidade: Analisar pelo menos três repetições da amostra em baixa concentração. Se resultados consistentes não forem obtidos, amostras adicionais devem ser preparadas e testadas.
Reprodutibilidade: Da mesma forma que estabelecido para repetibilidade, mas, se possível, com diferentes técnicos, em diferentes dias, e com diferentes instrumentos, quando relevante.
Os laboratórios devem assegurar que as metodologias utilizadas sejam sempre atualizadas e alinhadas aos padrões internacionais reconhecidos.
Para qualquer mudança de metodologia ou dúvida sobre conformidade técnica, o MAPA deverá ser consultado previamente.
Os registros dos métodos aplicados e seus resultados devem ser mantidos em conformidade com os requisitos de rastreabilidade estabelecidos pela Norma ISO/IEC nº 17025: versão atual.
Sempre que receber um produto regulamentado é responsabilidade do laboratório consultar os sistemas PVIA (importação) e T-REX (exportação).
BRASIL. Ministério da Agricultura e Pecuária. Portaria SDA/MAPA nº 1110, de 13 de maio de 2024. Institui diretrizes para publicação e manutenção de manuais técnicos no âmbito da SDA.
BRASIL. Ministério da Agricultura e Pecuária. Sanidade Vegetal – Análise de Riscos de Pragas. Brasília: MAPA. Disponível em: https://www.gov.br/agricultura/pt-br/assuntos/sanidade-animal-e-vegetal/sanidade-vegetal/analise-de-riscos-de-pragas. Acesso em: 13 maio 2025.
ENGL. Definition of minimum performance requirements for analytical methods of GMO testing. European Network of GMO Laboratories Steering Committee, in collaboration with the ENGL Working Group Validation. Versão atual. Disponível em: <link>. Acesso em: 15 ago. 2025.
EPPO. European and Mediterranean Plant Protection Organization. PM 7 – Diagnostic Protocols for Regulated Pests. Paris: EPPO. Disponível em: https://gd.eppo.int/standards/PM7/. Acesso em: 13 maio 2025.
FAO. Food and Agriculture Organization of the United Nations. ISPM 27: Diagnostic protocols for regulated pests. Rome: IPPC, 2023. Disponível em: https://www.ippc.int/en/core-activities/standards-setting/diagnostic-protocols/. Acesso em: 13 maio 2025.
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. ISO/IEC 17025:2017 – General requirements for the competence of testing and calibration laboratories. Geneva: ISO, 2017.
As sugestões para aprimoramento ou possíveis correções deste documento devem ser direcionadas ao Departamento responsável, para alinhamento das melhores práticas de mercado, legislação vigente e/ou regulamentações, que não tenham sido contempladas na versão vigente.
| Versão | Conteúdo alterado | Data | Motivo |
|---|---|---|---|
| 1 | - | 25.08.2025 | Elaboração do documento |
Para a obtenção do escopo por classe de praga, o laboratório deverá indicar, no mínimo, dois métodos distintos para cada praga, preferencialmente fundamentados em princípios biológicos diferentes ou, na ausência destes, direcionados a regiões genômicas distintas. Esses métodos devem possibilitar a identificação das espécies relacionadas à respectiva classe, abrangendo as pragas constantes nas listas oficiais publicadas no site do MAPA, que incluem: pragas quarentenárias ausentes, pragas com potencial quarentenário, pragas quarentenárias presentes e pragas não quarentenárias regulamentadas.
Sempre que houver atualização das listas oficiais, caberá ao laboratório revisar os procedimentos e a lista de materiais de referência, submetendo-os à CGAL para avaliação e aprovação, sem que seja necessária a atualização do escopo.
Exemplos de escopo por classe:
Exemplos de escopo por espécie:
Exemplos: